Модель хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыплят как инструмент для изучения трансплантации ткани яичника

Резюме

В данной статье мы опишем протокол разработки модели ксенотрансплантации хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыпленка для ткани яичников человека и продемонстрируем эффективность метода, сроки реваскуляризации трансплантата и жизнеспособность ткани в течение 6-дневного периода трансплантации.

Аннотация

Криоконсервация и трансплантация ткани яичника является эффективной стратегией для сохранения фертильности, но имеет один существенный недостаток, а именно массивную потерю фолликулов, происходящую вскоре после реимплантации из-за аномальной активации и гибели фолликула. Грызуны являются эталонными моделями для исследования активации фолликулов, но стоимость, время и этические соображения становятся все более непомерно высокими, что стимулирует разработку альтернатив. Модель хориоаллантоисной мембраны (CAM) цыплят особенно привлекательна, поскольку она недорогая и поддерживает естественный иммунодефицит до 17-го дня после оплодотворения, что делает ее идеальной для изучения краткосрочной ксенотрансплантации ткани яичников человека. CAM также сильно васкуляризирован и широко используется в качестве модели для изучения ангиогенеза. Это дает ему заметное преимущество по сравнению с моделями in vitro и позволяет исследовать механизмы, влияющие на ранний процесс потери фолликулов после трансплантации. Протокол, изложенный в настоящем документе, направлен на описание разработки модели ксенотрансплантации CAM для ткани яичников человека с конкретным пониманием эффективности метода, временных рамок реваскуляризации трансплантата и жизнеспособности тканей в течение 6-дневного периода трансплантации.

Введение

Спрос на сохранение фертильности по онкологическим и доброкачественным показаниям, а также по социальным причинам резко возрос за последние десятилетия. Однако различные методы лечения, используемые для лечения злокачественных и доброкачественных заболеваний, очень токсичны для половых желез и могут привести к ятрогенной преждевременной недостаточности яичников, что в конечном итоге приводит к бесплодию1^. Общепринятые методы сохранения фертильности включают криоконсервацию эмбрионов, витрификацию незрелых или зрелых ооцитов и криоконсервацию ткани яичников ^2,3,4. Замораживание тканей яичников является единственным доступным вариантом сохранения фертильности у девочек препубертатного возраста или женщин, которым требуется немедленная терапия рака. Восстановление эндокринной функции после трансплантации ткани яичников происходит более чем у 95% пациентов, при этом частота живорождения колеблется от 18% до 42%5,6,7,8,9.

Несмотря на то, что трансплантация замороженно-размороженной ткани яичников оказалась успешной, все еще есть возможности для улучшения. Действительно, поскольку фрагменты коры яичников трансплантируются без сосудистого анастомоза, они переживают период гипоксии, во время которого происходит реваскуляризация трансплантата 10,11,12. В подавляющем большинстве исследований, изучающих трансплантацию ткани яичников человека, использовалась модель ксенотрансплантации, при которой ткань яичника трансплантируется мышам с иммунодефицитом. Полная реваскуляризация ксенотрансплантатов занимает около 10 дней, при этом сосуды хозяина и трансплантата способствуют формированию функциональных сосудов 12,13,14. Около 50%-90% фолликулярного резерва теряется в течение этого гипоксического окна до завершения реваскуляризации трансплантата 10,15,16. Было высказано предположение, что эта массивная потеря фолликулов происходит как за счет прямой гибели фолликулов, о чем свидетельствует уменьшение абсолютного числа фолликулов, оставшихся после трансплантации, так и за активацию роста примордиального фолликула, на что указывают изменения в пропорциях фолликулов в сторону увеличения скорости роста фолликулов^17,18.

Интересно, что в предыдущих исследованиях с использованием различных тканей яичников животных, привитых к хориоаллантоисной мембране цыплят (CAM), конституция которой имитирует типичное место пересадки брюшины, сообщалось об ингибировании спонтанной активации фолликула, при этом первичный резерв фолликула остается нетронутым до 10 дней 19,20,21,22. Наша команда ранее продемонстрировала, что трансплантация замороженно-размороженной ткани яичников человека в CAM представляет собой надежный подход к исследованию трансплантации ткани яичников человека на ее первых ишемических стадиях²³, и недавно показала, что этот метод трансплантации способен противодействовать активации фолликулов²⁴.

Модель CAM особенно привлекательна не только потому, что яйцеклетки намного дешевле, чем у мышей, но и из-за высокой васкуляризированной природы CAM, что позволяет тщательно изучить связь между активацией фолликулов и реваскуляризацией трансплантата яичников. Птичья система, действительно, является одним из наиболее распространенных и разносторонних способов изучения ангиогенеза²⁵. Развитие эмбриона цыпленка (ЭД) занимает 21 день до вылупления, а КАМ формируется в течение первых 4-5 дней путем слияния аллантоиса и хориона²⁶. Примечательно, что эмбрион цыпленка является естественным иммунодефицитным хозяином до 17-го дня ЭД, поэтому эксперименты по ксенотрансплантации можно проводить без какого-либо риска отторжения трансплантата^27,28. Более того, модельный подход CAM не вызывает каких-либо этических или юридических проблем с точки зрения европейского законодательства²⁹, что делает его привлекательной альтернативой другим моделям на животных. Что касается условий разведения, то эмбрионы цыплят нуждаются только в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C и относительной влажности воздуха 40%-60%. Эти ограниченные требования к экспериментам значительно снижают затраты на исследования по сравнению с использованием мышей с иммунодефицитом.

Протокол, представленный в настоящем документе, направлен на описание разработки модели ксенотрансплантации CAM для ткани яичников человека и дает конкретное представление об эффективности метода, временных рамках реваскуляризации трансплантата и жизнеспособности тканей в течение 6-дневного периода трансплантации. Этот протокол может представлять большой интерес для изучения механизмов ранней потери фолликулов после трансплантации и изучения влияния нескольких агентов (факторов роста, гормонов и т.д.) на это явление.

протокол

Использование человеческих тканей было одобрено Институциональным наблюдательным советом Католического университета Лувена. Пациентки дали письменное информированное согласие на использование тканей яичников в исследовательских целях.

1. Заказ яйцеклеток 0-го дня, которые с высокой вероятностью будут эмбриональными

1. Найдите сертифицированного поставщика белых яиц породы Леггорн, отобранного Ломаном, который сообщает о высоком уровне эмбриональных яиц, что в первую очередь зависит от возраста цыплят.

2. Подготовка яиц к инкубации

1. До прибытия яиц соберите и уравновесите инкубатор для яиц до 37 °C при относительной влажности воздуха 40%-60%. Следите за температурой и влажностью воздуха, вставив в инкубатор термометр и гигрометр. Убедитесь, что крышка инкубатора оснащена стеклянным окном, позволяющим проверять внутренние параметры инкубатора, не открывая его (Рисунок 1).
2. Получив яйца 0-го дня от отобранных Ломаном цыплят породы белый леггорн от сертифицированного поставщика яиц лабораторного качества, очистите поверхность скорлупы увлажненной бумагой и немедленно высушите их.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мембрана яичной скорлупы пористая, для очистки поверхностей яиц и контроля влажности внутри инкубатора можно использовать автоклавную воду, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
3. Пометьте яйца маркером (например, дату и номер яйца).
4. Инкубируйте яйца заостренным концом вниз и поворачивайте их, чтобы позволить CAM развиваться. Вручную поворачивайте яйца на 180° два-три раза в день или используйте автоматический ротатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы убедиться, что яйца действительно вращаются, скорлупа яйца может быть помечена буквами «X» и «O» на двух противоположных боковых сторонах с помощью карандаша или маркера. Стеклянное окошко в крышке инкубатора позволяет проверить вращение яиц, не открывая устройство.

3. Вскрытие яичной скорлупы на 3-й день ЭД

ПРИМЕЧАНИЕ: На 3-й день ЭД в яичной скорлупе делается прямоугольное окошко.

1. Подготовьте ламинарный вытяжной шкаф для работы в стерильных условиях. Поместите следующие инструменты под колпак и продезинфицируйте их в 70% этаноле (если они еще не стерилизована):
   -Стойка для яиц
   -Яичная свеча или фокусный источник холодного света
   -Маркер
   -Стерильный прямой штифт
   -Стерильная игла 19 G
   -5 мл стерильный шприц
   -Пильный диск со спиральной спиралью
   -Стерильные щипцы
   -Скотч
2. Переложите одно яйцо из инкубатора на решетку для яиц, расположенную под колпаком, и выключите ротатор яиц.
3. В темноте определите воздушный карман яйца, приложив яичный свечник (или очаговый источник холодного света) к яичной скорлупе. Воздушный карман локализуется на тупом конце яйца. Используйте маркер, чтобы точно определить центр воздушного кармана на яичной скорлупе.
4. Включите свет. Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе, где оно отмечается, аккуратно вращая стерильную прямую булавку. Обычно достаточно крошечного отверстия диаметром около 1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть булавку до упора в яйцо. Если это произошло, выбросьте яйцо.
5. Подсоедините стерильную иглу 19 G к стерильному шприцу объемом 5 мл.
6. В темноте найдите желточный мешок с помощью яичной свечи (или очагового источника холодного света) и проколите яйцо через отверстие, сделанное на шаге 3.4, стерильной иглой 19 G, расположенной под углом 45° ко дну яйца; Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить желточный мешок. Отсосите 1,5-2 мл белка, чтобы отделить CAM от оболочки, а затем закройте отверстие куском клейкой ленты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если желточный мешок поврежден во время аспирации, отсасываемая жидкость в шприце будет желтого цвета, а не прозрачной (белок). Если это произошло, замените иглу и шприц. Если всасывается относительно большое количество яичного желтка, это может поставить под угрозу жизнеспособность эмбриона.
7. Включите свет. Положите яйцо горизонтально, а маркером нарисуйте маркером прямоугольное окошко размером 1 см х 1,5 см. Не делайте окно больше обычной ширины стандартной клейкой ленты.
8. Подержите яйцо в одной руке, и аккуратно пропилите ранее нарисованное окошко в яичной скорлупе с помощью пильного диска. Следите за тем, чтобы оболочка не трескалась и не разрезалась до вдавленного CAM. Регулярно дуйте, чтобы удалить пыль и мусор из скорлупы.
9. Просуньте стерильные щипцы под прямоугольный кусок пиленой оболочки и ловко возьмитесь за него, чтобы аккуратно снять, не повредив CAM. Кроме того, откажитесь от белой мембраны внешней оболочки, чтобы иметь возможность видеть эмбрион и его CAM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если на CAM попадет пыль или мусор из яичной скорлупы, их можно удалить стерильными щипцами, соблюдая осторожность, чтобы не порвать CAM.
10. Идентификация жизнеспособных эмбриональных яйцеклеток. Их можно различить по прозрачному белку и сосудистому кольцу вокруг эмбриона, где иногда можно обнаружить бьющееся сердце даже на этой стадии (3-й день ЭД). Отбракуйте неоплодотворенные или мертвые эмбрионы.
11. Наклейте скотч на только что созданное окно, чтобы избежать обезвоживания. Обязательно загните один конец на себя для удобства снятия.
12. Поместите яйцо обратно в инкубатор открытым окошком вверх и лентой не касаясь CAM. Используйте сложенный лист бумаги или часть решетки для яиц, чтобы яйцо не скатывалось. Убедитесь, что вращающийся лоток выключен.
13. Повторите шаги 3.2-3.12, чтобы открыть оставшиеся яйца.

4. Пересадка замороженно-размороженной ткани яичника человека в КАМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантация в КАМ в идеале должна быть начата между 7-10 днями ЭД.

1. Разморозьте криоконсервированные полоски кортикальной коры яичников под ламинарным колпаком в соответствии с протоколом, описанным в другом месте³⁰.
2. Разрежьте кортикальные полоски на три фрагмента размером 4 мм х 2 мм х 1 мм. Используйте один кусочек в качестве непривитого контроля, а два других для ксенотрансплантации в течение 1 дня или 6 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеется достаточное количество ткани, работайте в двух экземплярах.
3. Переложите одно яйцо из инкубатора на стойку для яиц, расположенную под колпаком, окном вверх.
4. Снимите ленту с окна и убедитесь, что эмбрион жизнеспособен. На этой стадии жизнеспособные эмбрионы имеют обширную сосудистую сеть, прозрачный белок, видимое сердцебиение и некоторое движение эмбриона.
5. Подготовьте место пересадки, осторожно травмировав небольшой участок КАМ, положив полоску стерильной линзовой бумаги, экстрагированной эфиром^, на поверхность эпителия и немедленно удалив ее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CAM является непроницаемым барьером, если мембрана не была травмирована удалением верхней перидермальной части двойного эпителиального слоя, оставив базальный слой нетронутым. Эта методика также усиливает процесс реваскуляризации, активизируя заживление ран. Если стерильная бумага для линз, извлеченная из эфира, остается на CAM-приемнике слишком долго, мембрана может прилипнуть к бумаге и порваться. Если это произошло, выбросьте яйцо.
6. Возьмите одну замороженно-размороженную полоску коры яичника (4 мм x 2 мм x 1 мм) микрохирургическими щипцами и поместите ее на травмированный КАМ медуллярной стороной к CAM. Трансплантат по одному кусочку ткани на яйцо.
7. Закройте окно скотчем, и аккуратно верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие скорлупы находится вертикально и яйцо надежно закреплено.
8. Повторите шаги 4.1-4.7 для пересадки всех оставшихся тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантаты следует проверять каждый день трансплантации, чтобы оценить жизнеспособность эмбриона и отслеживать изменения в сосудистой системе.

5. Забор графтов

ПРИМЕЧАНИЕ: Ксенотрансплантаты должны быть собраны не позднее 17-го дня ЭД, так как иммунная система эмбриона становится зрелой и компетентной с 18-го дня.

1. Поместите яйцо на решетку и увеличьте окно в скорлупе, чтобы обеспечить лучшую визуализацию трансплантата и облегчить манипуляции.
2. Оцените трансплантат макроскопически и обратите особое внимание на сосудистую реакцию КАМ на трансплантат. Делайте цифровые фотографии или видео для записи.
3. Захватите ткань или окружающую CAM-ткань щипцами и с помощью ножниц или скальпеля осторожно иссеките трансплантат из CAM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантаты покрываются вторым слоем CAM примерно на 3-й день после прививки и в конечном итоге инкапсулируются. Они также могли переместиться внутрь яйца к 6-му дню, что в некоторых случаях затрудняет их извлечение.
4. Анализируйте иссеченные ткани любым методом, подходящим для данного эксперимента. В настоящем исследовании кусочки ткани фиксировали в параформальдегиде, погружали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином в соответствии с этапами, описанными ниже:
   1. Зафиксируйте фрагменты в 4%-ном параформальдегиде на 24 ч и заделайте их в парафин с помощью автоматического устройства для заделки, выполнив действия, указанные в таблице 1.
   2. Оставьте залитые парафином блоки на ночь при температуре 4°C, а затем нарежьте их микротомом на срезы толщиной 5 мкм.
   3. Разложите срезы тканей на предметном стекле, помещенном на горячую плиту (30 °C), и оставьте их сохнуть на 2 часа, а затем на 24 часа в духовке при 37 °C.
   4. После этого окрасьте предметные стекла гематоксилином и эозином в соответствии с протоколом, описанным в другом месте³¹. Затем оцифруйте образцы с помощью сканера слайдов и проанализируйте их с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Результаты

Выживаемость цыплятых эмбрионов
Выживаемость эмбрионов от окна (3-й день ЭД) до трансплантации ткани яичника (7-й день ЭД) составила 79% (33/42). Поскольку процент эмбриональных яиц 0-го дня неизвестен, были заказаны дополнительные яйца 0-го дня от отобранных Ломаном белых кур породы...

Обсуждение

Самая сложная часть протокола, описанного здесь, - это проделывание небольшого отверстия, необходимого для аспирации белка, чтобы отделить CAM от яичной скорлупы перед созданием окна. Слишком сильное давление может привести к чрезмерному проникновению или даже к растрескиванию и разруш...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agani hypodermic needle, 19 G	Terumo Europe	AN*1950R1	19 G needle to aspirate albumen
Terumo syringe, 5 mL concentric Luer lock	Terumo Europe	SS*05LE1	5-mL sterile syringe
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		Image analysis software
Diethyl ether	Merck Chemicals	603-022-00-4	Sterile ether to traumatize the CAM
Eosin Y aqueous solution 0.5%	Merck	1098441000	Staining solution
Formaldehyde 4% aqueous solution buffered (Formalin 10%)	VWR	97139010	Formaldehyde used for tissue fixation
Fridge	Liebherr	7081260	Fridge at 4 °C used for paraffin-embedding
Heating plate	Schott	SLK2	Hot plate used to dry the slides
Incubator	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	Oven used for slide incubation
Leica CLS 150 XE microscope cold light source	Leica	CLS 150 XE	Focal cold light source to candle the eggs
Lens cleaning tissue, grade 541	VWR	111-5003	Tissue to soak in sterile ether to traumatize the CAM
Mayer's hematoxylin	MERCK	1092491000	Staining solution
Methanol	VWR	20847307	Methanol
Microtome	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	Microtome
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	Slide scanner at 20x magnification
Paraformaldehyde	Merck	1,04,00,51,000	Paraffin-embedding solution
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	Paraffin
Petri dish, 60x15 mm, sterile	Greiner	628161	Sterile petri dish
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	Pin holder
Polyhatch	Brinsea	CP01F	Egg incubator with automatic rotator
Scroll saw blade, 132 mm	Sencys	/	Saw blade to create a window in the eggshell
Stainless steel insert pins	Fine Science Tools	26007-02	Straight pin to make a hole in the eggshell
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	Laminar flow hood
Superfrost Plus bords rodés 90°	VWR	631-9483	Glass slides
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	Automatic embedding device
Titanium forceps	Fine Science Tools	11602-16	Forceps for eggshell removal and ovarian tissue manipulation
Toluene, pa	VWR	28701364	Paraffin-embedding solution