Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken als Werkzeug zur Untersuchung der Transplantation von Eierstockgewebe

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung eines Xenotransplantatmodells für menschliches Ovarialgewebe und demonstrieren die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Zeitraum von 6 Tagen.

Zusammenfassung

Die Kryokonservierung und Transplantation von Eierstockgewebe ist eine wirksame Strategie zur Erhaltung der Fruchtbarkeit, hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich den massiven Follikelverlust, der kurz nach der Reimplantation aufgrund einer abnormalen Follikelaktivierung und des Todes auftritt. Nagetiere sind Benchmark-Modelle für die Untersuchung der Follikelaktivierung, aber die Kosten, der Zeitaufwand und die ethischen Überlegungen werden immer unerschwinglicher, was die Entwicklung von Alternativen vorantreibt. Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken ist besonders attraktiv, da es kostengünstig ist und die natürliche Immundefizienz bis zum Tag 17 nach der Befruchtung aufrechterhält, was es ideal für die Untersuchung der kurzfristigen Xenotransplantation von menschlichem Eierstockgewebe macht. Das CAM ist auch stark vaskularisiert und wurde häufig als Modell zur Erforschung der Angiogenese verwendet. Dies verschafft ihm einen bemerkenswerten Vorteil gegenüber In-vitro-Modellen und ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen, die den frühen Follikelverlustprozess nach der Transplantation beeinflussen. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben, mit spezifischen Einblicken in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen.

Einleitung

Die Nachfrage nach Fertilitätserhalt bei onkologischen und gutartigen Indikationen sowie aus sozialen Gründen ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen. Verschiedene Behandlungen, die zur Heilung von bösartigen und nicht-bösartigen Erkrankungen eingesetzt werden, sind jedoch hochtoxisch für die Keimdrüsen und können zu einer iatrogenen vorzeitigen Ovarialinsuffizienz führen, die letztendlich zu Unfruchtbarkeit führt¹. Zu den etablierten Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit gehören die Kryokonservierung von Embryonen, die Vitrifikation unreifer oder reifer Eizellen und die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ^2,3,4. Das Einfrieren von Eierstockgewebe ist die einzige verfügbare Option zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei präpubertären Mädchen oder Frauen, die eine sofortige Krebstherapie benötigen. Die Wiederherstellung der endokrinen Funktion nach einer Transplantation von Eierstockgewebe tritt bei über 95 % der Patientinnen auf, wobei die Lebendgeburtenraten zwischen 18 % und 42 % liegen5,6,7,8,9.

Obwohl sich die Transplantation von gefrorenem und aufgetautem Eierstockgewebe bewährt hat, gibt es noch Raum für Verbesserungen. Da die kortikalen Fragmente der Eierstöcke ohne vaskuläre Anastomose transplantiert werden, erleben sie eine Phase der Hypoxie, in der die Revaskularisierung des Transplantats stattfindet 10,11,12. Die überwiegende Mehrheit der Studien, die die Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe untersuchen, haben ein Xenografting-Modell verwendet, bei dem Eierstockgewebe an immundefiziente Mäuse transplantiert wird. Die vollständige Revaskularisation der Xenotransplantate dauert etwa 10 Tage, wobei sowohl die Wirts- als auch die Transplantatgefäße zur Bildung funktioneller Gefäße beitragen 12,13,14. Etwa 50%-90% der Follikelreserve gehen während dieses hypoxischen Fensters vor Abschluss der Revaskularisation des Transplantats verloren 10,15,16. Es wurde stark vermutet, dass dieser massive Follikelverlust sowohl durch den direkten Follikeltod, wie er sich in einer Abnahme der absoluten Follikelzahl nach der Transplantation zeigt, als auch durch die Aktivierung des primordialen Follikelwachstums auftritt, was durch Veränderungen der Follikelproportionen in Richtung erhöhter Wachstumsraten der Follikel angezeigt wird^17,18.

Interessanterweise haben frühere Forschungsarbeiten mit verschiedenen tierischen Eierstockgeweben, die auf die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens transplantiert wurden, die eine Konstitution hat, die die typische Transplantationsstelle des Peritoneums nachahmt, über die Hemmung der spontanen Follikelaktivierung berichtet, wobei die primordiale Follikelreserve bis zu 10 Tage intakt bleibt 19,20,21,22. Unser Team hat bereits gezeigt, dass die Transplantation von gefrorenem und aufgetautem menschlichem Ovarialgewebe in CAM einen zuverlässigen Ansatz für die Untersuchung der Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe in ihren ersten ischämischen Stadien darstellt²³ und kürzlich gezeigt, dass diese Transplantationsmethode in der Lage ist, der Follikelaktivierung entgegenzuwirken²⁴.

Das CAM-Modell ist besonders attraktiv, nicht nur, weil Eizellen viel billiger sind als Mäuse, sondern auch wegen der stark vaskularisierten Natur der CAM, die es ermöglicht, den Zusammenhang zwischen Follikelaktivierung und Revaskularisierung des Eierstocktransplantats zu untersuchen. Das Vogelsystem ist in der Tat eine der gebräuchlichsten und vielseitigsten Methoden zur Untersuchung der Angiogenese²⁵. Die Entwicklung des Kükenembryos (ED) dauert 21 Tage bis zum Schlüpfen, und das CAM wird innerhalb der ersten 4-5 Tage durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion²⁶ gebildet. Bemerkenswert ist, dass der Kükenembryo bis zum 17. Tag der ED ein von Natur aus immundefizienter Wirt ist, so dass Xenografting-Experimente ohne das Risiko einer Transplantatabstoßung durchgeführt werden können^27,28. Darüber hinaus wirft der CAM-Modellansatz keine ethischen oder rechtlichen Bedenken im Sinne des europäischen Rechts^{auf 29} und ist damit eine attraktive Alternative zu anderen Tiermodellen. In Bezug auf die Zuchtbedingungen benötigen Kükenembryonen nur einen auf 37 °C eingestellten Inkubator mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%-60%. Diese begrenzten Versuchsanforderungen reduzieren die Forschungskosten im Vergleich zur Verwendung von immundefizienten Mäusen erheblich.

Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben und spezifische Einblicke in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen der Revaskularisation des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen zu geben. Dieses Protokoll könnte von großem Interesse sein, um die Mechanismen hinter dem frühen Follikelverlust nach der Transplantation zu untersuchen und die Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe (Wachstumsfaktoren, Hormone usw.) auf dieses Phänomen zu untersuchen.

Protokoll

Die Verwendung von menschlichem Gewebe wurde vom Institutional Review Board der Katholischen Universität Löwen genehmigt. Die Patientinnen gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihres Eierstockgewebes zu Forschungszwecken.

1. Bestellung von Eizellen vom Tag 0, bei denen die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass sie embryoniert werden

1. Finden Sie einen zertifizierten, von Lohman ausgewählten Lieferanten von weißen Leghorn-Eiern in Laborqualität, der eine hohe Rate an embryonierten Eiern meldet, die in erster Linie vom Alter der Küken abhängt.

2. Vorbereitung der Eier für die Bebrütung

1. Vor der Ankunft der Eier den Eierbrutkasten zusammenbauen und auf 37 °C bei 40%-60% relativer Luftfeuchtigkeit ausbalancieren. Überwachen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit, indem Sie ein Thermometer und ein Hygrometer in den Inkubator einführen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel des Inkubators mit einem Glasfenster ausgestattet ist, damit die internen Parameter des Inkubators überprüft werden können, ohne ihn öffnen zu müssen (Abbildung 1).
2. Nachdem Sie die Tag-0-Eier von von Lohman ausgewählten weißen Leghorn-Küken von einem zertifizierten Eierlieferanten in Laborqualität erhalten haben, reinigen Sie die Oberfläche der Schalen mit befeuchtetem Papier und trocknen Sie sie sofort.
   HINWEIS: Da die Eierschalenmembran porös ist, kann autoklaviertes Wasser verwendet werden, um die Eieroberflächen zu reinigen und die Luftfeuchtigkeit im Inkubator zu kontrollieren, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren.
3. Beschriften Sie die Eier mit einem Marker (z. B. Datum und Einummer).
4. Bebrüten Sie die Eier mit dem spitzen Ende nach unten und drehen Sie sie, damit sich das CAM entwickeln kann. Drehen Sie die Eier zwei- bis dreimal täglich manuell um 180° oder verwenden Sie einen automatischen Rotator.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Eier tatsächlich gedreht werden, kann die Eierschale mit einem Bleistift oder Marker auf den beiden gegenüberliegenden Seitenseiten mit einem "X" und einem "O" markiert werden. Das Glasfenster im Deckel des Inkubators ermöglicht es, die Rotation der Eier zu überprüfen, ohne das Gerät zu öffnen.

3. Öffnen der Eierschale am 3. Tag der ED

HINWEIS: Ein rechteckiges Fenster wird am Tag 3 der ED in die Eierschale gegossen.

1. Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube so vor, dass sie unter sterilen Bedingungen arbeiten kann. Platzieren Sie die folgenden Instrumente unter der Haube und desinfizieren Sie sie in 70%igem Ethanol (falls nicht bereits sterilisiert):
   -Eierregal
   -Eierkerze oder fokale Kaltlichtquelle
   -Markierung
   -Steriler gerader Stift
   -Sterile 19 G Nadel
   -5 ml sterile Spritze
   -Dekupiersägeblatt
   -Sterile Pinzette
   -Klebeband
2. Legen Sie ein Ei aus dem Brutkasten in das Eierregal unter der Haube und schalten Sie den Eierrotator aus.
3. Identifiziere im Dunkeln die Lufteinschlüsse des Eies, indem du den Eierkerzenkerl (oder die Brennlichtquelle) an die Eierschale legst. Die Lufttasche befindet sich am stumpfen Ende des Eies. Verwende einen Marker, um die Mitte der Lufttasche auf der Eierschale zu lokalisieren.
4. Schalten Sie das Licht ein. Mache ein kleines Loch in die Eierschale, wo sie durch leichtes Drehen eines sterilen geraden Stecknadels markiert wird. Eine winzige Öffnung von etwa 1 mm Durchmesser ist in der Regel ausreichend.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, den Stift nicht ganz durch das Ei zu drücken. In diesem Fall das Ei wegwerfen.
5. Schließen Sie eine sterile 19-g-Nadel an eine sterile 5-ml-Spritze an.
6. Lokalisieren Sie im Dunkeln den Dottersack mit dem Eierkerzen (oder der Brennlichtquelle) und stechen Sie das Ei durch das in Schritt 3.4 entstandene Loch mit der sterilen 19-G-Nadel, die in einem Winkel von 45° zum Boden des Eies geneigt ist. Achten Sie darauf, den Dottersack nicht zu stören. Saugen Sie zwischen 1,5 und 2 ml Eiweiß an, um das CAM von der Hülle zu lösen, und verschließen Sie das Loch dann mit einem Stück Klebeband.
   HINWEIS: Wenn der Dottersack während der Aspiration unterbrochen wird, ist die angesaugte Flüssigkeit in der Spritze gelb und nicht transparent (Eiweiß). Tauschen Sie in diesem Fall die Nadel und die Spritze aus. Wenn eine relativ große Menge Eigelb aufgesaugt wird, kann dies die Lebensfähigkeit des Embryos gefährden.
7. Schalten Sie das Licht ein. Lege das Ei waagerecht hin und zeichne mit einem Filzstift ein rechteckiges Fenster mit den Maßen 1 cm x 1,5 cm. Machen Sie das Fenster nicht größer als die übliche Breite von Standardklebeband.
8. Halten Sie das Ei in einer Hand und sägen Sie das zuvor gezeichnete Fenster vorsichtig mit einem Dekupiersägeblatt in die Eierschale. Achten Sie darauf, dass die Schale nicht reißt und schneiden Sie nicht bis zum gedrückten CAM ein. Blasen Sie regelmäßig, um Schalenstaub und Schmutz zu entfernen.
9. Schieben Sie die sterile Pinzette unter das rechteckige Stück der gesägten Schale und fassen Sie sie geschickt an, um es sauber zu entfernen, ohne das CAM zu beschädigen. Werfen Sie zusätzlich die weiße äußere Schalenmembran ab, um den Embryo und seine CAM sehen zu können.
   HINWEIS: Wenn Eierschalenstaub oder Schmutz auf das CAM fällt, kann es mit einer sterilen Pinzette entfernt werden, wobei sehr darauf zu achten ist, dass das CAM nicht zerreißt.
10. Identifizierung lebensfähiger embryonierter Eizellen. Sie sind an ihrem klaren Eiweiß und dem Gefäßring um den Embryo zu erkennen, wo manchmal sogar in diesem Stadium (Tag 3 der ED) ein schlagendes Herz festgestellt werden kann. Nicht befruchtete oder tote Embryonen verwerfen.
11. Kleben Sie Klebeband über das neu geschaffene Fenster, um ein Austrocknen zu vermeiden. Achte darauf, dass du ein Ende über dich selbst klappst, um das Entfernen zu erleichtern.
12. Legen Sie das Ei mit dem geöffneten Fenster nach oben zurück in den Inkubator, ohne dass das Klebeband das CAM berührt. Verwende ein gefaltetes Stück Papier oder einen Teil des Eierrosts, um zu verhindern, dass das Ei rollt. Vergewissern Sie sich, dass das Drehfach ausgeschaltet ist.
13. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.12, um die restlichen Eier zu öffnen.

4. Transplantation von gefrorenem und aufgetautem menschlichem Eierstockgewebe in die CAM

HINWEIS: Die Transplantation in das CAM sollte idealerweise zwischen dem 7. und 10. Tag der ED eingeleitet werden.

1. Kryokonservierte kortikale Streifen der Eierstöcke unter der Laminar-Flow-Haube nach dem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll³⁰ auftauen.
2. Schneiden Sie die kortikalen Streifen in drei Fragmente von 4 mm x 2 mm x 1 mm. Verwenden Sie ein Stück als nicht transplantierte Kontrolle und die anderen beiden für die Xenotransplantation für 1 Tag oder 6 Tage.
   HINWEIS: Wenn genügend Gewebe vorhanden ist, in doppelter Ausführung arbeiten.
3. Geben Sie ein Ei aus dem Brutkasten in das Eierregal, das sich unter der Haube befindet, mit dem Fenster nach oben.
4. Ziehen Sie das Klebeband vom Fenster ab und stellen Sie sicher, dass der Embryo lebensfähig ist. In diesem Stadium zeichnen sich lebensfähige Embryonen durch ein ausgedehntes Gefäßsystem, ein klares Eiweiß, einen sichtbaren Herzschlag und eine gewisse Bewegung des Embryos aus.
5. Bereiten Sie die Transplantationsstelle vor, indem Sie einen kleinen Bereich des CAM sanft traumatisieren, indem Sie einen 1 cm² langen Streifen sterilen, etherextrahierten Linsenpapiers auf die Epitheloberfläche legen und sofort entfernen.
   HINWEIS: Die CAM ist eine undurchdringliche Barriere, es sei denn, die Membran wurde durch die Entfernung des oberen peridermalen Teils der Doppelepithelschicht traumatisiert, wobei die Basalschicht intakt bleibt. Diese Technik verbessert auch den Revaskularisierungsprozess, indem sie die Wundheilung aktiviert. Wenn das sterile, aus Ether extrahierte Linsenpapier zu lange auf dem CAM verbleibt, kann die Membran am Linsenpapier haften bleiben und reißen. In diesem Fall das Ei wegwerfen.
6. Fassen Sie einen gefroren-aufgetauten kortikalen Streifen der Ovarialrinde (4 mm x 2 mm x 1 mm) mit einer mikrochirurgischen Pinzette und legen Sie ihn mit der medullären Seite gegen das CAM auf das traumatisierte CAM. Transplantieren Sie ein Gewebestück pro Eizelle.
7. Decken Sie das Fenster mit Klebeband ab und legen Sie das Ei vorsichtig in den Brutkasten zurück. Achten Sie darauf, dass die Eierschalenöffnung aufrecht sitzt und das Ei sicher sitzt.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7 für die Transplantation aller verbleibenden Gewebe.
   HINWEIS: Die Implantate sollten an jedem Transplantationstag überprüft werden, um die Lebensfähigkeit des Embryos zu beurteilen und Veränderungen im Gefäßsystem zu überwachen.

5. Entnahme der Transplantate

HINWEIS: Xenotransplantate sollten spätestens am 17. Tag der ED entnommen werden, da das Immunsystem des Embryos ab dem 18. Tag reif und kompetent ist.

1. Legen Sie das Ei auf ein Gestell und vergrößern Sie das Fenster in der Eierschale, um eine bessere Visualisierung des Transplantats und eine einfachere Handhabung zu ermöglichen.
2. Beurteilen Sie das Transplantat makroskopisch und achten Sie besonders auf die vaskuläre Reaktion des CAM auf das Transplantat. Nehmen Sie digitale Fotos oder Videos für die Aufzeichnung auf.
3. Fassen Sie das Gewebe oder das umgebende CAM mit einer Pinzette an und verwenden Sie eine Schere oder ein Skalpell, um das Transplantat vorsichtig aus dem CAM zu entfernen.
   HINWEIS: Die Transplantate werden etwa am 3. Tag der Transplantation mit einer zweiten CAM-Schicht bedeckt und schließlich eingekapselt. Es kann auch sein, dass sie sich am 6. Tag in das Ei bewegt haben, was es in einigen Fällen schwierig macht, sie zu finden.
4. Analysieren Sie das herausgeschnittene Gewebe mit einer Methode, die für das jeweilige Experiment geeignet ist. In der vorliegenden Studie wurden Gewebestücke in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, wobei die folgenden Schritte befolgt wurden:
   1. Die Fragmente werden 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert und mit einer automatischen Einbettvorrichtung in Paraffin eingebettet, wobei die in Tabelle 1 genannten Schritte ausgeführt werden.
   2. Lassen Sie die in Paraffin eingebetteten Blöcke über Nacht bei 4 °C stehen, bevor Sie sie mit einem Mikrotom in 5 μm dicke Abschnitte schneiden.
   3. Die Gewebeschnitte auf einem Objektträger auf einer heißen Platte (30 °C) verteilen und 2 h trocknen lassen, gefolgt von 24 h im Ofen bei 37 °C.
   4. Anschließend färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin nach einem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll³¹. Anschließend digitalisieren Sie die Proben mit einem Objektträgerscanner und analysieren sie mit einer Bildanalysesoftware.

Ergebnisse

Überlebensraten von Kükenembryonen
Die Überlebensrate des Embryos vom Fenstering (Tag 3 der ED) bis zur Transplantation von Eierstockgewebe (Tag 7 der ED) betrug 79% (33/42). Da der prozentuale Anteil der embryonierten Tag-0-Eier unbekannt ist, wurden überzählige Tag-0-Eier von Lohman-selektierten weißen Leghorn-Hühnern bestellt, um sicherzustellen, dass genügend embryonierte Eizellen für die Transplantation zur Verfügung stehen. Insgesamt wurden 23 lebensfähige Eizellen am Tag 7 für die T...

Diskussion

Der schwierigste Teil des hier beschriebenen Protokolls besteht darin, das kleine Loch zu bohren, das zum Absaugen des Eiweißes erforderlich ist, um das CAM von der Eierschale zu lösen, bevor ein Fenster entsteht. Zu viel Druck kann zu einer übermäßigen Penetration führen oder sogar die Eizelle zerbrechen und zerstören, was zu einer unwiderruflichen Schädigung des CAM und seines Gefäßsystems führt. Um Fehler bei den ersten Versuchen, das CAM zu trennen, auf ein Minimum zu reduzieren, wird dringend empfohlen, d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution