Le modèle de membrane chorioallantoïde (CAM) du poussin comme outil d’étude de la transplantation de tissu ovarien

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour le développement d’un modèle de xénogreffe de membrane chorioallantoïde (CAM) de poussin pour le tissu ovarien humain et démontrons l’efficacité de la technique, le délai de revascularisation du greffon et la viabilité du tissu sur une période de greffe de 6 jours.

Résumé

La cryoconservation et la transplantation de tissus ovariens sont une stratégie efficace pour préserver la fertilité, mais présentent un inconvénient majeur, à savoir une perte massive de follicules survenant peu de temps après la réimplantation en raison d’une activation folliculaire anormale et de la mort. Les rongeurs sont des modèles de référence pour l’étude de l’activation folliculaire, mais le coût, le temps et les considérations éthiques deviennent de plus en plus prohibitifs, ce qui conduit au développement d’alternatives. Le modèle de la membrane chorioallantoïde (CAM) du poussin est particulièrement attrayant, car il est peu coûteux et maintient l’immunodéficience naturelle jusqu’au 17e jour après la fécondation, ce qui le rend idéal pour étudier la xénogreffe à court terme de tissu ovarien humain. Le CAM est également très vascularisé et a été largement utilisé comme modèle pour explorer l’angiogenèse. Cela lui confère un avantage remarquable par rapport aux modèles in vitro et permet d’étudier les mécanismes affectant le processus précoce de perte de follicules post-greffe. Le protocole décrit ici vise à décrire le développement d’un modèle de xénogreffe CAM pour le tissu ovarien humain, avec des informations spécifiques sur l’efficacité de la technique, le délai de revascularisation du greffon et la viabilité du tissu sur une période de greffe de 6 jours.

Introduction

La demande de préservation de la fertilité pour des indications oncologiques et bénignes, ainsi que pour des raisons sociales, a considérablement augmenté au cours des dernières décennies. Cependant, divers traitements utilisés pour guérir les maladies malignes et non malignes sont hautement toxiques pour les gonades et peuvent entraîner une insuffisance ovarienne prématurée iatrogène, conduisant finalement à l’infertilité¹. Les techniques établies pour la préservation de la fertilité comprennent la cryoconservation des embryons, la vitrification des ovocytes immatures ou matures et la cryoconservation des tissus ovariens ^2,3,4. La congélation du tissu ovarien est la seule option disponible pour préserver la fertilité chez les filles prépubères ou les femmes qui ont besoin d’un traitement anticancéreux immédiat. La restauration de la fonction endocrinienne après une greffe de tissu ovarien se produit chez plus de 95 % des sujets, avec des taux de naissances vivantes allant de 18 % à 42 %5,6,7,8,9.

Bien que la transplantation de tissus ovariens congelés-décongelés ait fait ses preuves, il y a encore place à l’amélioration. En effet, comme les fragments corticaux ovariens sont transplantés sans anastomose vasculaire, ils connaissent une période d’hypoxie durant laquelle la revascularisation du greffon a lieu 10,11,12. La grande majorité des études portant sur la transplantation de tissu ovarien humain ont utilisé un modèle de xénogreffe, dans lequel du tissu ovarien est transplanté à des souris immunodéficientes. La revascularisation complète des xénogreffes prend environ 10 jours, l’hôte et les vaisseaux du greffon contribuant à la formation de vaisseaux fonctionnels 12,13,14. Environ 50 à 90 % de la réserve folliculaire est perdue pendant cette fenêtre hypoxique avant l’achèvement de la revascularisation du greffon 10,15,16. Il a été fortement suggéré que cette perte massive de follicules se produit à la fois par la mort directe des follicules, comme le démontre une diminution du nombre absolu de follicules restants après la greffe, et par l’activation de la croissance des follicules primordiaux, comme l’indiquent les changements dans les proportions folliculaires vers des taux accrus de follicules en croissance^17,18.

Il est intéressant de noter que des travaux de recherche antérieurs utilisant divers tissus ovariens animaux greffés à la membrane chorioallantoïde (CAM) du poussin, dont la constitution imite le site de greffe typique du péritoine, ont rapporté l’inhibition de l’activation folliculaire spontanée, la réserve folliculaire primordiale restant intacte jusqu’à 10 jours 19,20,21,22. Notre équipe a déjà démontré que la greffe de tissu ovarien humain congelé-décongelé sur CAM constituait une approche fiable pour étudier la transplantation de tissu ovarien humain dans ses premiers stades ischémiques²³ et a récemment montré que cette méthode de greffe était capable de contrecarrer l’activation folliculaire²⁴.

Le modèle CAM est particulièrement attrayant non seulement parce que les ovules sont beaucoup moins chers que les souris, mais aussi en raison de la nature hautement vascularisée de CAM, permettant d’examiner l’association entre l’activation folliculaire et la revascularisation du greffon ovarien. Le système aviaire est, en effet, l’un des moyens les plus courants et les plus polyvalents d’étudier l’angiogenèse²⁵. Le développement de l’embryon de poussin (DE) prend 21 jours jusqu’à l’éclosion, et le CAM se forme dans les 4 à 5 premiers jours par la fusion de l’allantoïde et du chorion²⁶. Notamment, l’embryon de poussin est un hôte naturellement immunodéficient jusqu’au 17e jour de la dysfonction érectile, de sorte que les expériences de xénogreffe peuvent être réalisées sans aucun risque de rejet du greffon^27,28. De plus, l’approche du modèle CAM ne soulève aucune préoccupation éthique ou juridique au regard du droit européen²⁹, ce qui en fait une alternative intéressante aux autres modèles animaux. En ce qui concerne les conditions de reproduction, les embryons de poussins n’ont besoin que d’un incubateur réglé à 37 °C avec une humidité relative de l’air de 40 % à 60 %. Ces exigences d’expérimentation limitées réduisent considérablement les coûts de recherche par rapport à l’utilisation de souris immunodéficientes.

Le protocole présenté ici vise à décrire le développement d’un modèle de xénogreffe CAM pour le tissu ovarien humain et à fournir des informations spécifiques sur l’efficacité de la technique, le délai de revascularisation du greffon et la viabilité tissulaire sur une période de greffe de 6 jours. Ce protocole pourrait être d’un grand intérêt pour étudier les mécanismes à l’origine de la perte folliculaire précoce post-greffe et étudier l’impact de plusieurs agents (facteurs de croissance, hormones, etc.) sur ce phénomène.

Protocole

L’utilisation de tissus humains a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de l’Université catholique de Louvain. Les patientes ont donné leur consentement éclairé écrit pour l’utilisation de leur tissu ovarien à des fins de recherche.

1. Commander des ovules du jour 0 qui sont très susceptibles d’être embryonnés

1. Trouvez un fournisseur d’œufs blancs de Leghorn certifié et sélectionné par Lohman en laboratoire qui signale des taux élevés d’œufs embryonnés, ce qui dépend principalement de l’âge des poussins.

2. Préparation des œufs pour l’incubation

1. Avant l’arrivée des œufs, assemblez et équilibrez l’incubateur à 37 °C dans une humidité relative de l’air de 40 % à 60 %. Surveillez la température et l’humidité de l’air en insérant un thermomètre et un hygromètre dans l’incubateur. Assurez-vous que le couvercle de l’incubateur est équipé d’une fenêtre en verre pour permettre de vérifier les paramètres internes de l’incubateur sans avoir à l’ouvrir (Figure 1).
2. Après avoir reçu les œufs du jour 0 provenant de poussins de Legghorn blancs sélectionnés par Lohman auprès d’un fournisseur d’œufs certifié de qualité laboratoire, nettoyez la surface des coquilles avec du papier humidifié et séchez-les immédiatement.
   REMARQUE : Étant donné que la membrane de la coquille d’œuf est poreuse, de l’eau autoclavée peut être utilisée pour nettoyer les surfaces des œufs et contrôler l’humidité à l’intérieur de l’incubateur afin de minimiser les risques de contamination.
3. Étiquetez les œufs à l’aide d’un marqueur (p. ex., date et numéro d’œuf).
4. Incubez les œufs avec l’extrémité pointue vers le bas et faites-les pivoter pour permettre à la CAM de se développer. Faites pivoter manuellement les œufs de 180° deux à trois fois par jour ou utilisez un rotateur automatique.
   REMARQUE : Afin de s’assurer que les œufs sont bien tournés, la coquille de l’œuf peut être marquée d’un « X » et d’un « O » sur les deux côtés latéraux opposés à l’aide d’un crayon ou d’un marqueur. La fenêtre en verre dans le couvercle de l’incubateur permet de vérifier la rotation des œufs sans ouvrir l’appareil.

3. Ouvrir la coquille d’œuf au jour 3 de la dysfonction érectile

REMARQUE : Une fenêtre rectangulaire est faite dans la coquille d’œuf le jour 3 de la dysfonction érectile.

1. Préparez la hotte à flux laminaire afin de travailler dans des conditions stériles. Placez les instruments suivants sous la hotte et désinfectez-les dans de l’éthanol à 70 % (s’ils ne sont pas déjà stérilisés) :
   -Étagère à oeufs
   -Bougie d’œuf ou source de lumière froide focale
   -Marqueur
   -Broche droite stérile
   -Aiguille stérile de 19 g
   -Seringue stérile de 5 ml
   -Lame de scie à chantourner
   -Pince stérile
   -Ruban adhésif
2. Transférez un œuf de l’incubateur au support à œufs placé sous le capot et éteignez le rotateur d’œufs.
3. Dans l’obscurité, identifiez la poche d’air de l’œuf en plaçant le chandelier d’œuf (ou source de lumière froide focale) contre la coquille de l’œuf. La poche d’air est localisée à l’extrémité émoussée de l’œuf. Utilisez un marqueur pour localiser le centre de la poche d’air sur la coquille d’œuf.
4. Allumez les lumières. Faites un petit trou dans la coquille de l’œuf à l’endroit où elle est marquée en tournant doucement une épingle droite stérile. Une petite ouverture d’environ 1 mm de diamètre est généralement suffisante.
   REMARQUE : Veillez à ne pas pousser la goupille complètement à travers l’œuf. Si cela se produit, jetez l’œuf.
5. Connectez une aiguille stérile de 19 G à une seringue stérile de 5 ml.
6. Dans l’obscurité, repérez le sac vitellin à l’aide de la chandelle à œufs (ou source focale de lumière froide) et percez l’œuf à travers le trou pratiqué à l’étape 3.4 avec l’aiguille stérile de 19 G inclinée à 45° vers le bas de l’œuf ; Faites très attention à ne pas perturber le sac vitellin. Aspirez entre 1,5 et 2 ml d’albumine pour détacher la CAM de la coquille, puis fermez le trou avec un morceau de ruban adhésif.
   REMARQUE : Si le sac vitellin est perturbé pendant l’aspiration, le liquide aspiré dans la seringue sera de couleur jaune plutôt que transparent (albumin). Si cela se produit, remplacez l’aiguille et la seringue. Si une quantité relativement importante de jaune d’œuf est aspirée, cela peut compromettre la viabilité de l’embryon.
7. Allumez les lumières. Placez l’œuf à l’horizontale et dessinez une fenêtre rectangulaire de 1 cm x 1,5 cm à l’aide d’un marqueur. Ne faites pas la fenêtre plus grande que la largeur habituelle du ruban adhésif standard.
8. Tenez l’œuf d’une main et sciez doucement la fenêtre précédemment dessinée dans la coquille de l’œuf à l’aide d’une lame de scie à chantourner. Assurez-vous que la coque ne se fissure pas et ne coupez pas jusqu’à la CAM enfoncée. Soufflez régulièrement pour enlever la poussière et les débris de la coquille.
9. Glissez la pince stérile sous le morceau rectangulaire de coquille sciée et saisissez-la habilement pour la retirer proprement sans endommager la came. De plus, jetez la membrane blanche de la coquille extérieure pour pouvoir voir l’embryon et sa CAM.
   REMARQUE : Si de la poussière ou des débris de coquille d’œuf tombent sur le CAM, il peut être retiré à l’aide d’une pince stérile, en faisant très attention de ne pas déchirer le CAM.
10. Identifiez les ovules embryonnés viables. Ils sont discernables par leur albumine claire et l’anneau vasculaire autour de l’embryon, où un cœur battant peut parfois être détecté même à ce stade (jour 3 de la dysfonction érectile). Jeter les embryons non fécondés ou morts.
11. Placez du ruban adhésif sur la fenêtre nouvellement créée pour éviter la déshydratation. Assurez-vous de replier une extrémité sur elle-même pour faciliter le retrait.
12. Remettez l’œuf dans l’incubateur avec la fenêtre ouverte vers le haut et le ruban adhésif ne touchant pas la CAM. Utilisez un morceau de papier plié ou une partie du support à œufs pour empêcher l’œuf de rouler. Assurez-vous que le plateau rotatif est éteint.
13. Répétez les étapes 3.2 à 3.12 pour ouvrir les œufs restants.

4. Greffe de tissu ovarien humain congelé-décongelé dans le CAM

REMARQUE : La transplantation dans le CAM devrait idéalement être initiée entre le 7e et le 10e jour de la dysfonction érectile.

1. Décongeler les bandelettes corticales ovariennes cryoconservées sous la hotte à flux laminaire en suivant le protocole décrit ailleurs³⁰.
2. Coupez les bandes corticales en trois fragments de 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilisez une pièce comme témoin non greffé et les deux autres pour la xénogreffe pendant 1 jour ou 6 jours.
   REMARQUE : S’il y a suffisamment de mouchoirs disponibles, travailler en double.
3. Transférez un œuf de l’incubateur au support à œufs placé sous le capot, avec la fenêtre vers le haut.
4. Décollez le ruban adhésif de la fenêtre et assurez-vous que l’embryon est viable. À ce stade, les embryons viables présentent une vascularisation étendue, un albumen clair, un battement de cœur visible et un certain mouvement de l’embryon.
5. Préparez le site de greffe en traumatisant doucement une petite zone de la CAM en posant une bande de 1 cm² de papier stérile pour lentilles extraites à l’éther sur la surface épithéliale et en la retirant immédiatement.
   REMARQUE : Le CAM est une barrière impénétrable à moins que la membrane n’ait été traumatisée par l’ablation de la partie péridermique supérieure de la double couche épithéliale, laissant la couche basale intacte. Cette technique améliore également le processus de revascularisation en activant la cicatrisation des plaies. Si le papier stérile extrait à l’éther reste trop longtemps sur le CAM, la membrane peut adhérer au papier de l’objectif et se déchirer. Si cela se produit, jetez l’œuf.
6. Saisissez une bandelette corticale ovarienne congelée (4 mm x 2 mm x 1 mm) à l’aide d’une pince microchirurgicale et placez-la sur la CAM traumatisée avec le côté médullaire contre la CAM. Greffez un morceau de tissu par œuf.
7. Couvrez la fenêtre avec du ruban adhésif et remettez soigneusement l’œuf dans l’incubateur. Assurez-vous que l’ouverture de la coquille de l’œuf est bien droite et que l’œuf est bien fixé.
8. Répétez les étapes 4.1 à 4.7 pour la greffe de tous les tissus restants.
   REMARQUE : Les implants doivent être vérifiés chaque jour de greffe pour évaluer la viabilité de l’embryon et surveiller les changements dans le système vasculaire.

5. Récolte des greffons

REMARQUE : Les xénogreffes doivent être prélevées au plus tard au 17e jour de la dysfonction érectile, car le système immunitaire de l’embryon devient mature et compétent à partir du 18e jour.

1. Placez l’œuf sur une grille et agrandissez la fenêtre dans la coquille de l’œuf pour permettre une meilleure visualisation du greffon et une manipulation plus facile.
2. Évaluez le greffon macroscopiquement et portez une attention particulière à la réaction vasculaire du CAM vis-à-vis du greffon. Prenez des photos ou des vidéos numériques pour l’enregistrement.
3. Saisissez le tissu ou la CAM environnante avec une pince et utilisez des ciseaux ou un scalpel pour exciser soigneusement le greffon de la CAM.
   REMARQUE : Les greffons sont recouverts d’une deuxième couche de CAM vers le jour 3 de la greffe et finissent par être encapsulés. Ils peuvent également s’être déplacés à l’intérieur de l’œuf au jour 6, ce qui rend difficile leur récupération dans certains cas.
4. Analysez les tissus excisés par n’importe quelle méthode appropriée à l’expérience donnée. Dans la présente étude, des morceaux de tissu ont été fixés dans du paraformaldéhyde, enrobés de paraffine et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine en suivant les étapes décrites ci-dessous :
   1. Fixez les fragments dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h et incorporez-les dans de la paraffine à l’aide d’un dispositif d’enrobage automatique en suivant les étapes mentionnées dans le tableau 1.
   2. Laissez les blocs enrobés de paraffine toute la nuit à 4°C avant de les couper en sections de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome.
   3. Étalez les morceaux de tissu sur une lame de verre posée sur une plaque chauffante (30 °C), et laissez-les sécher pendant 2 h, puis 24 h dans un four à 37 °C.
   4. Ensuite, colorez les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine en suivant un protocole décrit ailleurs³¹. Par la suite, numérisez les échantillons à l’aide d’un scanner de lames et analysez-les à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Résultats

Taux de survie des embryons de poussins
Le taux de survie des embryons entre la fenêtrage (jour 3 de la dysfonction érectile) et la greffe de tissu ovarien (jour 7 de la dysfonction érectile) était de 79 % (33/42). Étant donné que le pourcentage d’œufs embryonnés au jour 0 est inconnu, des œufs surnuméraires au jour 0 provenant de poules blanches Leghorn sélectionnées par Lohman ont été commandés pour s’assurer qu’il y aurait suffisamment d’œufs embryonnés disponibles pour la ...

Discussion

La partie la plus difficile du protocole décrit ici est de faire le petit trou nécessaire pour aspirer l’albumen afin de détacher le CAM de la coquille de l’œuf avant de créer une fenêtre. L’application d’une pression trop forte peut entraîner une pénétration excessive ou même fissurer et détruire l’œuf, causant des dommages irrévocables à la CAM et à son système vasculaire. Pour réduire au minimum les erreurs lors des premières tentatives de séparation de la CAM, il est fortement conseillé ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution