난소 조직 이식을 연구하기 위한 도구로서의 병아리 맥락막 막(CAM) 모델

요약

여기에서는 인간 난소 조직을 위한 병아리 융모막 이식(CAM) 이종 이식 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안 조직 생존력을 입증합니다.

초록

난소 조직 동결 보존 및 이식은 가임력을 보존하는 효과적인 전략이지만 비정상적인 난포 활성화 및 사망으로 인해 재착상 직후 발생하는 대규모 난포 손실이라는 한 가지 주요 단점이 있습니다. 설치류는 난포 활성화를 조사하기 위한 벤치마크 모델이지만 비용, 시간 및 윤리적 고려 사항이 점점 더 엄격해지고 있으므로 대안 개발을 주도하고 있습니다. 병아리 융모막 형성막(CAM) 모델은 특히 매력적이며, 저렴하고 수정 후 17일까지 자연 면역 결핍을 유지하므로 인간 난소 조직의 단기 이종 이식을 연구하는 데 이상적입니다. CAM은 또한 혈관이 매우 풍부하며 혈관 신생을 탐구하기 위한 모델로 널리 사용되었습니다. 이것은 in vitro 모델에 비해 놀라운 이점을 제공하며 초기 이식 후 난포 손실 과정에 영향을 미치는 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안의 조직 생존력에 대한 구체적인 통찰력과 함께 인간 난소 조직을 위한 CAM 이종 이식 모델의 개발을 설명하는 것을 목표로 합니다.

서문

종양학적 및 양성 적응증과 사회적 이유에 대한 가임력 보존에 대한 요구는 최근 수십 년 동안 급격히 증가했습니다. 그러나 악성질환 및 비악성질환을 치료하기 위해 사용되는 다양한 치료법은 생식선에 독성이 강하여 의인성 조기 난소기능부전을 유발하여 궁극적으로 불임으로 이어질 수 있다¹. 가임력 보존을 위한 확립된 기술에는 배아 동결 보존, 미성숙 또는 성숙 난모세포 유리화, 난소 조직 동결 보존이 포함됩니다 ^2,3,4. 난소 조직 동결은 즉각적인 암 치료가 필요한 사춘기 이전 소녀 또는 여성의 가임력을 보존하기 위해 사용할 수 있는 유일한 옵션입니다. 난소 조직 이식 후 내분비 기능의 회복은 피험자의 95% 이상에서 발생하며, 출생률은 18%에서 42%에 이릅니다5,6,7,8,9.

냉동 해동된 난소 조직의 이식이 성공적인 것으로 입증되었지만 여전히 개선의 여지가 있습니다. 실제로, 난소 피질 조각은 혈관 문합 없이 이식될 때, 이식편 혈관재생술이 일어나는 저산소증 기간을 경험한다 10,11,12. 인간 난소 조직 이식을 조사한 대부분의 연구는 난소 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하는 이종 이식 모델을 사용했습니다. 이종이식의 완전한 혈관재생은 약 10일이 소요되며, 숙주 혈관과 이식편 혈관 모두 기능적 혈관 형성에 기여한다 12,13,14. 모낭 예비력의 약 50%-90%는 이식편 혈관재생술이 완료되기 전에 이 저산소 기간 동안 손실됩니다 10,15,16. 이러한 대규모 난포 손실은 이식 후 남는 절대 난포 수의 감소에 의해 입증되는 직접적인 난포 사멸과 모낭 성장 속도 증가에 대한 난포 비율의 변화로 나타나는 원시 난포 성장의 활성화를 통해 발생한다는 것이 강력하게 제안되었습니다^17,18.

흥미롭게도, 복막의 전형적인 이식 부위를 모방한 구조를 가진 병아리 융모막(CAM)에 이식된 다양한 동물 난소 조직을 사용한 이전 연구 결과, 원시 난포 예비군이 최대 10일 동안 손상되지 않은 상태로 자연 난포 활성화가 억제되는 것으로 보고되었습니다 19,20,21,22. 우리 팀은 이전에 동결-해동된 인간 난소 조직을 CAM에 이식하는 것이 첫 번째 허혈성 단계에서 인간 난소 조직 이식을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 구성한다는 것을 입증했으며(²³), 최근에는 이 이식 방법이 난포 활성화를 상쇄할 수 있음을 보여주었습니다(²⁴).

CAM 모델은 난자가 생쥐보다 훨씬 저렴할 뿐만 아니라 CAM의 혈관 특성이 높아 난포 활성화와 난소 이식편 혈관 재생술 사이의 연관성을 면밀히 조사할 수 있기 때문에 특히 매력적입니다. 조류 시스템은 실제로 혈관신생을 연구하는 가장 일반적이고 다재다능한 방법 중 하나이다²⁵. 병아리 배아 발달(ED)은 부화까지 21일이 걸리며, CAM은 알란토아와 융모막²⁶의 융합을 통해 처음 4-5일 이내에 형성됩니다. 특히, 병아리 배아는 ED의 17일째까지 자연적으로 면역 결핍 숙주이기 때문에, 이식 거부 반응의 위험 없이 이종이식 실험을 수행할 수 있다^27,28. 더욱이, CAM 모델 접근법은 유럽법²⁹ 측면에서 윤리적 또는 법적 문제를 제기하지 않기 때문에 다른 동물 모델에 대한 매력적인 대안이 될 수 있습니다. 번식 조건과 관련하여 병아리 배아는 상대 습도가 37%-40%인 60°C로 설정된 인큐베이터만 있으면 됩니다. 이러한 제한된 실험 요구 사항은 면역 결핍 마우스를 사용하는 것에 비해 연구 비용을 크게 줄입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 인간 난소 조직에 대한 CAM 이종 이식 모델의 개발을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술의 시간 프레임 및 6일 이식 기간 동안의 조직 생존력에 대한 구체적인 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 이식 후 초기 난포 손실의 메커니즘을 조사하고 이 현상에 대한 여러 물질(성장 인자, 호르몬 등)의 영향을 연구하는 데 큰 관심을 가질 수 있습니다.

프로토콜

인체 조직의 사용은 루뱅 가톨릭 대학교의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 환자들은 연구 목적으로 난소 조직을 사용하는 것에 대해 서면 동의서를 제출했습니다.

1. 배아 가능성이 높은 0일 계란 주문

1. 주로 병아리의 나이에 따라 달라지는 배아 계란의 비율이 높다고 보고하는 인증된 실험실 등급 Lohman이 선택한 흰색 Leghorn 계란 공급업체를 찾으십시오.

2. 부화를 위한 계란 준비

1. 알이 도착하기 전에 계란 인큐베이터를 조립하고 37%-40% 상대 공기 습도에서 60°C로 평형을 이룹니다. 온도계와 습도계를 인큐베이터에 삽입하여 온도와 공기 습도를 모니터링합니다. 인큐베이터의 뚜껑에 유리창이 장착되어 있어 인큐베이터를 열지 않고도 인큐베이터의 내부 매개변수를 확인할 수 있습니다(그림 1).
2. 인증된 실험실 등급 계란 공급업체로부터 Lohman이 선택한 흰색 Leghorn 병아리의 계란 0개를 받은 후 가습 종이로 껍질 표면을 청소하고 즉시 건조시킵니다.
   알림: 달걀 껍질 막은 다공성이기 때문에 오염 위험을 최소화하기 위해 고압멸균수를 사용하여 달걀 표면을 청소하고 인큐베이터 내부의 습도를 제어할 수 있습니다.
3. 마커(예: 날짜 및 달걀 번호)를 사용하여 달걀에 라벨을 붙입니다.
4. 뾰족한 끝이 아래를 향하도록 알을 부화시키고 CAM이 자랄 수 있도록 회전시킵니다. 하루에 두세 번 계란을 수동으로 180° 회전시키거나 자동 회전기를 사용하십시오.
   알림: 계란이 실제로 회전하고 있는지 확인하기 위해 연필이나 마커를 사용하여 계란 껍질의 반대쪽 두 측면에 "X"와 "O"를 표시할 수 있습니다. 인큐베이터 뚜껑의 유리창을 통해 장치를 열지 않고도 계란의 회전을 확인할 수 있습니다.

3. 발기부전 3일째 달걀 껍질 열기

알림: ED의 3일차에 달걀 껍질에 직사각형 창이 만들어집니다.

1. 멸균 조건에서 작업하기 위해 층류 후드를 준비합니다. 다음 기구를 후드 아래에 놓고 70% 에탄올로 소독합니다(아직 멸균되지 않은 경우).
   ● 달걀 선반
   -달걀 촛불 또는 초점 차가운 광원
   -마커
   ● 멸균 스트레이트 핀
   ● 멸균 19g 바늘
   -5mL 멸균 주사기
   ● 스크롤 톱 블레이드
   -멸균 집게
   ● 접착 테이프
2. 인큐베이터에서 후드 아래에 놓인 계란 선반으로 계란 1개를 옮기고 계란 회전기를 끕니다.
3. 어둠 속에서 달걀 캔들러(또는 초점 냉광원)를 달걀 껍질에 대고 달걀의 공기 주머니를 식별합니다. 에어 포켓은 달걀의 뭉툭한 끝에 있습니다. 마커를 사용하여 달걀 껍질의 공기 주머니 중앙을 정확히 찾아냅니다.
4. 조명을 켭니다. 멸균 된 직선 핀을 부드럽게 돌려 표시한 달걀 껍질에 작은 구멍을 뚫습니다. 일반적으로 직경 약 1mm의 작은 구멍으로 충분합니다.
   알림: 핀을 계란 끝까지 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 이런 일이 발생하면 계란을 버리십시오.
5. 멸균 19G 바늘을 멸균 5mL 주사기에 연결합니다.
6. 어둠 속에서 달걀 캔들러(또는 초점 냉광원)를 사용하여 난황낭을 찾고 멸균 3.4G 바늘이 달걀 바닥을 향해 45° 각도로 기울어진 19단계에서 만든 구멍을 통해 달걀에 구멍을 뚫습니다. 난황 주머니를 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오. 1.5-2mL의 알부민을 흡인하여 CAM을 쉘에서 분리한 다음 접착 테이프로 구멍을 막습니다.
   알림: 흡인 중에 난황낭이 파괴되면 주사기의 흡인된 액체가 투명하지 않고 노란색(알부민)이 됩니다. 이 경우 바늘과 주사기를 교체하십시오. 상대적으로 많은 양의 난황을 빨아들이면 배아의 생존 능력이 위태로워질 수 있습니다.
7. 조명을 켭니다. 달걀을 수평으로 놓고 마커로 1cm x 1.5cm 크기의 직사각형 창을 그립니다. 창을 표준 접착 테이프의 일반적인 너비보다 크게 만들지 마십시오.
8. 달걀을 한 손에 들고 스크롤 톱날을 사용하여 이전에 그려진 달걀 껍질 창을 부드럽게 보았습니다. 쉘이 깨지지 않도록 하고 함몰된 CAM까지 자르지 마십시오. 정기적으로 바람을 불어 껍질 먼지와 부스러기를 제거하십시오.
9. 멸균 집게를 톱질한 직사각형 조각 아래로 밀어 넣고 솜씨 좋게 잡아 CAM을 손상시키지 않고 깨끗하게 제거합니다. 또한 배아와 CAM을 볼 수 있도록 흰색 외피막을 버립니다.
   알림: 달걀 껍질 먼지나 부스러기가 CAM에 떨어지면 CAM이 찢어지지 않도록 각별히 주의하면서 멸균 집게를 사용하여 제거할 수 있습니다.
10. 생존 가능한 배아 난자를 식별합니다. 그들은 명확한 알부민과 배아 주위의 혈관 고리로 식별할 수 있으며, 이 단계(발기부전 3일차)에서도 때때로 심장 박동이 감지될 수 있습니다. 수정되지 않았거나 죽은 배아는 폐기하십시오.
11. 탈수를 방지하기 위해 새로 만든 창 위에 접착 테이프를 붙입니다. 쉽게 제거할 수 있도록 한쪽 끝을 접어야 합니다.
12. 열린 창이 위를 향하고 테이프가 CAM에 닿지 않도록 계란을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 접힌 종이나 계란 선반의 일부를 사용하여 계란이 굴러가는 것을 막으십시오. 회전 트레이가 꺼져 있는지 확인합니다.
13. 3.2-3.12단계를 반복하여 나머지 계란을 엽니다.

4. 냉동-해동된 인간 난소 조직을 CAM에 이식

알림: CAM에 대한 이식은 이상적으로 ED의 7-10일 사이에 시작해야 합니다.

1. 다른 곳에 설명된 프로토콜에 따라 층류 후드 아래의 냉동 보존된 난소 피질 스트립을 해동합니다³⁰.
2. 피질 스트립을 4mm x 2mm x 1mm의 세 조각으로 자릅니다. 한 조각은 비이식 대조군으로 사용하고 다른 두 조각은 1일 또는 6일 동안 이종 이식에 사용합니다.
   알림: 충분한 조직을 사용할 수 있는 경우 중복으로 작업하십시오.
3. 인큐베이터에서 창이 위를 향하도록 후드 아래에 있는 계란 선반으로 계란 하나를 옮깁니다.
4. 창문에서 테이프를 떼어내고 배아가 생존 가능한지 확인합니다. 이 단계에서 생존 가능한 배아는 광범위한 혈관 조직, 투명한 알부민, 눈에 보이는 심장 박동 및 일부 배아 움직임을 특징으로 합니다.
5. 멸균 에테르 추출 렌즈 종이를 상피 표면에 1cm² 스트립으로 놓고 즉시 제거하여 CAM의 작은 영역에 부드럽게 충격을 주어 이식 부위를 준비합니다.
   알림: CAM은 이중 상피층의 상부 피복 부분을 제거하여 막이 외상을 입지 않는 한 뚫을 수 없는 장벽입니다. 이 기술은 또한 상처 치유를 활성화하여 혈관 재생 과정을 향상시킵니다. 멸균 에테르 추출 렌즈 용지가 CAM에 너무 오래 남아 있으면 멤브레인이 렌즈 용지에 달라붙어 찢어질 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 계란을 버리십시오.
6. 미세 수술 겸자로 냉동 해동된 난소 피질 스트립(4mm x 2mm x 1mm) 하나를 잡고 수질이 CAM에 닿도록 외상을 입은 CAM에 놓습니다. 달걀 한 개당 티슈 한 조각을 접목합니다.
7. 접착 테이프로 창문을 덮고 계란을 조심스럽게 인큐베이터에 다시 넣습니다. 달걀 껍질 입구가 똑바로 세워져 있고 달걀이 고정되어 있는지 확인하십시오.
8. 나머지 모든 조직을 이식하기 위해 4.1-4.7단계를 반복합니다.
   참고: 임플란트는 배아 생존력을 평가하고 혈관 구조의 변화를 모니터링하기 위해 이식 날짜마다 확인해야 합니다.

5. 접목 수확

참고: 이종이식편은 배아의 면역 체계가 18일째부터 성숙하고 유능해지기 때문에 늦어도 발기부전 17일째까지 수확해야 합니다.

1. 달걀을 선반에 놓고 달걀 껍질의 창을 확대하여 접목을 더 잘 시각화하고 더 쉽게 조작할 수 있도록 합니다.
2. 이식편을 거시적으로 평가하고 이식편에 대한 CAM의 혈관 반응에 특히 주의하십시오. 기록을 위해 디지털 사진이나 비디오를 찍습니다.
3. 집게로 조직이나 주변 CAM을 잡고 가위나 메스를 사용하여 CAM에서 이식편을 조심스럽게 절제합니다.
   참고: 이식편은 이식 3일차에 CAM의 두 번째 층으로 덮이고 결국 캡슐화됩니다. 그들은 또한 6일째에 알 내부로 이동했을 수 있으며, 어떤 경우에는 회수하기 어려울 수 있습니다.
4. 주어진 실험에 적합한 방법으로 절제된 조직을 분석합니다. 본 연구에서 조직 조각은 파라포름알데히드, 파라핀 포매에 고정되고 아래에 설명된 단계에 따라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었습니다.
   1. 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 단편을 고정하고 표 1에 언급된 단계에 따라 자동 임베딩 장치를 사용하여 파라핀에 매립합니다.
   2. 파라핀이 함유된 블록을 4°C에서 하룻밤 동안 그대로 두었다가 마이크로톰으로 5μm 두께의 조각으로 자릅니다.
   3. 열판(30°C)에 놓인 유리 슬라이드에 조직 절편을 펴고 2시간 동안 건조시킨 다음 37°C의 오븐에서 24시간 동안 건조시킵니다.
   4. 그 후, 다른 곳에 설명된 프로토콜에 따라 헤마톡실린과 에오신으로 슬라이드를 염색합니다³¹. 그런 다음 슬라이드 스캐너를 사용하여 샘플을 디지털화하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

결과

병아리 배아 생존율
창구(발기부전 3일차)부터 난소 조직 이식(발기부전 7일차)까지의 배아 생존율은 79%(33/42)였다. 배아 0일 달걀의 비율은 알려져 있지 않기 때문에, 이식에 충분한 배아 달걀을 확보하기 위해 로먼이 선택한 흰 레그혼 닭의 0일 달걀을 과도하게 주문했습니다. 총 23개의 생존 가능한 7일차 난자가 이식에 사용되었으며, 그 중 하나는 처음 24시간 동안 죽었고, 그 결과 ...

토론

여기에 설명된 프로토콜에서 가장 어려운 부분은 창을 만들기 전에 달걀 껍질에서 CAM을 분리하기 위해 알부민을 흡인하는 데 필요한 작은 구멍을 만드는 것입니다. 너무 많은 압력을 가하면 과침투가 발생하거나 난자가 깨져 파괴되어 CAM과 혈관 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있습니다. CAM을 분리하려는 초기 시도 중에 실수를 최소화하려면 직선 핀을 사용하여 수정되지 않은 식료품 구입 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution