نموذج غشاء المشيمية المشيمية (CAM) كأداة لدراسة زراعة أنسجة المبيض

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لتطوير نموذج تطعيم الأغشية المشيمية (CAM) لأنسجة المبيض البشرية ونوضح فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة التوعي بالكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

Abstract

يعد حفظ أنسجة المبيض بالتبريد وزرعها استراتيجية فعالة للحفاظ على الخصوبة ولكن لها عيبا رئيسيا واحدا ، وهو فقدان البصيلات الهائل الذي يحدث بعد فترة وجيزة من إعادة الزرع بسبب تنشيط الجريب غير الطبيعي والموت. القوارض هي نماذج مرجعية للتحقيق في تنشيط الجريب ، لكن التكلفة والوقت والاعتبارات الأخلاقية أصبحت باهظة بشكل متزايد ، مما يدفع إلى تطوير البدائل. يعد نموذج الغشاء المشيمي المشيمي (CAM) جذابا بشكل خاص ، كونه غير مكلف ويحافظ على نقص المناعة الطبيعي حتى اليوم 17 بعد الإخصاب ، مما يجعله مثاليا لدراسة التطعيم الأجنبي قصير المدى لأنسجة المبيض البشري. كما أن الطب التكميلي والبديل شديد الأوعية الدموية وقد استخدم على نطاق واسع كنموذج لاستكشاف تكوين الأوعية. وهذا يمنحها ميزة ملحوظة على النماذج في المختبر ويسمح بالتحقيق في الآليات التي تؤثر على عملية فقدان الجريب المبكرة بعد التطعيم. يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم بالأشعة السينية للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري ، مع رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة عبر فترة تطعيم مدتها 6 أيام.

Introduction

ازداد الطلب على الحفاظ على الخصوبة لمؤشرات الأورام والحميدة ، وكذلك الأسباب الاجتماعية ، بشكل كبير خلال العقود الأخيرة. ومع ذلك ، فإن العلاجات المختلفة المستخدمة لعلاج الأمراض الخبيثة وغير الخبيثة شديدة السمية للغدد التناسلية ويمكن أن تؤدي إلى قصور المبيض المبكر علاجي المنشأ ، مما يؤدي في النهاية إلى العقم¹. تشمل التقنيات الراسخة للحفاظ على الخصوبة حفظ الأجنة بالتبريد ، وتزجيج البويضات غير الناضجة أو الناضجة ، والحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض^2،3،4. تجميد أنسجة المبيض هو الخيار الوحيد المتاح للحفاظ على الخصوبة لدى الفتيات قبل سن البلوغ أو النساء اللائي يحتجن إلى علاج فوري للسرطان. تحدث استعادة وظيفة الغدد الصماء بعد زرع أنسجة المبيض في أكثر من 95٪ من الأشخاص ، مع معدلات ولادة حية تتراوح من 18٪ إلى 42٪ ^{5،6،7،8،9}.

على الرغم من أن زرع أنسجة المبيض المجمدة المذابة قد أثبت نجاحه ، لا يزال هناك مجال للتحسين. في الواقع ، عندما يتم زرع شظايا المبيض القشرية دون مفاغرة الأوعية الدموية ، فإنها تعاني من فترة نقص الأكسجة التي تحدث خلالها إعادة التوعي^{الكسب غير المشروع 10،11،12}. استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التي تبحث في زراعة أنسجة المبيض البشري نموذج التطعيم بالخارج ، حيث يتم زرع أنسجة المبيض للفئران التي تعاني من نقص المناعة. تستغرق إعادة التوعي الكاملة للطعوم الخارجية حوالي 10 أيام ، حيث تساهم كل من الأوعية المضيفة وأوعية الكسب غير المشروع في تكوين الأوعية الوظيفية^12،13،14. يتم فقدان حوالي 50٪ -90٪ من احتياطي الجريب خلال نافذة نقص الأكسجين هذه قبل الانتهاء من إعادة توعية الكسب غير المشروع^10،15،16. وقد اقترح بقوة أن هذا الفقدان الهائل للجريب يحدث من خلال كل من موت الجريب المباشر ، كما يتضح من انخفاض أعداد البصيلات المطلقة المتبقية بعد التطعيم ، وتنشيط نمو الجريب البدائي ، كما يتضح من التغيرات في نسب الجريب نحو زيادة معدلات نمو البصيلات^17,18.

ومن المثير للاهتمام ، أن الأعمال البحثية السابقة باستخدام أنسجة المبيض الحيوانية المختلفة المطعمة بغشاء المشيمية الذكورية (CAM) ، والتي لها دستور يحاكي موقع التطعيم النموذجي للبريتوني ، قد أبلغت عن تثبيط تنشيط الجريب التلقائي ، مع بقاء احتياطي الجريب البدائي سليما لمدة تصل إلى 10 أيام^{19،20،21،22}. أثبت فريقنا سابقا أن تطعيم أنسجة المبيض البشري المذابة المجمدة بالطب التكميلي والبديل يشكل نهجا موثوقا به للتحقيق في زراعة أنسجة المبيض البشري في مراحلها الإقفارية^{الأولى 23} وأظهر مؤخرا أن طريقة التطعيم هذه كانت قادرة على مواجهة تنشيط الجريب²⁴.

نموذج الطب التكميلي والبديل جذاب بشكل خاص ليس فقط لأن البيض أرخص بكثير من الفئران ولكن أيضا بسبب الطبيعة الوعائية للغاية للطب التكميلي والبديل ، مما يسمح بالتدقيق في العلاقة بين تنشيط الجريب وإعادة توعية طعم المبيض. يعد نظام الطيور ، في الواقع ، أحد أكثر الطرق شيوعا وتنوعا لدراسة تكوين الأوعية^{الدموية 25}. يستغرق تطور جنين الفرخ (ED) 21 يوما حتى الفقس ، ويتم تشكيل الطب التكميلي والبديل خلال أول 4-5 أيام من خلال اندماج الألانتوا والمشيمية²⁶. والجدير بالذكر أن جنين الفرخ هو مضيف يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي حتى اليوم 17 من الضعف الجنسي ، لذلك يمكن إجراء تجارب التطعيم بالأجانب دون أي خطر من رفض الكسب غير المشروع^27,28. علاوة على ذلك ، لا يثير نهج نموذج الطب التكميلي والبديل أي مخاوف أخلاقية أو قانونية فيما يتعلق بالقانون الأوروبي²⁹ ، مما يجعله بديلا جذابا للنماذج الحيوانية الأخرى. فيما يتعلق بظروف التكاثر ، تحتاج أجنة الكتاكيت فقط إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية مع رطوبة هواء نسبية تتراوح بين 40٪ و 60٪. تقلل متطلبات التجارب المحدودة هذه بشكل كبير من تكاليف البحث مقارنة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة.

يهدف البروتوكول المقدم هنا إلى وصف تطوير نموذج التطعيم الخارجي للطب التكميلي والبديل لأنسجة المبيض البشري وتقديم رؤى محددة حول فعالية التقنية ، والإطار الزمني لإعادة توعية الكسب غير المشروع ، وصلاحية الأنسجة على مدى فترة تطعيم مدتها 6 أيام. يمكن أن يكون هذا البروتوكول ذا أهمية كبيرة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء فقدان الجريب المبكر بعد التطعيم ودراسة تأثير العديد من العوامل (عوامل النمو ، الهرمونات ، إلخ) على هذه الظاهرة.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الأنسجة البشرية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في لوفان. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة على استخدام أنسجة المبيض لأغراض البحث.

1. طلب يوم 0 بويضات من المحتمل جدا أن تكون جنينية

1. ابحث عن مورد بيض Leghorn أبيض معتمد من Lohman تم اختياره في المختبر والذي يبلغ عن معدلات عالية من البيض الجنيني ، والذي يعتمد بشكل أساسي على عمر الكتاكيت.

2. تحضير البيض للحضانة

1. قبل وصول البيض ، قم بتجميع وموازنة حاضنة البيض إلى 37 درجة مئوية في رطوبة هواء نسبية 40٪ -60٪. راقب درجة الحرارة ورطوبة الهواء عن طريق إدخال مقياس حرارة ومقياس رطوبة في الحاضنة. تأكد من أن غطاء الحاضنة مزود بنافذة زجاجية للسماح بفحص المعلمات الداخلية للحاضنة دون الحاجة إلى فتحها (الشكل 1).
2. بعد استلام اليوم 0 بيضة من فراخ Leghorn البيضاء المختارة من Lohman من مورد بيض معتمد من الدرجة المختبرية ، قم بتنظيف سطح الأصداف بورق مرطب وتجفيفها على الفور.
   ملاحظة: نظرا لأن غشاء قشر البيض مسامي ، يمكن استخدام الماء المعقم لتنظيف أسطح البيض والتحكم في الرطوبة داخل الحاضنة لتقليل مخاطر التلوث.
3. قم بتسمية البيض باستخدام علامة (على سبيل المثال ، التاريخ ورقم البيضة).
4. احتضان البيض مع توجيه الطرف المدبب لأسفل ، وقم بتدويره للسماح ل CAM بالتطور. قم بتدوير البيض يدويا بمقدار 180 درجة مرتين إلى ثلاث مرات يوميا أو استخدم دوارا تلقائيا.
   ملاحظة: من أجل ضمان تدوير البيض بالفعل ، يمكن تمييز قشر البيض ب "X" و "O" على الجانبين الجانبيين المتعارضين باستخدام قلم رصاص أو علامة. تسمح النافذة الزجاجية الموجودة في غطاء الحاضنة بالتحقق من دوران البيض دون فتح الجهاز.

3. فتح قشر البيض في اليوم الثالث من الضعف الجنسي

ملاحظة: يتم عمل نافذة مستطيلة في قشر البيض في اليوم 3 من الضعف الجنسي.

1. تحضير غطاء التدفق الصفحي من أجل العمل في ظروف معقمة. ضع الأدوات التالية تحت الغطاء ، وقم بتطهيرها بنسبة 70٪ من الإيثانول (إن لم تكن معقمة بالفعل):
   - رف البيض
   - شمعة البيض أو مصدر الضوء البارد البؤري
   -علامه
   - دبوس مستقيم معقم
   - إبرة معقمة 19 جرام
   -5 مل حقنة معقمة
   - شفرة منشار التمرير
   -ملقط معقم
   -شريط لاصق
2. انقل بيضة واحدة من الحاضنة إلى رف البيض الموضوع تحت الغطاء ، وأوقف تشغيل دوار البيض.
3. في الظلام ، حدد الجيب الهوائي للبيضة عن طريق وضع شمعة البيض (أو مصدر الضوء البارد البؤري) مقابل قشر البيض. الجيب الهوائي موضعي في النهاية الحادة للبيضة. استخدم علامة لتحديد مركز الجيب الهوائي على قشر البيض.
4. أشعل الأضواء. اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض حيث يتم تمييزه بتدوير دبوس مستقيم معقم برفق. عادة ما تكون الفتحة الصغيرة التي يبلغ قطرها حوالي 1 مم كافية.
   ملاحظة: احرص على عدم دفع الدبوس بالكامل عبر البيضة. إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة.
5. قم بتوصيل إبرة معقمة 19 جم بحقنة معقمة سعة 5 مل.
6. في الظلام ، حدد موقع كيس الصفار باستخدام شمعة البيض (أو مصدر الضوء البارد البؤري) ، وثقب البيضة من خلال الفتحة المصنوعة في الخطوة 3.4 بإبرة معقمة 19 جم بزاوية 45 درجة باتجاه قاع البيضة ؛ احرص بشدة على عدم تعطيل كيس الصفار. نضح ما بين 1.5-2 مل من الزلال لفصل CAM عن القشرة ، ثم أغلق الفتحة بقطعة من الشريط اللاصق.
   ملاحظة: إذا تعطل كيس الصفار أثناء الشفط ، فسيكون السائل المستنشق في المحقنة أصفر اللون وليس شفافا (زلالي). إذا حدث هذا ، استبدل الإبرة والمحقنة. إذا تم امتصاص كمية كبيرة نسبيا من صفار البيض ، فقد يعرض ذلك صلاحية الجنين للخطر.
7. أشعل الأضواء. ضع البيضة أفقيا ، وارسم نافذة مستطيلة بقياس 1 سم × 1.5 سم بعلامة. لا تجعل النافذة أكبر من العرض المعتاد للشريط اللاصق القياسي.
8. امسك البيضة بيد واحدة ، وشاهد برفق النافذة المرسومة مسبقا في قشر البيض باستخدام شفرة منشار التمرير. تأكد من أن القشرة لا تتشقق ولا تقطع وصولا إلى CAM المكتئب. انفخ بانتظام لإزالة غبار القشرة والحطام.
9. حرك ملقط معقم تحت القطعة المستطيلة من القشرة المنشورة ، وأمسكها ببراعة لإزالتها بشكل نظيف دون إتلاف CAM. بالإضافة إلى ذلك ، تخلص من غشاء الغلاف الخارجي الأبيض لتتمكن من رؤية الجنين والطب التكميلي والبديل الخاص به.
   ملاحظة: إذا سقط بعض غبار قشر البيض أو الحطام على CAM ، فيمكن إزالته باستخدام ملقط معقم ، مع الحرص الشديد على عدم تمزيق CAM.
10. تحديد البويضات الجنينية القابلة للحياة. يمكن تمييزها من خلال زلالها الواضح والحلقة الوعائية حول الجنين ، حيث قد يتم اكتشاف قلب ينبض في بعض الأحيان حتى في هذه المرحلة (اليوم 3 من الضعف الجنسي). تخلص من الأجنة غير المخصبة أو الميتة.
11. ضع شريطا لاصقا فوق النافذة التي تم إنشاؤها حديثا لتجنب الجفاف. تأكد من طي أحد طرفيه على نفسه لسهولة الإزالة.
12. ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة مع توجيه النافذة المفتوحة لأعلى وعدم لمس الشريط للكاميرا CAM. استخدم قطعة مطوية من الورق أو جزءا من رف البيض لمنع البيضة من التدحرج. تأكد من إيقاف تشغيل الدرج الدوار.
13. كرر الخطوات 3.2-3.12 لفتح البيض المتبقي.

4. تطعيم أنسجة المبيض البشري المجمدة المذابة في الطب التكميلي والبديل

ملاحظة: يجب أن تبدأ عملية الزرع في الطب التكميلي والبديل بشكل مثالي بين الأيام 7-10 من الضعف الجنسي.

1. قم بإذابة شرائط المبيض القشرية المحفوظة بالتبريد تحت غطاء التدفق الصفحي باتباع البروتوكول الموصوف في مكان آخر³⁰.
2. قطع الشرائط القشرية إلى ثلاث أجزاء من 4 مم × 2 مم × 1 مم. استخدم قطعة واحدة كعنصر تحكم غير مطعمة والقطعتان الأخريان لتطعيم الأجانب لمدة 1 يوم أو 6 أيام.
   ملاحظة: في حالة توفر أنسجة كافية ، اعمل في نسختين.
3. انقل بيضة واحدة من الحاضنة إلى رف البيض الموجود أسفل الغطاء ، مع توجيه النافذة لأعلى.
4. قشر الشريط من النافذة ، وتأكد من أن الجنين قابل للحياة. في هذه المرحلة ، تتميز الأجنة القابلة للحياة بأوعية وعائية واسعة النطاق ، وزلال واضح ، ونبضات قلب مرئية ، وبعض حركة الجنين.
5. قم بإعداد موقع التطعيم عن طريق صدمة منطقة صغيرة من الطب التكميلي والبديل برفق عن طريق وضع شريط 1 سم² من ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على السطح الظهاري وإزالته على الفور.
   ملاحظة: التكميلي والبديل هو حاجز لا يمكن اختراقه ما لم يكن الغشاء قد تعرض لصدمة بسبب إزالة الجزء العلوي حول الجلد من الطبقة الظهارية المزدوجة ، تاركا الطبقة القاعدية سليمة. تعمل هذه التقنية أيضا على تعزيز عملية إعادة التوعي عن طريق تنشيط التئام الجروح. إذا بقي ورق العدسة المعقم المستخرج من الأثير على CAM لفترة طويلة جدا ، فقد يلتصق الغشاء بورق العدسة ويتمزق. إذا حدث هذا ، تخلص من البيضة.
6. أمسك شريطا قشريا مبيض مجمدا مذاب (4 مم × 2 مم × 1 مم) باستخدام ملقط جراحي مجهري ، وضعه على الطب التكميلي والبديل المصاب بالصدمة مع الجانب النخاعي ضد CAM. تطعيم قطعة مناديل واحدة لكل بيضة.
7. غطي النافذة بشريط لاصق ، وأعد البويضة بعناية إلى الحاضنة. تأكد من أن فتحة قشر البيض في وضع مستقيم وأن البيضة آمنة.
8. كرر الخطوات 4.1-4.7 لتطعيم جميع الأنسجة المتبقية.
   ملاحظة: يجب فحص الغرسات في كل يوم تطعيم لتقييم صلاحية الجنين ومراقبة التغيرات في الأوعية الدموية.

5. حصاد الطعوم

ملاحظة: يجب حصاد الطعوم الخارجية على أبعد تقدير بحلول اليوم 17 من الضعف الجنسي ، حيث يصبح الجهاز المناعي للجنين ناضجا ومختصا من اليوم 18.

1. ضع البيضة على رف ، وقم بتكبير النافذة في قشر البيض للسماح بتصور أفضل للكسب غير المشروع والتلاعب بسهولة.
2. تقييم الكسب غير المشروع مجهريا ، وإيلاء اهتمام خاص لرد فعل الأوعية الدموية من CAM تجاه الكسب غير المشروع. التقط صورا رقمية أو مقاطع فيديو للتسجيل.
3. أمسك الأنسجة أو الطب التكميلي والبديل المحيط بالملقط ، واستخدم مقصا أو مشرطا لاستئصال الكسب غير المشروع من الطب التكميلي والبديل بعناية.
   ملاحظة: تصبح الطعوم مغطاة بطبقة ثانية من الطب التكميلي والبديل في حوالي اليوم 3 من التطعيم وتصبح مغلفة في النهاية. ربما تكون قد انتقلت أيضا داخل البويضة بحلول اليوم 6 ، مما يجعل من الصعب استعادتها في بعض الحالات.
4. تحليل الأنسجة المستأصلة بأي طريقة مناسبة للتجربة المحددة. في هذه الدراسة ، تم تثبيت قطع الأنسجة في بارافورمالدهيد ، مغروس بالبارافين وملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين باتباع الخطوات الموضحة أدناه:
   1. ثبت الشظايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة ، وقم بتضمينها في البارافين باستخدام جهاز تضمين أوتوماتيكي بالخطوات المذكورة في الجدول 1.
   2. اترك الكتل المغروسة بالبارافين طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل تقطيعها إلى أقسام بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
   3. انشر أقسام المناديل على شريحة زجاجية موضوعة على طبق ساخن (30 درجة مئوية) ، واتركها لتجف لمدة 2 ساعة ، تليها 24 ساعة في فرن على حرارة 37 درجة مئوية.
   4. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين ويوزين باتباع بروتوكول موصوف في مكان آخر³¹. بعد ذلك ، قم برقمنة العينات باستخدام ماسح ضوئي للشرائح ، وقم بتحليلها باستخدام برنامج تحليل الصور.

النتائج

معدلات بقاء جنين الفرخ
كان معدل بقاء الجنين من النوافذ (اليوم 3 من الضعف الجنسي) إلى تطعيم أنسجة المبيض (اليوم 7 من الضعف الجنسي) 79٪ (33/42). نظرا لأن النسبة المئوية للبيض الجنيني في اليوم 0 غير معروفة ، فقد تم طلب عدد زائد من البيض في اليوم 0 من دجاج ليغورن الأبيض المختار من قبل لومان لض...

Discussion

الجزء الأكثر تحديا في البروتوكول الموصوف هنا هو عمل الثقب الصغير المطلوب لاستنشاق الزلال من أجل فصل CAM عن قشر البيض قبل إنشاء نافذة. يمكن أن يؤدي الضغط المفرط إلى الإفراط في الاختراق أو قد يؤدي إلى تكسير البويضة وتدميرها ، مما يتسبب في تلف لا رجعة فيه للطب التكميلي والبديل والأوعية الدموية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution