Estabelecimento de um Modelo de Fratura Diafisária do Fêmur em Camundongos

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para o estabelecimento de uma fratura diafisária no fêmur de camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular, para estudos de consolidação da fratura.

Resumo

Os ossos têm uma capacidade regenerativa significativa. No entanto, a consolidação da fratura é um processo complexo e, dependendo da gravidade das lesões e da idade e estado geral de saúde do paciente, falhas podem ocorrer, levando ao retardo da consolidação ou não união. Devido ao crescente número de fraturas resultantes do trauma de alta energia e do envelhecimento, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar o reparo ósseo baseado na combinação de células-tronco esqueléticas/mesenquimais/estromas e biomateriais biomiméticos é urgentemente necessário. Para tanto, o uso de modelos animais confiáveis é fundamental para o melhor entendimento dos principais mecanismos celulares e moleculares que determinam os desfechos da cicatrização. De todos os modelos, o camundongo é o modelo de pesquisa preferido porque oferece uma grande variedade de cepas transgênicas e reagentes para análise experimental. No entanto, o estabelecimento de fraturas em camundongos pode ser tecnicamente desafiador devido ao seu pequeno tamanho. Portanto, este artigo tem como objetivo demonstrar os procedimentos para o estabelecimento cirúrgico de uma fratura de fêmur diafisária em camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular e se assemelha ao processo de reparo ósseo mais comum, através da formação de calo cartilaginoso.

Introdução

O esqueleto é um órgão vital e funcionalmente versátil. Os ossos do esqueleto possibilitam a postura e o movimento corporal, protegem os órgãos internos, produzem hormônios que integram as respostas fisiológicas e são o local de hematopoese e armazenamento de minerais¹. Se fraturados, os ossos têm uma notável capacidade de se regenerar e restaurar totalmente sua forma e função pré-lesão. O processo cicatricial inicia-se com a formação de um hematoma e uma resposta inflamatória, que induz a ativação e condensação de células-tronco esqueléticas/progenitoras do periósteo, endósteo e medula óssea e sua posterior diferenciação para formar o calo cartilaginoso mole. A ponte das extremidades fraturadas ocorre, então, por um processo que se assemelha à formação óssea endocondral, na qual o arcabouço cartilaginoso se expande e depois mineraliza, formando o calo ósseo duro. Finalmente, o calo duro é gradualmente remodelado por osteoclastos e osteoblastos para restaurar a estrutura óssea^original2,3.

Embora o processo de consolidação da fratura seja bastante robusto, envolve um intrincado somatório de eventos e é significativamente influenciado por vários fatores individuais, incluindo o estado geral de saúde, idade e sexo do paciente, bem como fatores de lesão, como o modo de estabilização mecânica do osso fraturado, a ocorrência de infecção e a gravidade da lesão de tecidos moles circundante^{4, 5.6}. Portanto, falhas são comuns, levando ao desenvolvimento da pseudoartrose, o que impacta sobremaneira a reabilitação e a qualidade de vida dos^pacientes7,8. Devido ao crescente número de fraturas como resultado do trauma de alta energia e do envelhecimento, bem como aos altos custos dos tratamentos, as fraturas de pseudoartrose tornaram-se um fardo para os sistemas de saúde em todo o^mundo9,10. Essa carga crescente destaca a necessidade urgente de estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar o reparo^ósseo11,12 baseadas na combinação de células-tronco esqueléticas/mesenquimais/estromas e biomateriais biomiméticos13,14.

Em busca desse objetivo, modelos animais têm sido amplamente utilizados em estudos visando compreender a biologia fundamental dos mecanismos de consolidação de fraturas e em estudos pré-clínicos de prova de conceito com o objetivo de elaborar novas estratégias terapêuticas para promover o reparo ósseo15,16,17. Modelos de pequenos animais, como o camundongo, são excelentes para estudos de consolidação de fraturas devido à ampla disponibilidade de cepas e reagentes geneticamente modificados para análises experimentais e seus baixos custos de manutenção. Além disso, os camundongos apresentam um rápido curso de cicatrização, o que permite a análise temporal de todas as etapas do processo de reparo¹⁵. Entretanto, o pequeno tamanho do animal pode representar desafios para a produção cirúrgica de fraturas com modos de fixação semelhantes aos aplicados em humanos. Este protocolo descreve um modelo simples e de baixo custo de consolidação de fraturas em camundongos utilizando osteotomia femoral aberta estabilizada com fio intramedular, que se assemelha ao processo de reparo ósseo mais comum, através da formação de calo cartilaginoso, e pode ser utilizado tanto em investigações básicas quanto translacionais em que o acesso ao local da fratura é necessário.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Protocolo nº 101/21). Camundongos Balb/c machos com 10-12 semanas de idade (25-30 g de peso corporal) foram usados neste estudo. O procedimento cirúrgico leva aproximadamente 15-20 min por rato. Antes de cada procedimento, os instrumentais necessários (listados na Tabela de Materiais) devem ser organizados sobre um campo cirúrgico estéril cobrindo a mesa cirúrgica (Figura 1A). Os instrumentos cirúrgicos metálicos devem ser autoclavados em envelopes autoselantes a 123 °C por 30 min. Itens descartáveis, como agulhas e compressas de gaze, devem ser adquiridos estéreis.

1. Preparo dos animais

1. Anestesiar o camundongo e realizar analgesia de acordo com o regime veterinário recomendado pelo programa institucional de cuidados e uso de animais.
   NOTA: Se disponível, a anestesia inalatória deve ser realizada preferencialmente. A descrição do protocolo de anestesia inalatória encontra-se no relato de Ewald et ^al.18. No entanto, se a fratura for produzida para estudos osteoimunológicos, esse tipo de anestesia deve ser evitado, pois evidências mostram que vários anestésicos voláteis, incluindo o isoflurano, afetam a atividade tanto das células imunes inatas quanto adaptativas^19,20.
2. Quando o rato estiver imóvel, raspe a perna esquerda e, em seguida, transfira-a para a mesa cirúrgica numa almofada de aquecimento aquecida (ver Tabela de Materiais) a 37 °C coberta com um campo cirúrgico estéril.
3. Realizar lavagem antisséptica da área da incisão esfregando a pele com uma esponja de iodopovidona a 10%. A desinfecção deve começar ao longo da linha de incisão e se estender para fora em um padrão circular. Secar a área esfregada com compressas de gaze estéril, lavar com etanol 70% e secar novamente com gaze estéril. Repita este procedimento três vezes.
4. Posicionar o camundongo em decúbito lateral direito e imobilizar as patas com fita adesiva cirúrgica (Figura 1C).
5. Escorra o mouse para que apenas a região da incisão fique visível (Figura 1D).

2. Procedimento cirúrgico

1. Durante o procedimento cirúrgico, verifique constantemente se o rato está respirando e forneça colírios em seus olhos para evitar o ressecamento e evitar que o rato fique cego.
   NOTA: Todo o procedimento cirúrgico geralmente leva ~15-20 min quando realizado por um cirurgião treinado. Portanto, aplicar o colírio uma vez no início do procedimento deve ser suficiente. Se o procedimento começar a ficar mais longo, aplicações adicionais podem ser realizadas sempre que for identificado que os olhos estão começando a secar.
2. Antes de proceder à incisão, avalie a profundidade anestésica pinçando a cauda para verificar o reflexo de resposta à dor e inspecionando visualmente a frequência respiratória (contando o número de movimentos torácicos por minuto)²¹. Sob anestesia ideal, o camundongo não deve responder a um beliscão na cauda, e a taxa de respiração deve ser em torno de 55-65 ciclos/min²¹.
3. Realizar incisão parapatelar cutânea lateral de 1 cm com lâmina de bisturi (Figura 11, ver Tabela de Materiais), iniciando-se ao nível da tuberosidade tibial e estendendo-se até o nível da patela e depois, por igual distância, em direção ao fêmur distal (Figura 1E).
4. Com tesoura romba, dissecar a fáscia subcutânea ao redor da linha de incisão para expor a fáscia lata, o vasto lateral e os músculos bíceps femoral²².
5. Com a lâmina de bisturi número 11, realizar outra incisão na fáscia lata semelhante à realizada na pele, iniciando-se ao nível da tuberosidade tibial e percorrendo ao longo da aponeurose do bíceps femoral até o nível do fêmur distal, para abrir a cápsula articular e acessar a articulação do joelho (Figura 1F, G).
6. Realizar uma luxação medial da patela colocando a ponta de uma pinça reta de precisão serrilhada (ver Tabela de Materiais) sob ela e empurrando-a para o lado juntamente com os ligamentos patelar e quadríceps, expondo assim os côndilos do fêmur (Figura 1H).
7. Segurar o fêmur com uma ponta serrilhada tweezer, flexionar o joelho a 90° e perfurar manualmente o canal intramedular do fêmur através da fossa intercondilar com uma agulha hipodérmica 26G (Figura 1I, J).
8. Mantendo o joelho fletido a 90°, inserir um segmento de 1,0 cm de um fio de haste de aço inoxidável 0,016 pol (0,40 mm) (Figura 1K, inserção) (ver Tabela de Materiais) através da abertura para o canal medular do fêmur em direção ao grande trocanter (Figura 1K).
   OBS: Manter o joelho fletido a 90° é fundamental para a inserção adequada do fio no canal medular. Não fazê-lo resultará no extravasamento do fio para fora do osso e lesões de tecidos moles circundantes.
9. Ajustar a extremidade distal pré-dobrada do fio com uma pinça reta de ponta serrilhada para fixá-lo firmemente no côndilo lateral (Figura 1L). Além de fixar o fio no lugar, a extremidade dobrada facilitará a remoção post-mortem do fio.
10. Separar os músculos vasto lateral e bíceps femoral através de dissecção romba com pinça de ponta serrilhada para acessar a diáfise distal do fêmur (Figura 1M).
11. Inserir tesoura dissecante ao redor da diáfise do fêmur em um ângulo de aproximadamente 90° e, suavemente, realizar uma osteotomia cortical completa (Figura 1N).
    NOTA: Os fêmures dos ratos são facilmente cortados. Abster-se de aplicar força excessiva durante a osteotomia para evitar a flexão do fio intramedular e a cominuição extensa da fratura.
12. Reposicione os músculos e a patela empurrando a ponta de uma pinça reta de precisão serrilhada sobre a região do côndilo.
13. Fechar a fáscia muscular com sutura reabsorvível 6-0 e, em seguida, a pele com fio de náilon 6-0 (ver Tabela de Materiais), ambos de forma simples e interrompida (Figura 1O).
14. Transfira o mouse para uma gaiola limpa individual para recuperação. Uma vez acordado, o rato deve ser capaz de se mover livremente com suporte de peso irrestrito.
15. Nos dias seguintes após a cirurgia, realizar analgesia de acordo com o regime veterinário recomendado pelo programa institucional de cuidados e uso de animais.

3. Imagem por raios X

1. Anestesiar o rato conforme descrito no passo 1.1.
   NOTA: Se a radiografia for realizada logo após o procedimento cirúrgico e o mouse ainda estiver sob anestesia ideal (passo 2.2), não é necessário realizar esta etapa.
2. Para uma visão lateral limpa do fêmur fraturado, coloque o camundongo em decúbito dorsal e puxe levemente o membro posterior operado para o lado.
3. Imobilizar as patas com fita adesiva cirúrgica.
4. Realizar imagens radiográficas de acordo com o protocolo do equipamento disponível.
   OBS: Para este estudo, foi utilizado um gerador de raios X odontológico digital com os seguintes parâmetros: tensão de 70 kVp, corrente de 7 mA e tempo de exposição de 0,2 s.

4. Processamento histológico e coloração de H&E

1. Eutanásia dos camundongos com uma overdose intraperitoneal de anestésicos (consulte o regime recomendado para veterinários aprovado pelo programa institucional de cuidados e uso de animais). Após verificar a profundidade da anestesia com uma pinça na cauda, realizar a luxação cervical. Em seguida, coletar o osso fraturado, remover o excesso de tecido muscular circundante²³ e fixar o osso em solução tamponada de formalina a 10% (pH 7,4) por 3 dias.
2. Colocar as amostras ósseas em histológicas marcadas (ver Tabela de Materiais) e mergulhá-las em EDTA a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, por 14 dias para descalcificação. Troque a solução de descalcificação duas vezes por semana.
3. Desidratar as amostras em uma série de soluções de concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) por 1 h cada.
4. Limpar as amostras em dois banhos sequenciais de xileno por 30 min cada.
5. Para infiltração de cera, imergir as amostras em dois banhos sequenciais de parafina a 60 °C por 30 min. Em seguida, incorpore as amostras em blocos para a secção²⁴.
   OBS: Para melhor visualização do calo, incorpore o osso com seu longo eixo na posição horizontal para permitir cortes longitudinais.
6. Cortar o tecido em secções de 4 μm de espessura com um micrótomo (ver Tabela de Materiais).
7. Flutuar as secções num banho-maria a 56 °C e montar as secções em lâminas histológicas (ver Tabela de Materiais).
8. Para a coloração H&E, desparafinizar as lâminas em três banhos sequenciais de xileno por 5 min e reidratar o tecido em uma série de soluções de concentrações decrescentes de etanol (95%, 80% e 70%) por 5 min.
9. Enxaguar as lâminas em água corrente por 30 s, corar as lâminas com hematoxilina de Harris (ver Tabela de Materiais) por 6 min e enxaguar em água da torneira por mais 30 s.
10. Imergir as lâminas em ácido clorídrico a 1% em etanol por 30 s e depois em etanol 70% por 30 s.
11. Manchar com eosina (ver Tabela de Materiais) por 2 min, e lavar com água da torneira por 30 s.
12. Desidratar as lâminas com etanol (70%, 80% e 95% por 5 min) e esclarecer com dois banhos de xileno por 5 min cada.
13. Para montagem, pinge uma a duas gotas de meio de montagem (consulte Tabela de Materiais) em cada lâmina e cubra a lâmina com uma tampa limpa.

Resultados

A maneira mais simples e imediata de avaliar o sucesso do procedimento cirúrgico na produção da fratura é a radiografia. As radiografias podem ser realizadas imediatamente após a cirurgia, com o camundongo ainda sob anestesia, e posteriormente 7 dias, 14 dias e 21 dias após a fratura para avaliar a formação e progressão do calo. Os padrões de fratura aceitáveis são aqueles em que os córtices estão totalmente rompidos, os fios estão corretamente colocados dentro do canal medular e as linhas de fratura são ...

Discussão

À medida que o número de fraturas aumenta em todo o mundo9,10,25, tratamentos inovadores para a pseudoartrose estão se tornando cada vez mais urgentes. Como a consolidação de fraturas envolve uma soma complexa e fortemente orquestrada de eventos que ocorrem em uma longa escala de^tempo3, o uso de modelos animais válidos é fundamental para melhorar nossa compreensão dos mecanismos que determinam o s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability