מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

Summary

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח מודל קסנוגרפטינג של קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM) עבור רקמת שחלה אנושית ומדגימים את יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

Abstract

שימור והשתלת רקמת שחלות היא אסטרטגיה יעילה לשימור פוריות, אך יש לה חסרון עיקרי אחד, והוא אובדן זקיקים מסיבי המתרחש זמן קצר לאחר ההשתלה מחדש עקב הפעלת זקיק חריגה ומוות. מכרסמים הם מודלים לבחינת הפעלת זקיקים, אך העלות, הזמן והשיקולים האתיים הופכים לאוסרים יותר ויותר, ובכך מניעים את הפיתוח של חלופות. מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של האפרוחים (CAM) אטרקטיבי במיוחד, בהיותו זול ושומר על כשל חיסוני טבעי עד היום ה -17 לאחר ההפריה, מה שהופך אותו לאידיאלי ללמוד קסנוגרפטינג לטווח קצר של רקמת שחלה אנושית. ה- CAM הוא גם מאוד וסקולרי ונמצא בשימוש נרחב כמודל לחקר אנגיוגנזה. זה נותן לו יתרון יוצא דופן על פני מודלים במבחנה ומאפשר לחקור מנגנונים המשפיעים על תהליך אובדן זקיק מוקדם לאחר השתלה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לתאר את הפיתוח של מודל קסנוגרפטינג CAM עבור רקמת שחלה אנושית, עם תובנות ספציפיות לגבי יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

Introduction

הביקוש לשימור פוריות להתוויות אונקולוגיות ושפרות, כמו גם מסיבות חברתיות, גדל באופן דרמטי בעשורים האחרונים. עם זאת, טיפולים שונים המשמשים לריפוי מחלות ממאירות ולא ממאירות רעילים מאוד לגונדות ויכולים לגרום לאי ספיקת שחלות מוקדמת יאטרוגנית, מה שמוביל בסופו של דבר לאי פוריות¹. טכניקות מבוססות לשימור פוריות כוללות שימור בהקפאת עוברים, ויטריפיקציה של ביציות לא בשלות או בוגרות, ושימור בהקפאה של רקמת שחלה ^2,3,4. הקפאת רקמת שחלה היא האפשרות היחידה הזמינה לשימור פוריות אצל נערות לפני גיל ההתבגרות או נשים הזקוקות לטיפול מיידי בסרטן. שיקום התפקוד האנדוקריני לאחר השתלת רקמת שחלה מתרחש ביותר מ-95% מהנבדקות, כאשר שיעורי לידות החי נעים בין 18% ל-42%^5,6,7,8,9.

למרות שהשתלת רקמת שחלה קפואה ומופשרת הוכחה כמוצלחת, עדיין יש מקום לשיפור. ואכן, כאשר שברי קליפת המוח בשחלות מושתלים ללא אנסטומוזה וסקולרית, הם חווים תקופה של היפוקסיה שבמהלכה מתרחשת revascularization השתל 10,11,12. הרוב המכריע של המחקרים שחקרו השתלת רקמת שחלה אנושית השתמשו במודל קסנוגרפטינג, שבו רקמת שחלה מושתלת בעכברות מדוכאות חיסון. הרה-וסקולריזציה המלאה של הקסנוגרפטים אורכת כ-10 ימים, כאשר הן כלי המארח והן כלי השתל תורמים להיווצרות כלי דם פונקציונליים 12,13,14. בסביבות 50%-90% מרזרבת הזקיק אובדת בחלון היפוקסי זה לפני השלמת רה-וסקולריזציה של השתל 10,15,16. הוצע מאוד כי אובדן זקיקים מסיבי זה מתרחש הן באמצעות מוות ישיר של זקיקים, כפי שמודגם על ידי ירידה במספר הזקיקים המוחלט שנותר לאחר השתלה, והן על ידי הפעלת צמיחת זקיקים קדמונית, כפי שעולה משינויים בפרופורציות הזקיקים לקראת שיעורים מוגברים של גידול זקיקים^17,18.

באופן מעניין, עבודות מחקר קודמות שהשתמשו ברקמות שחלות שונות של בעלי חיים שהושתלו בקרום כוריאואלנטואי אפרוח (CAM), שיש לו מבנה המחקה את אתר ההשתלה הטיפוסי של הצפק, דיווחו על עיכוב של הפעלת זקיק ספונטנית, כאשר רזרבת הזקיק הראשונית נשארת שלמה עד 10 ימים 19,20,21,22. הצוות שלנו הוכיח בעבר כי השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת ל-CAM היוותה גישה אמינה לחקר השתלת רקמת שחלה אנושית בשלביה האיסכמיים הראשונים²³ ולאחרונה הראה כי שיטת השתלה זו הצליחה לנטרל את הפעלת זקיק²⁴.

מודל CAM מושך במיוחד לא רק בגלל שביציות זולות בהרבה מעכברות, אלא גם בגלל האופי הווסקולרי מאוד של CAM, המאפשר לבחון את הקשר בין הפעלת זקיקים לבין רה-וסקולריזציה של שתל השחלות. מערכת העופות היא, אכן, אחת הדרכים הנפוצות והמגוונות ביותר לחקר אנגיוגנזה²⁵. התפתחות עובר אפרוח (ED) אורכת 21 יום עד הבקיעה, וה-CAM נוצר בתוך 4-5 הימים הראשונים באמצעות איחוי האלנטואי והכוריון²⁶. יש לציין כי עובר האפרוח הוא פונדקאי חיסוני באופן טבעי עד היום ה-17 של ED, כך שניתן לבצע ניסויים בקסנוגרפטינג ללא כל סיכון לדחיית השתל^27,28. יתר על כן, גישת מודל CAM אינה מעלה כל חשש אתי או משפטי במונחים של החוק האירופי²⁹, מה שהופך אותו חלופה אטרקטיבית למודלים אחרים של בעלי חיים. באשר לתנאי הרבייה, עוברי אפרוחים זקוקים רק לאינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עם לחות אוויר יחסית של 40%-60%. דרישות ניסוי מוגבלות אלה מפחיתות באופן משמעותי את עלויות המחקר בהשוואה לשימוש בעכברים מדוכאי חיסון.

הפרוטוקול המוצג כאן נועד לתאר את הפיתוח של מודל קסנוגרפטינג CAM עבור רקמת שחלה אנושית ולספק תובנות ספציפיות לגבי יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל וכדאיות הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים. פרוטוקול זה יכול להיות בעל עניין רב לחקר המנגנונים מאחורי אובדן זקיק מוקדם לאחר השתלה ולחקר ההשפעה של מספר גורמים (גורמי גדילה, הורמונים וכו ') על תופעה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

השימוש ברקמה אנושית אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה הקתולית של לוביין. המטופלות נתנו את הסכמתן מדעת בכתב לשימוש ברקמת השחלה שלהן למטרות מחקר.

1. הזמנת יום 0 ביציות בעלות סיכוי גבוה לעבור

1. מצאו ספק מוסמך של ביצי לגהורן לבנות שנבחר על ידי לוהמן ברמת מעבדה, המדווח על שיעורים גבוהים של ביציות עובריות, התלוי בעיקר בגיל האפרוחים.

2. הכנת הביצים לדגירה;

1. לפני הגעת הביצים, יש להרכיב ולאזן את אינקובטור הביצים לטמפרטורה של 37°C בלחות אוויר יחסית של 40%-60%. עקוב אחר הטמפרטורה ולחות האוויר על ידי הכנסת מדחום ומד לחות לאינקובטור. ודא שמכסה האינקובטור מצויד בחלון זכוכית כדי לאפשר לבדוק את הפרמטרים הפנימיים של האינקובטור מבלי לפתוח אותו (איור 1).
2. לאחר שקיבלו את היום 0 ביצים מאפרוחי לגהורן לבנים שנבחרו על ידי לוהמן מספק ביצים מוסמך במעבדה, נקו את פני הקליפות בנייר לחות וייבשו אותן מיד.
   הערה: מכיוון שקרום קליפת הביצה נקבובי, ניתן להשתמש במים אוטוקלאביים לניקוי משטחי ביצים ולבקרת לחות בתוך האינקובטור על מנת למזער את סיכוני הזיהום.
3. תייגו את הביצים באמצעות סמן (למשל, תאריך ומספר ביצה).
4. דוגרים על הביצים כשהקצה המחודד פונה כלפי מטה, ומסובבים אותן כדי לאפשר ל-CAM להתפתח. סובבו ידנית את הביצים ב-180° פעמיים עד שלוש פעמים ביום או השתמשו במסובב אוטומטי.
   הערה: על מנת לוודא שהביצים אכן מסובבות, ניתן לסמן את קליפת הביצה באותיות "X" ו-"O" בשני הצדדים הצדיים המנוגדים באמצעות עיפרון או טוש. חלון הזכוכית במכסה האינקובטור מאפשר לבדוק את סיבוב הביצים מבלי לפתוח את המכשיר.

3. פתיחת קליפת הביצה ביום השלישי של ED

הערה: חלון מלבני נעשה בקליפת הביצה ביום 3 של ED.

1. הכינו את מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית על מנת לעבוד בתנאים סטריליים. הניחו את המכשירים הבאים מתחת למכסה המנוע, וחיטאו אותם באתנול 70% (אם לא עבר חיטוי כבר):
   - מתלה ביצים
   - נר ביצים או מקור אור קר מוקד
   -סמן
   - סיכה סטרילית ישרה
   -מחט סטרילית 19 גרם
   -5 מ"ל מזרק סטרילי
   - להב מסור גלילה
   -מלקחיים סטריליים
   - סרט הדבקה
2. מעבירים ביצה אחת מהאינקובטור למתלה הביצים שמונח מתחת למכסה המנוע, ומכבים את מסובב הביצים.
3. בחושך, זהו את כיס האוויר של הביצה על ידי הנחת נר הביצה (או מקור אור קר מוקדי) כנגד קליפת הביצה. כיס האוויר ממוקם בקצה הקהה של הביצה. השתמשו בטוש כדי לאתר את מרכז כיס האוויר על קליפת הביצה.
4. הדליקו את האורות. עשו חור קטן בקליפת הביצה, שם היא מסומנת על ידי סיבוב עדין של סיכה ישרה סטרילית. פתח זעיר בקוטר של כ-1 מ"מ מספיק בדרך כלל.
   הערה: היזהרו לא לדחוף את הסיכה עד הביצה. אם זה קורה, השליכו את הביצה.
5. חבר מחט סטרילית של 19 גרם למזרק סטרילי של 5 מ"ל.
6. בחושך, אתר את שק החלמון באמצעות נר הביצה (או מקור אור קר מוקדי), ונקב את הביצה דרך החור שנוצר בשלב 3.4 עם מחט סטרילית 19 G בזווית של 45° לכיוון תחתית הביצה; היזהרו מאוד לא לשבש את שק החלמון. שואפים בין 1.5-2 מ"ל של אלבומן כדי לנתק את CAM מן הקליפה, ולאחר מכן לסגור את החור עם חתיכת סרט דבק.
   הערה: אם שק החלמון משובש במהלך השאיפה, הנוזל השואף במזרק יהיה בצבע צהוב ולא שקוף (אלבומן). אם זה קורה, להחליף את המחט ואת מזרק. אם נשאבת כמות גדולה יחסית של חלמון ביצה, הדבר עלול לסכן את יכולת הקיום של העובר.
7. הדליקו את האורות. מניחים את הביצה בצורה אופקית, ומציירים בטוש חלון מלבני בגודל 1X1.5 ס"מ. אין להגדיל את החלון מהרוחב הרגיל של סרט הדבקה סטנדרטי.
8. החזיקו את הביצה ביד אחת, וראו בעדינות את החלון ששורטט קודם לכן לתוך קליפת הביצה באמצעות להב מסור גלילה. ודא כי הקליפה אינה נסדקת ולא לחתוך כל הדרך עד CAM מדוכא. נשפו באופן קבוע כדי להסיר אבק פגזים ופסולת.
9. החליקו מלקחיים סטריליים מתחת לחתיכה המלבנית של הקליפה המנוסרת, ואחזו במיומנות כדי להסיר אותה בצורה נקייה מבלי לפגוע ב- CAM. בנוסף, השליכו את קרום הקליפה החיצונית הלבנה כדי שתוכלו לראות את העובר ואת ה-CAM שלו.
   הערה: אם אבק קליפות ביצים או פסולת נופלים על CAM, ניתן להסיר אותו באמצעות מלקחיים סטריליים, נזהר מאוד לא לקרוע את CAM.
10. זהה ביציות עובריות בנות קיימא. ניתן להבחין בהם על ידי האלבומן השקוף שלהם וטבעת כלי הדם סביב העובר, שם לב פועם עשוי לפעמים להיות מזוהה אפילו בשלב זה (יום 3 של ED). יש להשליך עוברים לא מופרים או מתים.
11. הניחו סרט הדבקה על החלון החדש שנוצר כדי למנוע התייבשות. הקפד לקפל קצה אחד מעל עצמו כדי להקל על ההסרה.
12. החזירו את הביצה לאינקובטור כשהחלון הפתוח פונה כלפי מעלה והקלטת לא נוגעת ב-CAM. השתמשו בפיסת נייר מקופלת או בחלק ממדף הביצים כדי למנוע מהביצה להתגלגל. ודא שהמגש המסתובב כבוי.
13. חזור על שלבים 3.2-3.12 כדי לפתוח את הביציות הנותרות.

4. השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת ל-CAM

הערה: השתלה ל- CAM צריכה להתחיל באופן אידיאלי בין הימים 7-10 של ED.

1. הפשירו רצועות קליפת המוח של השחלות תחת מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית בהתאם לפרוטוקול המתואר במקום אחר³⁰.
2. חותכים את רצועות קליפת המוח לשלושה שברים של 4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ. השתמש בחתיכה אחת כבקרה ללא השתלה ובשתיים האחרות לקסנוגרפטינג למשך יום אחד או 6 ימים.
   הערה: אם יש מספיק רקמה זמינה, עבוד בכפילות.
3. מעבירים ביצה אחת מהאינקובטור למתלה הביצים הממוקם מתחת למכסה המנוע, כשהחלון פונה כלפי מעלה.
4. קלפו את הסרט מהחלון, וודאו שהעובר בר-קיימא. בשלב זה, עוברים בני קיימא כוללים כלי דם נרחבים, אלבומן שקוף, פעימות לב נראות לעין ותנועה מסוימת של העובר.
5. הכן את אתר ההשתלה על ידי טראומה עדינה של אזור קטן של CAM על ידי הנחת רצועה של 1 ס"מ² של נייר עדשה סטרילי Ether-extracted על משטח האפיתל והסרתו מיד.
   הערה: ה- CAM הוא מחסום בלתי חדיר אלא אם כן הממברנה עברה טראומה על ידי הסרת החלק ההיקפי העליון של שכבת האפיתל הכפולה, והותירה את שכבת הבסיס שלמה. טכניקה זו גם משפרת את תהליך revascularization על ידי הפעלת ריפוי פצע. אם נייר העדשה הסטרילי שחולץ מאתר נשאר על ה-CAM זמן רב מדי, הממברנה עלולה להידבק לנייר העדשה ולהיקרע. אם זה קורה, השליכו את הביצה.
6. אחזו ברצועה אחת של קליפת המוח השחלתית שהוקפאה והופשרה (4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ) בעזרת מלקחיים מיקרוכירורגיים, והניחו אותה על ה-CAM שעבר טראומה עם הצד המדולרי כנגד ה-CAM. להשתיל חתיכת רקמה אחת לכל ביצה.
7. מכסים את החלון בסרט דבק, ומחזירים בזהירות את הביצה לאינקובטור. ודאו שפתח קליפת הביצה זקוף והביצה בטוחה.
8. חזור על שלבים 4.1-4.7 להשתלת כל הרקמות הנותרות.
   הערה: יש לבדוק את השתלים בכל יום השתלה כדי להעריך את כדאיות העובר ולעקוב אחר שינויים בכלי הדם.

5. קצירת השתלים

הערה: Xenografts יש לקצור לכל המאוחר עד יום 17 של ED, שכן המערכת החיסונית של העובר הופך בוגר ומוכשר מהיום 18.

1. הניחו את הביצה על מתלה, והגדילו את החלון בקליפת הביצה כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של השתל ומניפולציה קלה יותר.
2. להעריך את השתל באופן מקרוסקופי, ולשים לב במיוחד לתגובה וסקולרית של CAM כלפי השתל. צלם תמונות דיגיטליות או סרטונים לפרוטוקול.
3. אחזו את הרקמה או את ה-CAM שמסביבה במלקחיים, והשתמשו במספריים או באזמל כדי להוציא את השתל מה-CAM בזהירות.
   הערה: השתלים מתכסים בשכבה שנייה של CAM בסביבות היום השלישי של ההשתלה ובסופו של דבר הופכים לעטופים. ייתכן גם שהם נעו בתוך הביצה ביום 6, מה שמקשה על שליפתם במקרים מסוימים.
4. לנתח את הרקמות שנכרתו בכל שיטה המתאימה לניסוי הנתון. במחקר הנוכחי, חלקי רקמה היו קבועים בפרפורמלדהיד, משובצים בפרפין ומוכתמים בהמטוקסילין ואוזין בעקבות השלבים המתוארים להלן:
   1. תקן את השברים בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות, והטמע אותם בפרפין באמצעות התקן הטבעה אוטומטי עם השלבים המוזכרים בטבלה 1.
   2. השאירו את הקוביות המשובצות בפרפין למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C לפני שתחתכו אותן למקטעים בעובי 5 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום.
   3. מורחים את חלקי הרקמה על מגלשת זכוכית המונחת על צלחת חמה (30 מעלות צלזיוס), ומשאירים אותם להתייבש במשך 2 שעות, ואחריו 24 שעות בתנור ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. לאחר מכן, הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין ובאאוסין בהתאם לפרוטוקול המתואר במקום אחר³¹. לאחר מכן, הפוך את הדגימות לדיגיטליות באמצעות סורק שקופיות, ונתח אותן באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שיעורי הישרדות עוברי אפרוחים
שיעור הישרדות העוברים מחלון (יום 3 של ED) להשתלת רקמת שחלה (יום 7 של ED) היה 79% (33/42). מכיוון שאחוז הביציות המועברות ביום 0 אינו ידוע, נצטוו מספר על 0 ביצים מתרנגולות לגהורן לבנות שנבחרו על ידי לוהמן כדי להבטיח שיהיו מספיק ביצים עובריות זמינות להשתלה. בסך הכל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול המתואר כאן הוא יצירת החור הקטן הדרוש לשאיפת האלבומן על מנת לנתק את ה- CAM מקליפת הביצה לפני יצירת חלון. הפעלת לחץ רב מדי עלולה לגרום לחדירת יתר או אפילו לסדוק ולהרוס את הביצית, ולגרום נזק בלתי הפיך ל- CAM ולכלי הדם שלה. כדי לצמצם את הטעויות למינימום במהלך הניסיונות ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution