Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.

Abstract

La crioconservazione e il trapianto di tessuto ovarico sono una strategia efficace per preservare la fertilità, ma presentano un grave svantaggio, vale a dire la massiccia perdita di follicoli che si verifica poco dopo il reimpianto a causa dell'attivazione anomala del follicolo e della morte. I roditori sono modelli di riferimento per studiare l'attivazione dei follicoli, ma i costi, i tempi e le considerazioni etiche stanno diventando sempre più proibitivi, guidando così lo sviluppo di alternative. Il modello di membrana corioallantoica (CAM) del pulcino è particolarmente interessante, essendo poco costoso e mantenendo l'immunodeficienza naturale fino al giorno 17 dopo la fecondazione, rendendolo ideale per studiare lo xenotrapianto a breve termine di tessuto ovarico umano. La CAM è anche altamente vascolarizzata ed è stata ampiamente utilizzata come modello per esplorare l'angiogenesi. Ciò gli conferisce un notevole vantaggio rispetto ai modelli in vitro e consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di perdita follicolare post-trapianto precoce. Il protocollo qui delineato mira a descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano, con approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale in un periodo di innesto di 6 giorni.

Introduzione

La domanda di preservazione della fertilità per indicazioni oncologiche e benigne, oltre che per motivi sociali, è aumentata notevolmente negli ultimi decenni. Tuttavia, vari trattamenti utilizzati per curare malattie maligne e non maligne sono altamente tossici per le gonadi e possono provocare insufficienza ovarica precoce iatrogena, portando infine all'infertilità¹. Le tecniche consolidate per la preservazione della fertilità includono la crioconservazione degli embrioni, la vitrificazione di ovociti immaturi o maturi e la crioconservazione del tessuto ovarico ^2,3,4. Il congelamento del tessuto ovarico è l'unica opzione disponibile per preservare la fertilità nelle ragazze in età prepuberale o nelle donne che richiedono una terapia oncologica immediata. Il ripristino della funzione endocrina a seguito di trapianto di tessuto ovarico si verifica in oltre il 95% dei soggetti, con tassi di natalità che vanno dal 18% al 42%5,6,7,8,9.

Sebbene il trapianto di tessuto ovarico congelato-scongelato si sia dimostrato efficace, c'è ancora spazio per miglioramenti. Infatti, quando i frammenti corticali ovarici vengono trapiantati senza anastomosi vascolare, sperimentano un periodo di ipossia durante il quale avviene la rivascolarizzazione dell'innesto 10,11,12. La stragrande maggioranza degli studi che indagano sul trapianto di tessuto ovarico umano hanno utilizzato un modello di xenotrapianto, in cui il tessuto ovarico viene trapiantato su topi immunodeficienti. La rivascolarizzazione completa degli xenotrapianti richiede circa 10 giorni, con sia l'ospite che i vasi dell'innesto che contribuiscono alla formazione di vasi funzionali 12,13,14. Circa il 50%-90% della riserva follicolare viene persa durante questa finestra ipossica prima del completamento della rivascolarizzazione dell'innesto 10,15,16. È stato fortemente suggerito che questa massiccia perdita di follicoli si verifichi sia attraverso la morte diretta del follicolo, come dimostrato da una diminuzione del numero assoluto di follicoli rimasti dopo l'innesto, sia attraverso l'attivazione della crescita del follicolo primordiale, come indicato dai cambiamenti nelle proporzioni del follicolo verso l'aumento dei tassi di follicoli in crescita^17,18.

È interessante notare che precedenti lavori di ricerca che utilizzano vari tessuti ovarici animali innestati sulla membrana corioallantoica del pulcino (CAM), che ha una costituzione che imita il tipico sito di innesto del peritoneo, hanno riportato l'inibizione dell'attivazione spontanea del follicolo, con la riserva follicolare primordiale che rimane intatta fino a 10 giorni 19,20,21,22. Il nostro team ha precedentemente dimostrato che l'innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato alla CAM costituiva un approccio affidabile per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano nei suoi primi stadi ischemici²³ e recentemente ha dimostrato che questo metodo di innesto era in grado di contrastare l'attivazione del follicolo²⁴.

Il modello CAM è particolarmente interessante non solo perché gli ovuli sono molto più economici dei topi, ma anche per la natura altamente vascolarizzata della CAM, che consente di esaminare l'associazione tra l'attivazione del follicolo e la rivascolarizzazione dell'innesto ovarico. Il sistema aviario è, infatti, uno dei modi più comuni e versatili per studiare l'angiogenesi²⁵. Lo sviluppo embrionale del pulcino (DE) richiede 21 giorni fino alla schiusa e la CAM si forma entro i primi 4-5 giorni attraverso la fusione dell'allantoide e del corion²⁶. In particolare, l'embrione di pulcino è un ospite naturalmente immunodeficiente fino al 17° giorno di disfunzione erettile, quindi gli esperimenti di xenotrapianto possono essere eseguiti senza alcun rischio di rigetto del trapianto^27,28. Inoltre, l'approccio basato su modelli CAM non solleva preoccupazioni etiche o giuridiche in termini di diritto europeo²⁹, il che lo rende un'alternativa interessante ad altri modelli animali. Per quanto riguarda le condizioni di allevamento, gli embrioni di pulcino necessitano solo di un'incubatrice impostata a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Questi requisiti di sperimentazione limitati riducono significativamente i costi di ricerca rispetto all'uso di topi immunodeficienti.

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano e fornire approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale per un periodo di innesto di 6 giorni. Questo protocollo potrebbe essere di grande interesse per studiare i meccanismi alla base della perdita precoce di follicoli post-trapianto e studiare l'impatto di diversi agenti (fattori di crescita, ormoni, ecc.) su questo fenomeno.

Protocollo

L'uso di tessuti umani è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università Cattolica di Lovanio. Le pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto per l'uso del loro tessuto ovarico a fini di ricerca.

1. Ordinare ovuli del giorno 0 che hanno un'alta probabilità di essere embrionati

1. Trova un fornitore certificato di uova bianche livornesi selezionate da Lohman di grado di laboratorio che riporti alti tassi di uova embrionate, che dipendono principalmente dall'età dei pulcini.

2. Preparazione delle uova per l'incubazione

1. Prima dell'arrivo delle uova, assemblare e bilanciare l'incubatrice a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Monitorare la temperatura e l'umidità dell'aria inserendo un termometro e un igrometro nell'incubatrice. Assicurarsi che il coperchio dell'incubatrice sia dotato di una finestra di vetro per consentire il controllo dei parametri interni dell'incubatrice senza doverla aprire (Figura 1).
2. Dopo aver ricevuto le uova del giorno 0 da pulcini bianchi livornesi selezionati da Lohman da un fornitore di uova certificato di laboratorio, pulire la superficie dei gusci con carta umidificata e asciugarli immediatamente.
   NOTA: Poiché la membrana del guscio d'uovo è porosa, è possibile utilizzare acqua sterilizzata in autoclave per pulire le superfici delle uova e controllare l'umidità all'interno dell'incubatrice al fine di ridurre al minimo i rischi di contaminazione.
3. Etichettare le uova utilizzando un pennarello (ad es. data e numero di uova).
4. Incubare le uova con l'estremità appuntita rivolta verso il basso e ruotarle per consentire lo sviluppo della CAM. Ruotare manualmente le uova di 180° due o tre volte al giorno o utilizzare un rotatore automatico.
   NOTA: Per garantire che le uova vengano effettivamente ruotate, il guscio dell'uovo può essere contrassegnato con una "X" e una "O" sui due lati laterali opposti utilizzando una matita o un pennarello. La finestra di vetro nel coperchio dell'incubatrice consente di controllare la rotazione delle uova senza aprire il dispositivo.

3. Aprire il guscio d'uovo il giorno 3 di DE

NOTA: Una finestra rettangolare viene realizzata nel guscio d'uovo il giorno 3 di ED.

1. Preparare la cappa a flusso laminare per lavorare in condizioni sterili. Posizionare i seguenti strumenti sotto il cofano e disinfettarli con etanolo al 70% (se non già sterilizzati):
   -Portauova
   -Candela a uovo o fonte di luce fredda focale
   -Marcatore
   -Perno dritto sterile
   -Ago sterile da 19 G
   -Siringa sterile da 5 mL
   -Lama per sega a traforo
   -Pinza sterile
   -Nastro adesivo
2. Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posto sotto il cofano e spegni il rotatore delle uova.
3. Al buio, identifica la sacca d'aria dell'uovo posizionando la candela dell'uovo (o la fonte di luce fredda focale) contro il guscio dell'uovo. La sacca d'aria è localizzata all'estremità smussata dell'uovo. Usa un pennarello per individuare il centro della sacca d'aria sul guscio d'uovo.
4. Accendi le luci. Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo dove viene segnato ruotando delicatamente uno spillo dritto sterile. Di solito è sufficiente una piccola apertura di circa 1 mm di diametro.
   NOTA: Fare attenzione a non spingere lo spillo fino in fondo attraverso l'uovo. Se ciò accade, scarta l'uovo.
5. Collegare un ago sterile da 19 G a una siringa sterile da 5 ml.
6. Al buio, individuare il sacco vitellino utilizzando la candela dell'uovo (o una fonte di luce fredda focale) e forare l'uovo attraverso il foro praticato al punto 3.4 con l'ago sterile da 19 G inclinato a 45° verso il fondo dell'uovo; Fare molta attenzione a non rompere il sacco vitellino. Aspirare tra 1,5-2 mL di albume per staccare il CAM dal guscio, quindi chiudere il foro con un pezzo di nastro adesivo.
   NOTA: Se il sacco vitellino viene interrotto durante l'aspirazione, il liquido aspirato nella siringa sarà di colore giallo anziché trasparente (albume). In tal caso, sostituire l'ago e la siringa. Se viene aspirata una quantità relativamente grande di tuorlo d'uovo, può mettere a repentaglio la vitalità dell'embrione.
7. Accendi le luci. Posiziona l'uovo orizzontalmente e disegna una finestra rettangolare di 1 cm x 1,5 cm con un pennarello. Non ingrandire la finestra rispetto alla larghezza abituale del nastro adesivo standard.
8. Tieni l'uovo in una mano e sega delicatamente la finestra precedentemente disegnata nel guscio dell'uovo usando una lama per sega a traforo. Assicurarsi che il guscio non si rompa e non tagliare fino al CAM depresso. Soffiare regolarmente per rimuovere polvere e detriti del guscio.
9. Far scorrere la pinza sterile sotto il pezzo rettangolare del guscio segato e afferrarla abilmente per rimuoverla in modo pulito senza danneggiare il CAM. Inoltre, scartare la membrana esterna bianca per poter vedere l'embrione e la sua CAM.
   NOTA: Se un po' di polvere o detriti di guscio d'uovo cadono sul CAM, è possibile rimuoverlo utilizzando una pinza sterile, facendo molta attenzione a non strappare il CAM.
10. Identificare gli ovuli embrionati vitali. Sono distinguibili dal loro albume chiaro e dall'anello vascolare intorno all'embrione, dove a volte può essere rilevato un battito cardiaco anche in questa fase (giorno 3 della DE). Scartare gli embrioni non fecondati o morti.
11. Posiziona del nastro adesivo sulla finestra appena creata per evitare la disidratazione. Assicurati di piegare un'estremità su se stessa per facilitare la rimozione.
12. Rimetti l'uovo nell'incubatrice con la finestra aperta rivolta verso l'alto e il nastro adesivo che non tocca il CAM. Usa un pezzo di carta piegato o parte della griglia per uova per evitare che l'uovo rotoli. Assicurarsi che il vassoio rotante sia spento.
13. Ripetere i passaggi 3.2-3.12 per aprire le uova rimanenti.

4. Innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato nella CAM

NOTA: Il trapianto alla CAM dovrebbe idealmente essere iniziato tra i giorni 7-10 della DE.

1. Scongelare le strisce corticali ovariche crioconservate sotto la cappa a flusso laminare seguendo il protocollo descritto altrove³⁰.
2. Tagliare le strisce corticali in tre frammenti di 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizzare un pezzo come controllo non innestato e gli altri due per lo xenotrapianto per 1 giorno o 6 giorni.
   NOTA: Se è disponibile una quantità sufficiente di tessuto, lavorare in duplicato.
3. Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posizionato sotto il cofano, con la finestra rivolta verso l'alto.
4. Stacca il nastro adesivo dalla finestra e assicurati che l'embrione sia vitale. In questa fase, gli embrioni vitali sono caratterizzati da un'ampia vascolarizzazione, un albume chiaro, un battito cardiaco visibile e un certo movimento embrionale.
5. Preparare il sito di innesto traumatizzando delicatamente una piccola area della CAM posando una striscia di 1 cm² di carta sterile per lenti estratta con etere sulla superficie epiteliale e rimuovendola immediatamente.
   NOTA: La CAM è una barriera impenetrabile a meno che la membrana non sia stata traumatizzata dall'asportazione della parte peridermica superiore del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale. Questa tecnica migliora anche il processo di rivascolarizzazione attivando la guarigione delle ferite. Se la carta sterile estratta con etere rimane troppo a lungo sulla CAM, la membrana potrebbe aderire alla carta della lente e strapparsi. Se ciò accade, scarta l'uovo.
6. Afferrare una striscia corticale ovarica congelata e scongelata (4 mm x 2 mm x 1 mm) con una pinza microchirurgica e posizionarla sulla CAM traumatizzata con il lato midollare contro la CAM. Innestare un pezzo di tessuto per ovulo.
7. Copri la finestra con del nastro adesivo e rimetti con cura l'uovo nell'incubatrice. Assicurati che l'apertura del guscio d'uovo sia in posizione verticale e che l'uovo sia sicuro.
8. Ripetere i passaggi 4.1-4.7 per l'innesto di tutti i tessuti rimanenti.
   NOTA: Gli impianti devono essere controllati ogni giorno di innesto per valutare la vitalità dell'embrione e monitorare i cambiamenti nel sistema vascolare.

5. Raccolta degli innesti

NOTA: Gli xenotrapianti devono essere prelevati al più tardi entro il 17° giorno di DE, poiché il sistema immunitario dell'embrione diventa maturo e competente a partire dal 18° giorno.

1. Posiziona l'uovo su una griglia e ingrandisci la finestra nel guscio dell'uovo per consentire una migliore visualizzazione dell'innesto e una più facile manipolazione.
2. Valutare macroscopicamente l'innesto, e prestare particolare attenzione alla reazione vascolare della CAM nei confronti dell'innesto. Scatta fotografie o video digitali per la registrazione.
3. Afferrare il tessuto o la CAM circostante con una pinza e utilizzare le forbici o un bisturi per asportare con attenzione l'innesto dalla CAM.
   NOTA: Gli innesti vengono ricoperti da un secondo strato di CAM intorno al 3° giorno dell'innesto e alla fine vengono incapsulati. Potrebbero anche essersi spostati all'interno dell'uovo entro il 6° giorno, rendendo difficile il loro recupero in alcuni casi.
4. Analizzare i tessuti asportati con qualsiasi metodo appropriato per l'esperimento dato. Nel presente studio, pezzi di tessuto sono stati fissati in paraformaldeide, inclusi in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina seguendo i passaggi descritti di seguito:
   1. Fissare i frammenti in paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporarli in paraffina utilizzando un dispositivo di inclusione automatica con i passaggi indicati nella Tabella 1.
   2. Lasciare i blocchi incorporati in paraffina per una notte a 4°C prima di tagliarli in sezioni spesse 5 μm con un microtomo.
   3. Stendere le sezioni di tessuto su un vetrino posto su una piastra calda (30 °C) e lasciarle asciugare per 2 ore, seguite da 24 ore in forno a 37 °C.
   4. Successivamente, colorare i vetrini con ematossilina ed eosina seguendo un protocollo descritto altrove³¹. Successivamente, digitalizzare i campioni utilizzando uno scanner per vetrini e analizzarli utilizzando un software di analisi delle immagini.

Risultati

Tassi di sopravvivenza degli embrioni di pulcino
Il tasso di sopravvivenza dell'embrione dal windowing (giorno 3 di PS) all'innesto di tessuto ovarico (giorno 7 di PS) è stato del 79% (33/42). Poiché la percentuale di uova embrionate al giorno 0 non è nota, sono state ordinate uova soprannumerarie al giorno 0 di galline bianche livornesi selezionate da Lohman per garantire che fosse disponibile un numero sufficiente di uova embrionate per l'innesto. Un totale di 23 ovuli vitali al giorno 7 sono sta...

Discussione

La parte più impegnativa del protocollo qui descritto è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albume al fine di staccare il CAM dal guscio d'uovo prima di creare una finestra. L'applicazione di una pressione eccessiva può provocare una penetrazione eccessiva o addirittura rompere e distruggere l'uovo, causando danni irreversibili alla CAM e alla sua vascolarizzazione. Per ridurre al minimo gli errori durante i tentativi iniziali di separare la CAM, si consiglia vivamente di esercitarsi a praticare piccoli for...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution