鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 模型作为研究卵巢组织移植的工具

摘要

在这里，我们描述了为人类卵巢组织开发鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 异种移植模型的方案，并展示了该技术的有效性、移植物血运重建时间范围以及 6 天移植期间的组织活力。

摘要

卵巢组织冷冻保存和移植是保留生育能力的有效策略，但有一个主要缺点，即由于卵泡活化异常和死亡，在重新植入后不久发生大量卵泡丢失。啮齿动物是研究卵泡活化的基准模型，但成本、时间和伦理考虑正变得越来越令人望而却步，从而推动了替代品的发展。雏鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 模型特别有吸引力，价格低廉，并且在受精后第 17 天之前保持自然免疫缺陷，使其成为研究人类卵巢组织短期异种移植的理想选择。CAM 也是高度血管化的，已被广泛用作探索血管生成的模型。这使其比 体外 模型具有显着优势，并允许研究影响早期移植后卵泡丢失过程的机制。本文概述的方案旨在描述用于人类卵巢组织的 CAM 异种移植模型的开发，并具体了解该技术的有效性、移植物血运重建时间范围以及 6 天移植期间的组织活力。

引言

近几十年来，肿瘤学和良性适应症以及社会原因对生育力保存的需求急剧增加。然而，用于治疗恶性和非恶性疾病的各种治疗方法对性腺有剧毒，并可能导致医源性卵巢功能不全，最终导致不孕症¹.成熟的生育力保存技术包括胚胎冷冻保存、未成熟或成熟的卵母细胞玻璃化和卵巢组织冷冻保存 ^2,3,4。卵巢组织冷冻是青春期前女孩或需要立即癌症治疗的妇女保持生育能力的唯一可用选择。卵巢组织移植后内分泌功能恢复发生在 95% 以上的受试者中，活产率从 18% 到 42%5,6,7,8,9 不等。

尽管冻融卵巢组织的移植已被证明是成功的，但仍有改进的余地。事实上，当卵巢皮质碎片在没有血管吻合的情况下移植时，它们会经历一段缺氧期，在此期间进行移植物血运重建 10,11,12。绝大多数研究人类卵巢组织移植的研究都使用了异种移植模型，其中卵巢组织被移植到免疫缺陷小鼠身上。异种移植物的完全血运重建大约需要 10 天，宿主血管和移植血管都有助于功能血管的形成 12,13,14。在移植物血运重建完成之前的缺氧窗口期间，大约 50%-90% 的卵泡储备丢失 10,15,16。强烈认为，这种大规模的卵泡丢失是通过直接卵泡死亡（如移植后剩余的绝对卵泡数量的减少）和原始卵泡生长的激活而发生的，如卵泡比例的变化对卵泡生长速率的增加^{所表明的那样17,18}。

有趣的是，先前的研究工作使用各种动物卵巢组织移植到鸡绒毛膜尿囊膜 （CAM） 上，其结构模仿腹膜的典型移植部位，已经报道了抑制自发卵泡活化，原始卵泡储备保持完整长达 10 天 19,20,21,22.我们的团队之前证明，将冻融的人类卵巢组织移植到CAM是研究人类卵巢组织移植在其第一个缺血阶段的可靠方法²³，并且最近表明这种移植方法能够抵消卵泡活化²⁴。

CAM模型特别吸引人，不仅因为卵子比小鼠便宜得多，还因为CAM的高度血管化性质，可以仔细检查卵泡活化和卵巢移植物血运重建之间的关联。事实上，鸟类系统是研究血管生成的最常见和最通用的方法^{之一 25}.雏鸡胚胎发育 （ED） 需要 21 天才能孵化，CAM 在前 4-5 天内通过尿囊和绒毛膜²⁶ 的融合形成。值得注意的是，在ED的第17天之前，雏鸡胚胎是天然免疫缺陷宿主，因此可以进行异种移植实验，而不会产生任何移植物排斥的风险^27,28。此外，CAM模型方法在欧洲法律²⁹方面不会引起任何伦理或法律问题，使其成为其他动物模型的有吸引力的替代方案。在育种条件方面，雏鸡胚胎只需要一个设置为37°C、相对空气湿度为40%-60%的孵化器。与使用免疫缺陷小鼠相比，这些有限的实验要求显着降低了研究成本。

本文介绍的方案旨在描述用于人类卵巢组织的 CAM 异种移植模型的开发，并就该技术的有效性、移植物血运重建的时间范围以及 6 天移植期内的组织活力提供具体见解。该方案对于研究早期移植后卵泡丢失背后的机制和研究几种药物（生长因子，激素等）对这种现象的影响可能非常有意义。

研究方案

人体组织的使用得到了鲁汶天主教大学机构审查委员会的批准。患者对将卵巢组织用于研究目的给予了书面知情同意书。

1. 订购极有可能胚胎化的第 0 天卵子

1. 寻找经过认证的实验室级 Lohman 精选的白色 Leghorn 鸡蛋供应商，该供应商报告的胚胎鸡蛋率很高，这主要取决于雏鸡的年龄。

2. 准备孵化的种蛋

1. 在种蛋到达之前，在40%-60%的相对空气湿度下将种蛋孵化器组装并平衡至37°C。通过将温度计和湿度计插入培养箱来监测温度和空气湿度。确保培养箱的盖子配有玻璃窗，以便检查培养箱的内部参数，而无需打开它（图1）。
2. 从经过认证的实验室级鸡蛋供应商处收到来自洛曼精选的白色 Leghorn 雏鸡的第 0 天鸡蛋后，用加湿纸清洁蛋壳表面，并立即干燥。
   注意:由于蛋壳膜是多孔的，因此可以使用高压灭菌水来清洁鸡蛋表面并控制孵化器内的湿度，以最大限度地降低污染风险。
3. 使用记号笔（例如日期和鸡蛋编号）标记鸡蛋。
4. 孵化鸡蛋时，尖头朝下，并旋转它们以使 CAM 发育。每天手动将鸡蛋旋转 180° 两到三次，或使用自动旋转器。
   注意:为了确保鸡蛋确实在旋转，可以使用铅笔或记号笔在蛋壳的两个相对侧面标记"X"和"O"。孵化器盖上的玻璃窗允许人们在不打开设备的情况下检查鸡蛋的旋转。

3. 在ED的第3天打开蛋壳

注意:在ED的第3天，在蛋壳中制作了一个矩形窗口。

1. 准备层流罩，以便在无菌条件下工作。将以下器械放在引擎盖下，并用 70% 乙醇（如果尚未消毒）对其进行消毒:
   -鸡蛋架 （Egg rack）
   -鸡蛋烛台或焦点冷光源
   -标记
   -无菌直针 （Sterile straight pin）
   -无菌19G针头
   -5 mL 无菌注射器
   -涡旋锯片 （Scroll saw blade）
   -无菌镊子 （Sterile sealps）
   -胶带
2. 将一个鸡蛋从孵化器转移到放置在引擎盖下的鸡蛋架上，然后关闭鸡蛋旋转器。
3. 在黑暗中，通过将鸡蛋烛台（或焦点冷光源）靠在蛋壳上来识别鸡蛋的气囊。气穴位于鸡蛋的钝端。使用记号笔精确定位蛋壳上气穴的中心。
4. 打开灯。在蛋壳上打一个小孔，轻轻旋转无菌直针进行标记。直径约 1 毫米的小开口通常就足够了。
   注意: 注意不要将销钉一直推过鸡蛋。如果发生这种情况，请丢弃鸡蛋。
5. 将无菌 19 G 针头连接到无菌 5 mL 注射器。
6. 在黑暗中，使用鸡蛋烛台（或聚焦冷光源）找到卵黄囊，然后用无菌19G针向鸡蛋底部倾斜45°，将鸡蛋刺穿步骤3.4中制作的孔;要格外小心，不要破坏卵黄囊。吸入 1.5-2 mL 蛋白以将 CAM 从外壳上分离，然后用胶带封闭孔。
   注意:如果卵黄囊在抽吸过程中被破坏，注射器中吸入的液体将是黄色而不是透明的（蛋白）。如果发生这种情况，请更换针头和注射器。如果吸食相对大量的蛋黄，可能会危及胚胎的活力。
7. 打开灯。将鸡蛋水平放置，并用记号笔画一个尺寸为 1 厘米 x 1.5 厘米的矩形窗口。请勿使窗口大于标准胶带的通常宽度。
8. 一只手拿着鸡蛋，用卷轴锯片轻轻地将先前绘制的窗口锯入蛋壳。确保外壳不会破裂，并且不要一直切割到凹陷的 CAM。定期吹气以清除外壳灰尘和碎屑。
9. 将无菌镊子滑到锯切的矩形外壳下方，并巧妙地抓住以将其干净地取出，而不会损坏 CAM。此外，丢弃白色外壳膜，以便能够看到胚胎及其CAM。
   注意: 如果一些蛋壳灰尘或碎屑掉到 CAM 上，可以使用无菌镊子将其清除，但要非常小心不要撕裂 CAM。
10. 识别有活力的胚胎卵。它们可以通过透明的蛋白和胚胎周围的血管环来辨别，即使在这个阶段（ED的第3天），有时也可以检测到跳动的心脏。丢弃未受精或死亡的胚胎。
11. 在新创建的窗口上贴上胶带以避免脱水。务必将一端折叠起来，以便于拆卸。
12. 将鸡蛋放回孵化器中，打开的窗口朝上，胶带不接触 CAM。使用折叠的纸或部分蛋架来阻止鸡蛋滚动。确保旋转托盘已关闭。
13. 重复步骤 3.2-3.12 打开剩余的鸡蛋。

4. 将冻融的人卵巢组织移植到CAM

注意:理想情况下，移植到 CAM 应在 ED 的第 7-10 天之间开始。

1. 按照其他地方描述的方案在层流罩下解冻冷冻保存的卵巢皮质条³⁰.
2. 将皮质条切成 4 mm x 2 mm x 1 mm 的三个碎片。将一块用作非嫁接对照，另外两块用于异种移植 1 天或 6 天。
   注意:如果有足够的组织可用，请一式两份。
3. 将一个鸡蛋从孵化器转移到位于引擎盖下方的鸡蛋架上，窗户朝上。
4. 从窗户上撕下胶带，并确保胚胎是可行的。在这个阶段，活胚胎具有广泛的脉管系统、透明的蛋白、可见的心跳和一些胚胎运动。
5. 通过将 1 cm² 条无菌乙醚提取的晶状体纸铺在上皮表面上并立即将其取出，轻轻创伤 CAM 的一小块区域来准备移植部位。
   注意:CAM 是不可穿透的屏障，除非膜因去除双上皮层的上皮周部分而受到创伤，使基底层完好无损。该技术还通过激活伤口愈合来增强血运重建过程。如果无菌乙醚提取的镜片纸在 CAM 上停留时间过长，膜可能会粘附在镜片纸上并撕裂。如果发生这种情况，请丢弃鸡蛋。
6. 用显微外科镊子抓住一个冻融的卵巢皮质条带（4 mm x 2 mm x 1 mm），并将其放在受创伤的 CAM 上，髓侧靠在 CAM 上。每个卵子移植一块组织。
7. 用胶带盖住窗户，小心地将鸡蛋放回孵化器。确保蛋壳开口直立且鸡蛋牢固。
8. 重复步骤4.1-4.7移植所有剩余组织。
   注意:应在每个移植日检查植入物，以评估胚胎活力并监测脉管系统的变化。

5. 收获嫁接

注意:异种移植物最迟应在ED的第17天收获，因为胚胎的免疫系统从第18天开始成熟并有能力。

1. 将鸡蛋放在架子上，并扩大蛋壳中的窗口，以便更好地可视化移植物并更容易操作。
2. 从宏观上评估移植物，并特别注意CAM对移植物的血管反应。拍摄数码照片或视频以备记录。
3. 用镊子抓住组织或周围的 CAM，然后用剪刀或手术刀小心地从 CAM 上切除移植物。
   注意:移植物在移植物的第 3 天左右被第二层 CAM 覆盖并最终被封装。它们也可能在第 6 天进入卵子内部，在某些情况下很难取回它们。
4. 通过适合给定实验的任何方法分析切除的组织。在本研究中，按照以下步骤将组织片固定在多聚甲醛、石蜡包埋中，并用苏木精和伊红染色:
   1. 将片段固定在4%多聚甲醛中24小时，并按照 表1中提到的步骤使用自动包埋装置将其包埋在石蜡中。
   2. 将石蜡包埋的块在4°C下放置过夜，然后用切片机将它们切成5μm厚的部分。
   3. 将组织切片铺在放置在热板（30°C）上的载玻片上，并使其干燥2小时，然后在37°C的烤箱中24小时。
   4. 之后，按照其他地方描述的方案用苏木精和伊红对载玻片进行染色³¹.随后，使用载玻片扫描仪对样品进行数字化处理，并使用图像分析软件进行分析。

结果

雏鸡胚胎存活率
从窗口期（ED第3天）到卵巢组织移植（ED第7天）的胚胎存活率为79%（33/42）。由于胚胎第0天种蛋的百分比未知，因此订购了来自Lohman选择的白色Leghorn鸡的多余第0天种蛋，以确保有足够的胚胎种蛋可用于嫁接。共使用23个存活的第7天卵进行移植，其中一个在前24小时内死亡，移植后胚胎总存活率为96%（22/23）。

移植物的宏观方面
?...

讨论

这里描述的方案中最具挑战性的部分是制作吸出蛋白所需的小孔，以便在创建窗口之前将 CAM 从蛋壳上分离出来。施加过大的压力会导致过度渗透，甚至可能破裂并破坏鸡蛋，对 CAM 及其脉管系统造成不可挽回的损害。为了在最初尝试分离 CAM 时将错误降至最低，强烈建议练习使用直针在未受精的杂货店购买的鸡蛋的蛋壳上打小孔。此外，鉴于不同批次的生育能力的自然差异，以及并非所有胚胎都?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution