ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.

Abstract

לעצמות יש יכולת התחדשות משמעותית. עם זאת, ריפוי שברים הוא תהליך מורכב, ובהתאם לחומרת הנגעים ולגיל ולמצב הבריאותי הכללי של המטופל, עלולים להתרחש כשלים, המובילים לאיחוד מאוחר או לאי-איחוד. בשל המספר ההולך וגדל של שברים הנובעים מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, יש צורך דחוף בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים. לשם כך, השימוש במודלים אמינים של בעלי חיים הוא חיוני להבנה טובה יותר של המנגנונים התאיים והמולקולריים העיקריים הקובעים את תוצאות הריפוי. מכל הדגמים, העכבר הוא מודל המחקר המועדף מכיוון שהוא מציע מגוון רחב של זנים וריאגנטים טרנסגניים לניתוח ניסיוני. עם זאת, הקמת שברים בעכברים עשויה להיות מאתגרת מבחינה טכנית בשל גודלם הקטן. לכן, מאמר זה נועד להדגים את ההליכים להקמה כירורגית של שבר עצם הירך הדיאפיזיאלי בעכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי ודומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות.

Introduction

השלד הוא איבר חיוני ורב-תכליתי מבחינה תפקודית. עצמות השלד מאפשרות יציבה ותנועה של הגוף, מגינות על האיברים הפנימיים, מייצרות הורמונים המשלבים תגובות פיזיולוגיות, והן אתר של המטופויזה ואחסון מינרלים¹. אם נשברים, לעצמות יש יכולת יוצאת דופן להתחדש ולשחזר באופן מלא את צורתן ותפקודן לפני הפציעה. תהליך הריפוי מתחיל בהיווצרות המטומה ותגובה דלקתית, הגורמת להפעלה ועיבוי של תאי גזע/אב שלדיים מהפריאוסטאום, האנדוסטאום ומח העצם והתמיינותם לאחר מכן ליצירת היבלת הסחוסית הרכה. הגישור בין הקצוות השבורים מתרחש בתהליך הדומה להיווצרות עצם אנדוכונדרלית, שבו הפיגום הסחוסי מתרחב ולאחר מכן עובר מינרליזציה, ויוצר את היבלת האוסאוסית הקשה. לבסוף, היבלת הקשה משופצת בהדרגה על ידי אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים כדי לשחזר את מבנה העצם המקורי ^2,3.

למרות שתהליך ריפוי השבר הוא חזק למדי, הוא כרוך בסיכום מורכב של אירועים ומושפע באופן משמעותי ממספר גורמים בודדים, כולל מצבו הבריאותי הכללי, גילו ומינו של המטופל, כמו גם גורמי פציעה, כגון אופן הייצוב המכני של העצם השבורה, התרחשות הזיהום וחומרת הפגיעה ברקמות הרכות שמסביב^{4, 5,6}. לכן, כשלים הם נפוצים, מה שמוביל להתפתחות של אי-איחוד, מה שמשפיע מאוד על שיקום המטופל ואיכות החיים שלו ^7,8. בשל המספר ההולך וגדל של שברים כתוצאה מטראומה והזדקנות באנרגיה גבוהה, כמו גם העלויות הגבוהות של הטיפולים, שברים שאינם מאוגדים הפכו לנטל על מערכות הבריאות ברחבי העולם ^9,10. עומס הולך וגובר זה מדגיש את הצורך הדחוף באסטרטגיות טיפוליות חדשניות לשיפור תיקון העצם^11,12 המבוססות על שילוב של תאי גזע שלד/מזנכימליים/סטרומה וביו-חומרים ביומימטיים^13,14.

במטרה להשיג מטרה זו, נעשה שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים במחקרים שמטרתם להבין את הביולוגיה הבסיסית של מנגנוני ריפוי שברים ובמחקרים פרה-קליניים להוכחת היתכנות שמטרתם לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקידום תיקון עצם 15,16,17. מודלים של בעלי חיים קטנים, כמו העכבר, מצוינים למחקרי ריפוי שברים בגלל הזמינות הרחבה של זנים וריאגנטים מהונדסים גנטית לניתוחים ניסיוניים ועלויות התחזוקה הנמוכות שלהם. בנוסף, לעכברים יש מסלול זמן ריפוי מהיר, המאפשר ניתוח זמני של כל שלבי תהליך התיקון¹⁵. עם זאת, גודלו הקטן של בעל החיים יכול להציב אתגרים לייצור כירורגי של שברים עם מצבי קיבוע דומים לאלה המיושמים בבני אדם. פרוטוקול זה מתאר מודל פשוט וזול של ריפוי שברים בעכברים באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה של עצם הירך המיוצבת באמצעות חוט תוך מדולרי, הדומה לתהליך תיקון העצם הנפוץ ביותר, באמצעות היווצרות יבלות סחוסיות, וניתן להשתמש בו הן בחקירות בסיסיות והן בחקירות תרגומיות בהן נדרשת גישה לאתר השבר.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו (פרוטוקול מספר 101/21). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי Balb/c זכרים בגיל 10-12 שבועות (25-30 גרם משקל גוף). ההליך הכירורגי אורך כ 15-20 דקות לכל עכבר. לפני כל הליך, המכשירים הנדרשים (המפורטים בטבלת החומרים) חייבים להיות מאורגנים על פני שדה כירורגי סטרילי המכסה את שולחן הניתוחים (איור 1A). כלי הניתוח המתכתיים חייבים להיות אוטומטיים במעטפות אטימה עצמית ב 123 ° C למשך 30 דקות. פריטים חד פעמיים, כגון מחטים ופדים גזה, חייבים להיות נרכשים סטריליים.

1. הכנת בעלי חיים

1. מרדימים את העכבר ומבצעים שיכוך כאבים בהתאם למשטר המומלץ על ידי הווטרינריה המאושר על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
   הערה: אם זמין, עדיף לבצע הרדמה בשאיפה. תיאור של פרוטוקול הרדמה באינהלציה ניתן למצוא בדו"ח של Ewald et ^al.18. עם זאת, אם השבר מיוצר עבור מחקרים אוסטאימונולוגיה, סוג זה של הרדמה חייב להימנע, כמו ראיות מראות כי כמה חומרי הרדמה נדיפים, כולל isoflurane, משפיעים על הפעילות של תאים חיסוניים מולדים ונרכשים^19,20.
2. ברגע שהעכבר אינו נייד, יש לגלח את רגל שמאל ולאחר מכן להעביר אותה לשולחן הניתוחים על כרית חימום חמה (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C המכוסה במדרס כירורגי סטרילי.
3. בצע שטיפה חיטוי של אזור החתך על ידי שפשוף העור עם ספוג 10% פובידון-יוד. החיטוי צריך להתחיל לאורך קו החתך ולהאריך כלפי חוץ בתבנית מעגלית. יבש את האזור שפשף עם רפידות גזה סטריליות, לשטוף עם 70% אתנול, ולייבש שוב עם פד גזה סטרילי. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
4. הניחו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צדדית ימנית, ושתקו את כפות הרגליים בעזרת סרט ניתוח (איור 1C).
5. עטפו את העכבר כך שרק אזור החתך יהיה גלוי לעין (איור 1D).

2. הליך כירורגי

1. במהלך ההליך הכירורגי, בדקו כל הזמן שהעכבר נושם וספקו טיפות עיניים בעיניו כדי למנוע יובש ולמנוע מהעכבר להתעוור.
   הערה: ההליך הכירורגי כולו אורך בדרך כלל ~ 15-20 דקות כאשר הוא מבוצע על ידי מנתח מיומן. לכן, החלת טיפות העיניים פעם אחת בתחילת ההליך צריך להספיק. אם ההליך מתחיל להיות ארוך יותר, יישומים נוספים ניתן לבצע בכל פעם שהוא מזוהה כי העיניים מתחילות להתייבש.
2. לפני שתמשיך לחתך, הערך את עומק ההרדמה על ידי צביטת הזנב כדי לבדוק את רפלקס תגובת הכאב ובדיקה חזותית של קצב הנשימה (ספירת מספר תנועות החזה לדקה)²¹. בהרדמה אופטימלית, העכבר לא אמור להגיב לצביטת זנב, וקצב הנשימה חייב להיות סביב 55-65 נשימות לדקה²¹.
3. בצעו חתך פרפטלרי עורי רוחבי בקוטר 1 ס"מ עם להב אזמל (מספר 11, ראו טבלת חומרים), החל מרמת הטוברוזיה הטיביאלית ונמשך עד לגובה הפטלה ולאחר מכן, למרחק שווה, לכיוון עצם הירך הדיסטלית (איור 1E).
4. בעזרת מספריים קהות, מנתחים את הפאשיה התת עורית סביב קו החתך כדי לחשוף את הפאשיה לטה, את הווסטוס הצידי ואת שרירי שרירי שרירי הירך²².
5. עם להב אזמל מספר 11, בצעו חתך נוסף בפאשיה לאטה דומה לזה שנעשה בעור, החל מרמת הטוברוזיות הטיביאלית ורץ לאורך שריר הירך הדו-ראשי עד לרמת עצם הירך הדיסטלית, כדי לפתוח את הקפסולה המפרקית ולגשת למפרק הברך (איור 1F, G).
6. בצעו לוקסציה מדיאלית של הפטלה על-ידי הנחת קצה של פינצטה משוננת ישרה ומדויקת (ראו טבלת חומרים) מתחתיה ודחיפתה הצידה יחד עם רצועות הפטלר והארבע ראשי, ובכך חשפו את הקונדילים של עצם הירך (איור 1H).
7. החזקת עצם הירך עם טוויזר קצה משונן, כופפו את הברך ב-90°, ונקבו ידנית את התעלה התוך-מדולרית של עצם הירך דרך הפוסה הבין-קונדילרית עם מחט היפודרמית 26G (איור 1I, J).
8. כדי לשמור על כיפוף הברך ב-90°, הכנס קטע של 1.0 ס"מ של מוט נירוסטה בקוטר 0.016 אינץ' (0.40 מ"מ) (איור 1K, הוספה) (ראה טבלת חומרים) דרך הפתח לתוך התעלה המדולרית של עצם הירך לכיוון הטרוכנטר הגדול (איור 1K).
   הערה: שמירה על כיפוף הברך ב-90° חיונית להחדרה נכונה של החוט לתעלה המדולרית. אם לא תעשה זאת, התוצאה תהיה אקסטרווציה של החוט מתוך העצם ונגעים סביב רקמות רכות.
9. התאימו את הגפיים הדיסטליות הטרום-כפופות של החוט בעזרת פינצטה משוננת ישרה כדי לקבע אותה היטב בקונדיל הצידי (איור 1L). בנוסף לקיבוע החוט במקומו, הגפיים הכפופות יקלו על הסרת החוט לאחר המוות.
10. הפרידו את שרירי הווסטוס הצידי ואת שרירי שרירי הירך באמצעות דיסקציה קהה באמצעות פינצטה משוננת כדי לגשת לדיאפיזה הדיסטלית של עצם הירך (איור 1M).
11. הכניסו מספריים מנתחים סביב דיאפיזה של עצם הירך בזווית של כ-90°, ובצעו בעדינות אוסטאוטומיה מלאה של קליפת המוח (איור 1N).
    הערה: עצם הירך של עכברים נחתכת בקלות. הימנעו מהפעלת כוח מופרז במהלך אוסטאוטומיה כדי למנוע כיפוף של החוט התוך מדולרי והצטברות שבר נרחבת.
12. מקמו מחדש את השרירים ואת הפטלה על ידי דחיפת קצה פינצטה ישרה ומדויקת על אזור הקונדיל.
13. סגרו את הפאשיה השרירית עם תפר 6-0 הניתן לספיגה ולאחר מכן את העור באמצעות תפר ניילון 6-0 (ראו טבלת חומרים), שניהם בצורה קטועה פשוטה (איור 1O).
14. העבר את העכבר לכלוב נקי אישי להתאוששות. ברגע שהוא מתעורר, העכבר חייב להיות מסוגל לנוע בחופשיות עם נשיאת משקל בלתי מוגבלת.
15. בימים שלאחר הניתוח, יש לבצע שיכוך כאבים בהתאם למשטר המומלץ על ידי הווטרינריה שאושר על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

3. הדמיית רנטגן

1. מרדים את העכבר כמתואר בשלב 1.1.
   הערה: אם הרדיוגרפיה מבוצעת מיד לאחר ההליך הכירורגי והעכבר עדיין נמצא תחת הרדמה אופטימלית (שלב 2.2), אין צורך לבצע שלב זה.
2. לקבלת מבט צדדי נקי על עצם הירך השבורה, הניחו את העכבר במצב דקוביטוס גבי, ומשכו מעט את הגפה האחורית המנותחת הצידה.
3. לשתק את הכפות עם סרט כירורגי.
4. ביצוע הדמיה רדיוגרפית בהתאם לפרוטוקול הציוד הזמין.
   הערה: במחקר זה נעשה שימוש בגנרטור רנטגן דנטלי דיגיטלי עם הפרמטרים הבאים: מתח של 70 kVp, זרם של 7 mA וזמן חשיפה של 0.2 שניות.

4. עיבוד היסטולוגיה וצביעת H&E

1. הרדימו את העכברים במנת יתר תוך צפקית של חומרי הרדמה (אנא עיינו במשטר המומלץ על ידי הווטרינריה שאושר על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים). לאחר בדיקת עומק ההרדמה עם צביטת זנב, בצע נקע צוואר הרחם. לאחר מכן, לאסוף את העצם השבורה, להסיר עודף רקמת שריר סביב²³, ולתקן את העצם בתמיסת פורמלין 10% חוצץ (pH 7.4) במשך 3 ימים.
2. הניחו את דגימות העצם בקלטות היסטולוגיה מסומנות (ראו טבלת חומרים), וטבלו אותן ב-10% EDTA במי מלח חוצצי פוספט (PBS), pH 7.4, למשך 14 יום לצורך הסתיידות. החליפו את תמיסת ההסתיידות פעמיים בשבוע.
3. יש לייבש את הדגימות בסדרה של תמיסות של הגדלת ריכוזי אתנול (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) למשך שעה כל אחת.
4. נקה את הדגימות בשתי אמבטיות עוקבות של קסילן למשך 30 דקות כל אחת.
5. לחדירת שעווה, יש לטבול את הדגימות בשתי אמבטיות פרפין רציפות בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות. לאחר מכן, להטביע את הדגימות לתוך בלוקים עבור חתך²⁴.
   הערה: כדי לראות טוב יותר את היבלת, הטמע את העצם עם הציר הארוך שלה במצב אופקי כדי לאפשר חתכים אורכיים.
6. חתכו את הרקמה למקטעים בעובי 4 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום (ראו טבלת חומרים).
7. צפו את הקטעים באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס, והרכיבו את הקטעים על שקופיות היסטולוגיות (ראו טבלת חומרים).
8. עבור צביעת H&E, יש לפרק את המגלשות בשלוש אמבטיות עוקבות של קסילן למשך 5 דקות, ולהחזיר לחות לרקמה בסדרה של תמיסות של הפחתת ריכוזי אתנול (95%, 80% ו-70%) למשך 5 דקות.
9. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 30 שניות, הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין האריס (ראו טבלת חומרים) למשך 6 דקות, ושטפו אותן במי ברז למשך 30 שניות נוספות.
10. לטבול את שקופיות 1% חומצה הידרוכלורית אתנול במשך 30 s ולאחר מכן 70% אתנול במשך 30 s.
11. יש לצבוע עם אאוסין (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות, ולשטוף במי ברז למשך 30 שניות.
12. יש לייבש את המגלשות באתנול (70%, 80% ו-95% למשך 5 דקות), ולהבהיר עם שתי אמבטיות קסילן למשך 5 דקות כל אחת.
13. לצורך הרכבה, טפטפו טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) על כל שקופית, וכסו את השקופית בכיסוי נקי.

תוצאות

הדרך הפשוטה והמיידית ביותר להעריך את הצלחת ההליך הכירורגי בהפקת השבר היא הדמיית רנטגן. ניתן לבצע צילומי רנטגן מיד לאחר הניתוח, כאשר העכבר עדיין תחת הרדמה, ולאחר מכן 7 ימים, 14 ימים ו -21 ימים לאחר השבר כדי להעריך את היווצרות היבלות והתקדמותן. דפוסי שבר מקובלים הם אלה שבהם קליפת המוח נקרעת במלו?...

Discussion

ככל שמספר השברים גדל ברחבי העולם ^9,10,25, טיפולים חדשניים לאי-איחוד הופכים דחופים יותר ויותר. מכיוון שריפוי שברים כרוך בסיכום מורכב ומתוזמר היטב של אירועים המתרחשים על פני סקאלת זמן ארוכה³, השימוש במודלים תקפים של בעלי חיים הוא ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 70º	Merck	109-56-8	Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium)	Merck	C1795	Or any general available supplier
Cefazoline	ABL	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip	Merck	CSL284525	Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator	Focus	-	Sold by Instrumentarium Dental Inc.
DEPC water	Merck	W4502	Or any general available supplier
Dissecting Scissor	ABC Instrumentos	0327	Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA	Vetec	60REAVET014340	Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution	Laborclin	EA-65	Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A	Vetec	60REAVET012053	Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads	Cremer	Not applicable	Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution	Laborclin	620503	Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad	Tonkey Electrical Technology	E114273	Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides	Merck	CSL294875X25	Or any general available supplier
Histology cassettes	Merck	H0542-1CS	Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37%	Merck	258148	Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe	BD	324918	Or any general available supplier
Iodopovidone sponge	Rioquímica	372106	Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium	Cristalia	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome	Leica	149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer	ABC Instrumentos	0164	Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G	BD	2239	Or any general available supplier
Needle Holder	Golgran	135-18	Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1546-NT	Or any general available supplier
Paraffin	Exodo	8002 - 74 - 2	Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4	Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x	Lonza	BE17-516F	Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6	Atramat	C1596-45B	Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016"	Orthometric	56.50.2016
Scalpel nº 11	Descarpak	15782	Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer	Quinelato	QC.404.12	Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver	Phillips	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape	3M	2734	Or any general available supplier
Surgical tnt field	Polarfix	6153	Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride	Teuto	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology	Leica	HI1210
Xylazine hydrochloride	Ceva	Not applicable	Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene	Dinamica	60READIN001105	Similar brands of the item may be used according to local availability