El modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) como herramienta para estudiar el trasplante de tejido ovárico

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para desarrollar un modelo de xenoinjerto de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo para tejido ovárico humano y demostramos la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.

Resumen

La criopreservación y el trasplante de tejido ovárico es una estrategia eficaz para preservar la fertilidad, pero tiene un inconveniente importante, a saber, la pérdida masiva de folículos que se produce poco después de la reimplantación debido a la activación anormal del folículo y la muerte. Los roedores son modelos de referencia para investigar la activación de los folículos, pero el costo, el tiempo y las consideraciones éticas son cada vez más prohibitivas, lo que impulsa el desarrollo de alternativas. El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es particularmente atractivo, ya que es económico y mantiene la inmunodeficiencia natural hasta el día 17 después de la fertilización, lo que lo hace ideal para estudiar el xenoinjerto a corto plazo de tejido ovárico humano. La MCA también está altamente vascularizada y se ha utilizado ampliamente como modelo para explorar la angiogénesis. Esto le da una ventaja notable sobre los modelos in vitro y permite la investigación de los mecanismos que afectan el proceso temprano de pérdida de folículos posterior al injerto. El protocolo descrito en este documento tiene como objetivo describir el desarrollo de un modelo de xenoinjerto CAM para tejido ovárico humano, con información específica sobre la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.

Introducción

La demanda de preservación de la fertilidad por indicaciones oncológicas y benignas, así como por razones sociales, ha aumentado drásticamente en las últimas décadas. Sin embargo, varios tratamientos utilizados para curar enfermedades malignas y no malignas son altamente tóxicos para las gónadas y pueden resultar en insuficiencia ovárica prematura iatrogénica, lo que en última instancia conduce a la infertilidad¹. Las técnicas establecidas para la preservación de la fertilidad incluyen la criopreservación de embriones, la vitrificación de ovocitos inmaduros o maduros y la criopreservación de tejido ovárico ^2,3,4. La congelación de tejido ovárico es la única opción disponible para preservar la fertilidad en niñas o mujeres prepúberes que requieren tratamiento inmediato contra el cáncer. La restauración de la función endocrina tras el trasplante de tejido ovárico se produce en más del 95% de los sujetos, con tasas de nacidos vivos que oscilan entre el 18% y el 42%5,6,7,8,9.

Aunque el trasplante de tejido ovárico congelado-descongelado ha demostrado ser exitoso, todavía hay margen de mejora. De hecho, como los fragmentos corticales ováricos son trasplantados sin anastomosis vascular, experimentan un período de hipoxia durante el cual se produce la revascularización del injerto 10,11,12. La gran mayoría de los estudios que investigan el trasplante de tejido ovárico humano han utilizado un modelo de xenoinjerto, en el que el tejido ovárico se trasplanta a ratones inmunodeficientes. La revascularización completa de los xenoinjertos tarda alrededor de 10 días, y tanto el huésped como los vasos del injerto contribuyen a la formación de vasos funcionales 12,13,14. Alrededor del 50-90% de la reserva folicular se pierde durante esta ventana hipóxica antes de la finalización de la revascularización del injerto 10,15,16. Se ha sugerido fuertemente que esta pérdida masiva de folículos ocurre tanto a través de la muerte directa del folículo, como lo demuestra una disminución en el número absoluto de folículos que quedan después del injerto, como la activación del crecimiento del folículo primordial, como lo indican los cambios en las proporciones de los folículos hacia mayores tasas de crecimiento de folículos^17,18.

Curiosamente, trabajos de investigación anteriores que utilizaron varios tejidos ováricos animales injertados en la membrana corioalantoidea de pollo (CAM), que tiene una constitución que imita el sitio de injerto típico del peritoneo, han reportado la inhibición de la activación espontánea del folículo, con la reserva folicular primordial que permanece intacta hasta por 10 días 19,20,21,22. Nuestro equipo demostró previamente que el injerto de tejido ovárico humano congelado-descongelado a MCA constituía un enfoque fiable para investigar el trasplante de tejido ovárico humano en sus primeros estadios isquémicos²³ y recientemente demostró que este método de injerto era capaz de contrarrestar la activación del folículo²⁴.

El modelo CAM es especialmente atractivo no solo porque los óvulos son mucho más baratos que los ratones, sino también por la naturaleza altamente vascularizada de la CAM, lo que permite examinar la asociación entre la activación del folículo y la revascularización del injerto ovárico. El sistema aviar es, de hecho, una de las formas más comunes y versátiles de estudiar la angiogénesis²⁵. El desarrollo embrionario de pollito (DE) tarda 21 días hasta la eclosión, y la CAM se forma dentro de los primeros 4-5 días a través de la fusión del alantois y el corion²⁶. Cabe destacar que el embrión de pollo es un huésped naturalmente inmunodeficiente hasta el día 17 de la disfunción eréctil, por lo que se pueden realizar experimentos de xenoinjerto sin ningún riesgo de rechazo del injerto^27,28. Además, el enfoque del modelo CAM no plantea ninguna preocupación ética o legal en términos de la legislación europea²⁹, lo que lo convierte en una alternativa atractiva a otros modelos animales. Con respecto a las condiciones de cría, los embriones de pollo solo necesitan una incubadora ajustada a 37 °C con una humedad relativa del aire del 40%-60%. Estos requisitos limitados de experimentación reducen significativamente los costos de investigación en comparación con el uso de ratones inmunodeficientes.

El protocolo presentado en este documento tiene como objetivo describir el desarrollo de un modelo de xenoinjerto CAM para tejido ovárico humano y proporcionar información específica sobre la efectividad de la técnica, el marco temporal de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días. Este protocolo podría ser de gran interés para investigar los mecanismos que subyacen a la pérdida temprana de folículos post-injerto y estudiar el impacto de varios agentes (factores de crecimiento, hormonas, etc.) en este fenómeno.

Protocolo

El uso de tejido humano fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Católica de Lovaina. Las pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de su tejido ovárico con fines de investigación.

1. Pedir óvulos del día 0 que tienen una alta probabilidad de estar embrionados

1. Encuentre un proveedor certificado de huevos blancos de Leghorn seleccionados por Lohman de grado de laboratorio que informe altas tasas de huevos embrionados, lo que depende principalmente de la edad de los pollitos.

2. Preparación de los huevos para la incubación

1. Antes de la llegada de los huevos, ensamble y equilibre la incubadora de huevos a 37 °C con una humedad relativa del aire del 40% al 60%. Controle la temperatura y la humedad del aire insertando un termómetro y un higrómetro en la incubadora. Asegúrese de que la tapa de la incubadora esté equipada con una ventana de vidrio para permitir verificar los parámetros internos de la incubadora sin tener que abrirla (Figura 1).
2. Después de haber recibido los huevos del día 0 de pollitos blancos de Leghorn seleccionados por Lohman de un proveedor de huevos certificado de laboratorio, limpie la superficie de las cáscaras con papel humedecido y séquelas inmediatamente.
   NOTA: Dado que la membrana de la cáscara del huevo es porosa, se puede usar agua esterilizada en autoclave para limpiar las superficies de los huevos y controlar la humedad dentro de la incubadora con el fin de minimizar los riesgos de contaminación.
3. Etiquete los huevos con un marcador (por ejemplo, fecha y número de huevo).
4. Incuba los huevos con el extremo puntiagudo hacia abajo y gíralos para permitir que se desarrolle la CAM. Gire manualmente los huevos 180° dos o tres veces al día o use un rotador automático.
   NOTA: Para asegurarse de que los huevos se están girando, la cáscara del huevo se puede marcar con una "X" y una "O" en los dos lados laterales opuestos con un lápiz o marcador. La ventana de vidrio en la tapa de la incubadora permite verificar la rotación de los huevos sin abrir el dispositivo.

3. Abrir la cáscara de huevo en el día 3 de la disfunción eréctil

NOTA: Se hace una ventana rectangular en la cáscara de huevo en el día 3 de la disfunción eréctil.

1. Prepare la campana de flujo laminar para trabajar en condiciones estériles. Coloque los siguientes instrumentos debajo del capó y desinféctelos en etanol al 70% (si aún no están esterilizados):
   -Estante para huevos
   -Vela de huevo o fuente de luz fría focal
   -Marcador
   -Pasador recto estéril
   -Aguja estéril de 19 G
   -Jeringa estéril de 5 ml
   -Hoja de sierra de marquetería
   -Pinzas estériles
   -Cinta adhesiva
2. Transfiera un huevo de la incubadora a la rejilla para huevos colocada debajo de la campana y apague el rotador de huevos.
3. En la oscuridad, identifique la bolsa de aire del huevo colocando el vela de huevos (o fuente de luz fría focal) contra la cáscara del huevo. La bolsa de aire se localiza en el extremo romo del huevo. Usa un marcador para señalar el centro de la bolsa de aire en la cáscara de huevo.
4. Enciende las luces. Haga un pequeño agujero en la cáscara del huevo donde se marca girando suavemente un alfiler recto estéril. Una pequeña abertura de alrededor de 1 mm de diámetro suele ser suficiente.
   NOTA: Tenga cuidado de no empujar el alfiler hasta el final del huevo. Si esto sucede, deseche el huevo.
5. Conecte una aguja estéril de 19 g a una jeringa estéril de 5 ml.
6. En la oscuridad, localice el saco vitelino con el vela de huevos (o fuente de luz fría focal) y perfore el huevo a través del orificio hecho en el paso 3.4 con la aguja estéril de 19 G en un ángulo de 45° hacia el fondo del huevo; Tenga mucho cuidado de no alterar el saco vitelino. Aspire entre 1,5-2 ml de albúmina para separar el CAM de la carcasa y luego cierre el orificio con un trozo de cinta adhesiva.
   NOTA: Si el saco vitelino se altera durante la aspiración, el líquido aspirado en la jeringa será de color amarillo en lugar de transparente (albúmina). Si esto sucede, reemplace la aguja y la jeringa. Si se succiona una cantidad relativamente grande de yema de huevo, puede poner en peligro la viabilidad del embrión.
7. Enciende las luces. Coloca el huevo horizontalmente y dibuja una ventana rectangular de 1 cm x 1,5 cm con un rotulador. No haga que la ventana sea más grande que el ancho habitual de la cinta adhesiva estándar.
8. Sostenga el huevo con una mano y corte suavemente la ventana previamente dibujada en la cáscara del huevo con una hoja de sierra de marquetería. Asegúrese de que la cáscara no se agriete y no corte hasta el CAM deprimido. Sople regularmente para eliminar el polvo y los escombros de la concha.
9. Deslice las pinzas estériles debajo de la pieza rectangular de la carcasa aserrada y agárrela hábilmente para quitarla limpiamente sin dañar la CAM. Además, deseche la membrana blanca de la capa externa para poder ver el embrión y su MCA.
   NOTA: Si cae algo de polvo o residuos de cáscara de huevo sobre el CAM, se puede eliminar con pinzas estériles, teniendo mucho cuidado de no rasgar el CAM.
10. Identificar óvulos embrionados viables. Son discernibles por su albúmina clara y el anillo vascular alrededor del embrión, donde a veces se puede detectar un corazón latiendo incluso en esta etapa (día 3 de la disfunción eréctil). Deseche los embriones no fertilizados o muertos.
11. Coloque cinta adhesiva sobre la ventana recién creada para evitar la deshidratación. Asegúrese de doblar un extremo sobre sí mismo para facilitar la extracción.
12. Vuelva a colocar el huevo en la incubadora con la ventana abierta hacia arriba y la cinta sin tocar el CAM. Use un pedazo de papel doblado o parte del estante para huevos para evitar que el huevo ruede. Asegúrese de que la bandeja giratoria esté apagada.
13. Repita los pasos 3.2-3.12 para abrir los huevos restantes.

4. Injerto de tejido ovárico humano congelado-descongelado en la MCA

NOTA: Lo ideal es que el trasplante a la MCA se inicie entre los días 7 y 10 de la disfunción eréctil.

1. Descongelar las tiras corticales ováricas criopreservadas bajo la campana de flujo laminar siguiendo el protocolo descrito en otro artículo³⁰.
2. Corta las tiras corticales en tres fragmentos de 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizar una pieza como control no injertado y las otras dos para xenoinjerto durante 1 día o 6 días.
   NOTA: Si hay suficiente tejido disponible, trabaje por duplicado.
3. Transfiera un huevo de la incubadora a la rejilla para huevos colocada debajo de la campana, con la ventana hacia arriba.
4. Retire la cinta de la ventana y asegúrese de que el embrión sea viable. En esta etapa, los embriones viables presentan una vasculatura extensa, una albúmina clara, un latido cardíaco visible y algo de movimiento embrionario.
5. Prepare el sitio del injerto traumatizando suavemente una pequeña área de la MCA colocando una tira de^{1 cm 2} de papel estéril para lentes extraído con éter sobre la superficie epitelial y retirándola inmediatamente.
   NOTA: La MCA es una barrera impenetrable a menos que la membrana haya sido traumatizada por la extirpación de la parte peridérmica superior de la doble capa epitelial, dejando intacta la capa basal. Esta técnica también potencia el proceso de revascularización activando la cicatrización de heridas. Si el papel estéril extraído con éter permanece demasiado tiempo en el CAM, la membrana puede adherirse al papel de lente y rasgarse. Si esto sucede, deseche el huevo.
6. Sujete una tira cortical ovárica congelada-descongelada (4 mm x 2 mm x 1 mm) con pinzas microquirúrgicas y colóquela sobre la MCA traumatizada con el lado medular contra la MCA. Injertar una pieza de tejido por huevo.
7. Cubra la ventana con cinta adhesiva y devuelva con cuidado el huevo a la incubadora. Asegúrese de que la abertura de la cáscara del huevo quede en posición vertical y que el huevo esté seguro.
8. Repita los pasos 4.1-4.7 para el injerto de todos los tejidos restantes.
   NOTA: Los implantes deben revisarse cada día de injerto para evaluar la viabilidad del embrión y controlar los cambios en la vasculatura.

5. Recolección de los injertos

NOTA: Los xenoinjertos deben cosecharse a más tardar el día 17 de la disfunción eréctil, ya que el sistema inmunológico del embrión se vuelve maduro y competente a partir del día 18.

1. Coloque el huevo en una rejilla y amplíe la ventana en la cáscara del huevo para permitir una mejor visualización del injerto y una manipulación más fácil.
2. Evalúe el injerto macroscópicamente y preste especial atención a la reacción vascular de la MCA hacia el injerto. Tome fotografías o videos digitales para que conste.
3. Sujete el tejido o el MCA circundante con fórceps y use tijeras o un bisturí para extirpar el injerto del MCA con cuidado.
   NOTA: Los injertos se cubren con una segunda capa de CAM alrededor del día 3 del injerto y, finalmente, se encapsulan. También es posible que se hayan movido dentro del huevo en el día 6, lo que dificulta su recuperación en algunos casos.
4. Analice los tejidos extirpados por cualquier método apropiado para el experimento dado. En el presente estudio, las piezas de tejido se fijaron en paraformaldehído, se incluyeron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina siguiendo los pasos que se describen a continuación:
   1. Fijar los fragmentos en paraformaldehído al 4% durante 24 h e incrustarlos en parafina utilizando un dispositivo de inclusión automática siguiendo los pasos mencionados en la Tabla 1.
   2. Deje los bloques embebidos en parafina durante la noche a 4 °C antes de cortarlos en secciones de 5 μm de grosor con un micrótomo.
   3. Extienda las secciones de tejido en un portaobjetos de vidrio colocado en una placa caliente (30 °C) y déjelas secar durante 2 h, seguidas de 24 h en un horno a 37 °C.
   4. Posteriormente, tiñir los portaobjetos con hematoxilina y eosina siguiendo un protocolo descrito en otro lugar³¹. Posteriormente, digitalice las muestras con un escáner de diapositivas y analícelas con un software de análisis de imágenes.

Resultados

Tasas de supervivencia de embriones de pollo
La tasa de supervivencia embrionaria desde la ventana (día 3 de la DE) hasta el injerto de tejido ovárico (día 7 de la DE) fue del 79% (33/42). Dado que se desconoce el porcentaje de huevos embrionados del día 0, se ordenaron huevos supernumerarios del día 0 de gallinas blancas de Livorno seleccionadas por Lohman para garantizar que hubiera suficientes huevos embrionados disponibles para el injerto. Se utilizaron un total de 23 óvulos viables de día ...

Discusión

La parte más desafiante del protocolo descrito aquí es hacer el pequeño orificio necesario para aspirar la albúmina con el fin de separar el CAM de la cáscara del huevo antes de crear una ventana. La aplicación de demasiada presión puede provocar una sobrepenetración o incluso puede agrietar y destruir el óvulo, causando daños irrevocables a la CAM y su vasculatura. Para mantener los errores al mínimo durante los intentos iniciales de separar el CAM, se recomienda encarecidamente practicar haciendo pequeños a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution