Modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) como ferramenta para o estudo do transplante de tecido ovariano

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia de membrana corioalantóica (CAM) para tecido ovariano humano e demonstramos a eficácia da técnica, o tempo de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.

Resumo

A criopreservação e o transplante de tecido ovariano são uma estratégia eficaz para preservar a fertilidade, mas têm uma grande desvantagem, a perda maciça de folículos que ocorre logo após o reimplante devido à ativação anormal dos folículos e morte. Os roedores são modelos de referência para investigar a ativação dos folículos, mas o custo, o tempo e as considerações éticas estão se tornando cada vez mais proibitivos, impulsionando o desenvolvimento de alternativas. O modelo de membrana corioalantóide de pintinhos (CAM) é particularmente atraente, sendo barato e mantendo a imunodeficiência natural até o 17º dia pós-fertilização, tornando-o ideal para o estudo de xenoenxertia de curto prazo de tecido ovariano humano. A MAC também é altamente vascularizada e tem sido amplamente utilizada como modelo para explorar a angiogênese. Isso lhe confere uma notável vantagem sobre os modelos in vitro e permite a investigação dos mecanismos que afetam o processo de perda precoce dos folículos pós-enxerto. O protocolo aqui descrito visa descrever o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia CAM para tecido ovariano humano, com conhecimentos específicos sobre a eficácia da técnica, o período de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias.

Introdução

A demanda pela preservação da fertilidade por indicações oncológicas e benignas, bem como razões sociais, aumentou dramaticamente nas últimas décadas. No entanto, vários tratamentos utilizados para curar doenças malignas e não malignas são altamente tóxicos para as gônadas e podem resultar em insuficiência ovariana prematura iatrogênica, levando à infertilidade¹. Técnicas estabelecidas para preservação da fertilidade incluem criopreservação de embriões, vitrificação de oócitos imaturos ou maduros e criopreservação de tecido ovariano ^2,3,4. O congelamento do tecido ovariano é a única opção disponível para preservar a fertilidade em meninas pré-púberes ou mulheres que necessitam de terapia imediata contra o câncer. A restauração da função endócrina após o transplante de tecido ovariano ocorre em mais de 95% das pacientes, com taxas de nascidos vivos variando de 18% a 42%5,6,7,8,9.

Embora o transplante de tecido ovariano congelado descongelado tenha se mostrado bem-sucedido, ainda há espaço para melhorias. De fato, à medida que fragmentos da cortical ovariana são transplantados sem anastomose vascular, eles experimentam um período de hipóxia durante o qual ocorre a revascularização do enxerto10,11,12. A grande maioria dos estudos que investigam o transplante de tecido ovariano humano tem utilizado um modelo de xenoenxerto, no qual o tecido ovariano é transplantado para camundongos imunodeficientes. A revascularização completa dos xenoenxertos leva em torno de 10 dias, com os vasos do hospedeiro e do enxerto contribuindo para a formação de vasos funcionais12,13,14. Cerca de 50%-90% da reserva folicular é perdida durante essa janela hipóxica antes da conclusão da revascularização do enxerto 10,15,16. Tem sido fortemente sugerido que essa perda maciça de folículos ocorre tanto pela morte direta dos folículos, demonstrada pela diminuição do número absoluto de folículos deixados após a enxertia, quanto pela ativação do crescimento dos folículos primordiais, como indicado pelas mudanças nas proporções dos folículos em direção ao aumento das taxas de folículos em crescimento^17,18.

Curiosamente, trabalhos anteriores utilizando vários tecidos ovarianos de animais enxertados na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos, que tem constituição mimetizando o local típico de enxertia do peritônio, relataram a inibição da ativação espontânea dos folículos, com a reserva primordial do folículo permanecendo intacta por até 10 dias 19,20,21,22 . Nossa equipe demonstrou anteriormente que o enxerto de tecido ovariano humano congelado descongelado para CAM constituiu uma abordagem confiável para investigar o transplante de tecido ovariano humano em seus primeiros estágios isquêmicos23 e, recentemente, mostrou que esse método de enxertia foi capaz de neutralizar a ativação folicular²⁴.

O modelo CAM é especialmente atraente não só porque os óvulos são muito mais baratos do que os camundongos, mas também devido à natureza altamente vascularizada das MAC, permitindo examinar a associação entre ativação de folículos e revascularização do enxerto ovariano. O sistema aviário é, de fato, uma das formas mais comuns e versáteis de estudar a angiogênese²⁵. O desenvolvimento embrionário (DE) de pintinhos leva 21 dias até a eclosão, e a CAM é formada nos primeiros 4-5 dias através da fusão do alantois e córion²⁶. Notadamente, o embrião de pintinho é um hospedeiro naturalmente imunodeficiente até o 17º dia de DE, de modo que experimentos de xenoenxertia podem ser realizados sem qualquer risco de rejeição do enxerto^27,28. Além disso, a abordagem do modelo CAM não suscita quaisquer preocupações éticas ou jurídicas em termos do direito europeu²⁹, tornando-se uma alternativa atractiva a outros modelos animais. No que diz respeito às condições de reprodução, os embriões de pintinhos necessitam apenas de uma incubadora fixada a 37 °C com uma humidade relativa do ar de 40%-60%. Esses requisitos limitados de experimentação reduzem significativamente os custos da pesquisa em comparação com o uso de camundongos imunodeficientes.

O protocolo aqui apresentado tem como objetivo descrever o desenvolvimento de um modelo de xenoenxertia CAM para tecido ovariano humano e fornecer informações específicas sobre a eficácia da técnica, o período de tempo de revascularização do enxerto e a viabilidade tecidual ao longo de um período de enxertia de 6 dias. Este protocolo pode ser de grande interesse para investigar os mecanismos por trás da perda precoce de folículos pós-enxertia e estudar o impacto de vários agentes (fatores de crescimento, hormônios, etc.) sobre este fenômeno.

Protocolo

O uso de tecido humano foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Católica de Lovaia. As pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para o uso do tecido ovariano para fins de pesquisa.

1. Ordenar o dia 0 ovos que são altamente prováveis de serem embrionados

1. Encontre um fornecedor certificado de ovos Leghorn brancos selecionados em laboratório Lohman que relata altas taxas de ovos embrionados, o que depende principalmente da idade dos pintinhos.

2. Preparação dos ovos para incubação

1. Antes da chegada dos ovos, montar e equilibrar a incubadora de ovos a 37 °C em 40%-60% de umidade relativa do ar. Monitore a temperatura e a umidade do ar inserindo um termômetro e higrômetro na incubadora. Certifique-se de que a tampa da incubadora esteja equipada com uma janela de vidro que permita verificar os parâmetros internos da incubadora sem ter que abri-la (Figura 1).
2. Tendo recebido o dia 0 ovos de pintos brancos Leghorn selecionados por Lohman de um fornecedor certificado de ovos de nível laboratorial, limpe a superfície das cascas com papel umidificado e seque-as imediatamente.
   OBS: Como a membrana da casca do ovo é porosa, a água autoclavada pode ser usada para limpar a superfície dos ovos e controlar a umidade dentro da incubadora, a fim de minimizar os riscos de contaminação.
3. Rotule os ovos usando um marcador (por exemplo, data e número do ovo).
4. Incube os ovos com a extremidade pontiaguda virada para baixo e gire-os para permitir que o CAM se desenvolva. Gire manualmente os ovos em 180° duas a três vezes por dia ou use um rotador automático.
   NOTA: A fim de garantir que os ovos estão realmente sendo girados, a casca do ovo pode ser marcada com um "X" e "O" nos dois lados laterais opostos usando um lápis ou marcador. A janela de vidro na tampa da incubadora permite verificar a rotação dos ovos sem abrir o dispositivo.

3. Abertura da casca do ovo no dia 3 da DE

NOTA: Uma janela retangular é feita na casca do ovo no dia 3 de ED.

1. Prepare a capela de fluxo laminar para trabalhar em condições estéreis. Coloque os seguintes instrumentos sob o capô e desinfete-os em etanol 70% (se ainda não estiverem esterilizados):
   -Prateleira de ovos
   -Vela de ovo ou fonte de luz fria focal
   -Marcador
   -Pino reto estéril
   -Agulha estéril 19 G
   -5 ml de seringa estéril
   -Lâmina de serra de rolagem
   -Pinça estéril
   -Fita adesiva
2. Transfira um ovo da incubadora para a prateleira de ovos colocada sob o capô e desligue o rotador de ovos.
3. No escuro, identifique a bolsa de ar do ovo colocando a vela do ovo (ou fonte de luz fria focal) contra a casca do ovo. A bolsa de ar está localizada na extremidade romba do ovo. Use um marcador para identificar o centro da bolsa de ar na casca do ovo.
4. Acenda as luzes. Faça um pequeno orifício na casca do ovo onde ele é marcado girando suavemente um pino reto estéril. Uma pequena abertura de cerca de 1 mm de diâmetro é geralmente suficiente.
   NOTA: Tenha cuidado para não empurrar o pino até o ovo. Se isso acontecer, descarte o ovo.
5. Conecte uma agulha estéril de 19 G a uma seringa estéril de 5 mL.
6. No escuro, localize o saco vitelínico usando o veleiro de ovo (ou fonte focal de luz fria) e puncione o ovo através do orifício feito na etapa 3.4 com a agulha estéril de 19 G angulada a 45° em direção ao fundo do ovo; tome muito cuidado para não atrapalhar o saco vitelino. Aspirar entre 1,5-2 mL de albumina para desprender a CAM da concha e, em seguida, fechar o orifício com um pedaço de fita adesiva.
   NOTA: Se o saco vitelínico for interrompido durante a aspiração, o líquido aspirado na seringa será de cor amarela em vez de transparente (albumina). Se isso acontecer, substitua a agulha e a seringa. Se uma quantidade relativamente grande de gema de ovo é sugada, isso pode comprometer a viabilidade do embrião.
7. Acenda as luzes. Coloque o ovo horizontalmente e desenhe uma janela retangular medindo 1 cm x 1,5 cm com um marcador. Não torne a janela maior do que a largura habitual da fita adesiva padrão.
8. Segure o ovo em uma das mãos e gentilmente viu a janela previamente desenhada na casca do ovo usando uma lâmina de serra de rolagem. Certifique-se de que a casca não racha e não corte até o CAM deprimido. Sopre regularmente para remover o pó da casca e detritos.
9. Deslize pinças estéreis sob a peça retangular da concha serrada e segure habilmente para removê-la de forma limpa sem danificar o CAM. Além disso, descarte a membrana da casca externa branca para poder ver o embrião e seu CAM.
   OBS: Caso algum pó ou detrito de casca de ovo caia sobre o CAM, este poderá ser retirado com pinça estéril, tomando muito cuidado para não rasgar o CAM.
10. Identificar óvulos embrionados viáveis. Eles são discerníveis por sua albumina clara e o anel vascular ao redor do embrião, onde um coração batendo às vezes pode ser detectado mesmo nesta fase (dia 3 de ED). Descarte embriões não fertilizados ou mortos.
11. Coloque fita adesiva sobre a janela recém-criada para evitar a desidratação. Certifique-se de dobrar uma extremidade sobre si mesma para facilitar a remoção.
12. Coloque o ovo de volta na incubadora com a janela aberta virada para cima e a fita não tocando no CAM. Use um pedaço de papel dobrado ou parte da prateleira de ovos para impedir que o ovo role. Verifique se a bandeja giratória está desligada.
13. Repita os passos 3.2-3.12 para abrir os ovos restantes.

4. Enxertia de tecido ovariano humano congelado descongelado na CAM

NOTA: O transplante para a CAM deve idealmente ser iniciado entre os dias 7-10 de DE.

1. Descongelar tiras corticais ovarianas criopreservadas sob a capela de fluxo laminar seguindo o protocolo descrito anteriormente³⁰.
2. Cortar as tiras corticais em três fragmentos de 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizar uma peça como controle não enxertado e as outras duas para xenoenxertia por 1 dia ou 6 dias.
   NOTA: Se houver tecido suficiente disponível, trabalhe em duplicata.
3. Transfira um ovo da incubadora para a prateleira de ovos posicionada sob o capô, com a janela voltada para cima.
4. Retire a fita da janela e garanta que o embrião seja viável. Nesta fase, os embriões viáveis apresentam extensa vasculatura, albumina clara, batimento cardíaco visível e algum movimento embrionário.
5. Prepare o local de enxerto traumatizando suavemente uma pequena área da CAM, colocando uma tira de 1 cm² de papel de lente estéril extraído com éter na superfície epitelial e removendo-a imediatamente.
   NOTA: A CAM é uma barreira impenetrável a menos que a membrana tenha sido traumatizada pela remoção da parte peridérmica superior da dupla camada epitelial, deixando a camada basal intacta. Essa técnica também potencializa o processo de revascularização, ativando a cicatrização de feridas. Se o papel da lente extraído com éter estéril permanecer no CAM por muito tempo, a membrana pode aderir ao papel da lente e rasgar. Se isso acontecer, descarte o ovo.
6. Segurar uma tira cortical ovariana congelada descongelada (4 mm x 2 mm x 1 mm) com pinça microcirúrgica e colocá-la na MAC traumatizada com a face medular contra a MAC. Enxertar um pedaço de tecido por ovo.
7. Cubra a janela com fita adesiva e devolva cuidadosamente o ovo à incubadora. Certifique-se de que a abertura da casca do ovo fique na vertical e o ovo esteja seguro.
8. Repetir os passos 4.1-4.7 para a enxertia de todos os tecidos restantes.
   OBS: Os implantes devem ser verificados a cada dia de enxertia para avaliar a viabilidade embrionária e monitorar as alterações na vasculatura.

5. Retirada dos enxertos

NOTA: Os xenoenxertos devem ser colhidos o mais tardar até o dia 17 de DE, uma vez que o sistema imunológico do embrião torna-se maduro e competente a partir do dia 18.

1. Coloque o ovo em uma prateleira e amplie a janela na casca do ovo para permitir uma melhor visualização do enxerto e facilitar a manipulação.
2. Avaliar macroscopicamente o enxerto e prestar especial atenção à reação vascular da CAM em relação ao enxerto. Tire fotografias ou vídeos digitais para registro.
3. Segure o tecido ou a CAM circundante com pinça e use uma tesoura ou um bisturi para excisar o enxerto da CAM cuidadosamente.
   NOTA: Os enxertos ficam cobertos com uma segunda camada de CAM por volta do 3º dia de enxertia e eventualmente se tornam encapsulados. Eles também podem ter se movido dentro do ovo no dia 6, dificultando a recuperação em alguns casos.
4. Analisar os tecidos excisados por qualquer método apropriado para o experimento dado. No presente estudo, os pedaços de tecido foram fixados em paraformaldeído, incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina, seguindo os passos descritos a seguir:
   1. Fixar os fragmentos em paraformaldeído a 4% por 24 h e incorporá-los em parafina utilizando um dispositivo de incorporação automática com os passos mencionados na Tabela 1.
   2. Deixe os blocos embebidos em parafina durante a noite a 4°C antes de cortá-los em seções de 5 μm de espessura com um micrótomo.
   3. Espalhe os cortes de tecido em uma lâmina de vidro colocada em uma placa quente (30 °C) e deixe-os secar por 2 h, seguido de 24 h em um forno a 37 °C.
   4. Em seguida, corar as lâminas com hematoxilina e eosina, seguindo protocolo descrito neste^{documento 31}. Posteriormente, digitalize as amostras usando um scanner de lâminas e analise-as usando um software de análise de imagens.

Resultados

Taxas de sobrevivência de embriões de pintinhos
A taxa de sobrevivência do embrião desde o janelamento (dia 3 de DE) até o enxerto de tecido ovariano (dia 7 de DE) foi de 79% (33/42). Uma vez que a porcentagem de ovos embrionados do dia 0 é desconhecida, ovos supranumerários do dia 0 de galinhas brancas Leghorn selecionadas por Lohman foram encomendados para garantir que ovos embrionados suficientes estivessem disponíveis para enxertia. Um total de 23 ovos viáveis do dia 7 foram usados para e...

Discussão

A parte mais desafiadora do protocolo descrito aqui é fazer o pequeno orifício necessário para aspirar a albumina a fim de desprender a CAM da casca do ovo antes de criar uma janela. Aplicar muita pressão pode resultar em superpenetração ou até mesmo rachar e destruir o ovo, causando danos irrevogáveis à CAM e sua vasculatura. Para minimizar os erros durante as tentativas iniciais de separar o CAM, é altamente recomendável praticar fazer pequenos buracos na casca do ovo de ovos não fertilizados comprados em s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution