عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية لعزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (MSCs) من فئران Sprague Dawley.

Abstract

أحدثت خلايا اللحمة المتوسطة البالغة ثورة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية في العقود الأخيرة. يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة ، بالإضافة إلى قدرتها الكبيرة على التجديد الذاتي والهجرة والانتشار. الأنسجة الدهنية هي واحدة من أقل المصادر الغازية والأكثر سهولة للخلايا الوسيطة. كما تم الإبلاغ عن أن لها غلات أعلى مقارنة بالمصادر الأخرى ، فضلا عن خصائص مناعية فائقة. في الآونة الأخيرة ، تم نشر إجراءات مختلفة للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة البالغة من مصادر الأنسجة المختلفة والأنواع الحيوانية. بعد تقييم معايير بعض المؤلفين ، قمنا بتوحيد منهجية قابلة للتطبيق لأغراض مختلفة ويمكن استنساخها بسهولة. سمحت لنا مجموعة من الأجزاء الوعائية اللحمية (SVF) من الأنسجة الدهنية حول الكلى والبربخ بتطوير ثقافات أولية مع مورفولوجيا ووظائف مثالية. لوحظت الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي لمدة 24 ساعة ، وأظهرت مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، مع إطالة وميل لتشكيل مستعمرات. تم استخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FC) والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن علامات الغشاء CD105 و CD9 و CD63 و CD31 و CD34. كما تم تقييم قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) على التمايز في السلالة الشحمية باستخدام مزيج من العوامل (4 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي متر 3-ميثيل أيزو بوتيل زانثين ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون). بعد 48 ساعة ، لوحظ فقدان تدريجي لمورفولوجيا الخلايا الليفية ، وفي 12 يوما ، تم تأكيد وجود قطرات دهنية إيجابية لتلطيخ الزيت الأحمر. باختصار ، يقترح إجراء للحصول على ثقافات ASC المثلى والوظيفية للتطبيق في الطب التجديدي.

Introduction

أثرت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة على الطب التجديدي بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي والانتشار والهجرة والتمايز إلى سلالات خلايا مختلفة ^1,2. حاليا ، يركز قدر كبير من الأبحاث على إمكاناتها لعلاج وتشخيص الأمراض المختلفة.

هناك مصادر مختلفة لخلايا اللحمة المتوسطة: نخاع العظام ، والعضلات الهيكلية ، والسائل الأمنيوسي ، وبصيلات الشعر ، والمشيمة ، والأنسجة الدهنية ، من بين أمور أخرى. يتم الحصول عليها من أنواع مختلفة ، بما في ذلك البشر والفئران والجرذان والكلاب والخيول³. تم استخدام MSCs المشتقة من نخاع العظام (BMSCs) لسنوات عديدة كمصدر رئيسي للخلايا الجذعية في الطب التجديدي وكبديل لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية⁴. ومع ذلك ، فإن MSCs المشتقة من الدهون ، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) ، هي بديل مهم يتمتع بمزايا كبيرة نظرا لسهولة جمعها وعزلها ، فضلا عن إنتاجية الخلايا التي تم الحصول عليها لكل جرام من الأنسجة الدهنية ^5,6. وقد أفيد بأن معدل حصاد ASCs أعلى بشكل عام من معدل حصاد^{BMSCs 7}. اقترح في البداية أن القدرة التعويضية / التجديدية ل ASCs كانت بسبب قدرتها على التمايز إلى سلالات الخلايا^{الأخرى 8}. ومع ذلك ، فقد عززت الأبحاث في السنوات الأخيرة الدور الأساسي لعوامل paracrine التي أطلقتها ASCs في إمكاناتها التعويضية ^9,10.

الأنسجة الدهنية (AT) ، بالإضافة إلى كونها احتياطي للطاقة ، تتفاعل مع الغدد الصماء والجهاز العصبي والقلب والأوعية الدموية. كما أنها تشارك في النمو والتطور بعد الولادة ، والحفاظ على توازن الأنسجة ، وإصلاح الأنسجة ، وتجديدها. يتكون AT من الخلايا الشحمية ، وخلايا العضلات الملساء الوعائية ، والخلايا البطانية ، والخلايا الليفية ، والوحيدات ، والبلاعم ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا preadipocytes ، و ASCs. هذا الأخير يمتلك دورا مهما في الطب التجديدي بسبب انخفاض مناعته^11,12. يمكن الحصول على ASCs عن طريق الهضم الأنزيمي والمعالجة الميكانيكية أو عن طريق زراعة الأنسجة الدهنية. من السهل الحفاظ على الثقافات الأساسية ل ASCs وتنميتها وتوسيعها. يعد توصيف النمط الظاهري ل ASCs ضروريا للتحقق من هوية الخلايا من خلال تقييم التعبير عن علامات غشائية محددة باستخدام طرق مثل التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي¹³. حدد الاتحاد الدولي للعلاجات والعلوم الدهنية (IFATS) والجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) أن ASCs تعبر عن CD73 و CD90 و CD105 ، بينما تفتقر إلى التعبير عن CD11b و CD14 و CD19 و CD45 و HLA-DR¹⁴. لذلك تعتبر هذه العلامات ، الإيجابية والسلبية على حد سواء ، موثوقة لتوصيف ASCs.

ركز هذا المشروع على وصف إجراء لعزل وتحديد خلايا اللحمة المتوسطة البالغة المستخرجة من ATللفئران ، لأن مصدر الخلايا هذا لا يمثل تحديات أخلاقية ، على عكس الخلايا الجذعية الجنينية. هذا يعزز الإجراء كخيار قابل للتطبيق بسبب سهولة الوصول وطريقة الحد الأدنى من التدخل الجراحي مقارنة بالخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام.

تلعب خلايا اللحمة المتوسطة من مصدر الأنسجة هذا دورا مهما في الطب التجديدي بسبب قدراتها المناعية وانخفاض الرفض المناعي. لذلك ، تعد الدراسة الحالية جزءا أساسيا من الأبحاث المستقبلية في إفرازها وتطبيقها كعلاج تجديدي في أمراض مختلفة ، بما في ذلك أمراض التمثيل الغذائي مثل مرض السكري.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المكسيكية لرعاية الحيوان ، بناء على توصيات جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999 ، المكسيك). تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه وتسجيله من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الصحية التابعة للمعهد المكسيكي للبحوث الاجتماعية (R-2021-785-092).

1. إزالة الأنسجة الدهنية من الفئران عن طريق الاستئصال الجراحي

1. تحضير أنبوبين مخروطيين مع 20 مل من محلول مضاد حيوي ملحي معقم 1x فوسفات (PBS-AA) (1x PBS ، جنتاميسين [20 ميكروغرام / مل] ، وأمفوتريسين [0.5 ميكروغرام / مل]) والحفاظ على الجليد.
2. حدد اثنين من ذكور الفئران Sprague Dawley (R. norvegicus) في حالة صحية جيدة. تأكد من أن عمر الفئران يتراوح بين 3-4 أشهر ولها وزن مشترك يتراوح بين 350-450 جم.
3. يجب إجراء التخدير بجرعة 20 ملغ/ كغ من زيلازين هيدروكلوريد، وبعد 5 دقائق يتم تطبيق مخدر بجرعة 120 ملغ/كغ من الكيتامين هيدروكلوريد داخل الصفاق. تليين كلتا العينين مع مرهم العيون لمنع الجفاف. ثم تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس الدواسة.
4. حلق وتطهير منطقة البطن والأربية بمحلول اليود. ضع الستائر الجراحية للحفاظ على العقم. ثم قم بعمل شق طولي متوسط من القص إلى منطقة الخصية.
5. قم بإزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بكل من البربخ والكلى بالملقط المعقم وضعها في محلول 1x PBS-AA. احتفظ بالعينات على الجليد.
6. خياطة الشق المغلق إذا لزم الأمر وفقا للإرشادات المؤسسية والقتل الرحيم للحيوانات بجرعة داخل القلب تبلغ 40 مجم / كجم بنتوباربيتال الصوديوم. بمجرد تأكيد الوفاة ، تخلص من الذبيحة باتباع الإجراء (الإجراءات) المؤسسية.
   ملاحظة: يثير الموت آليات الإشارات التي تؤثر على النمط المناعي ، وقدرة التمايز ، وتأثير paracrine لخلايا اللحمة المتوسطة. وبالتالي ، يتم إجراء جمع الأنسجة قبل القتل الرحيم. 

2. عزل خلايا اللحمة المتوسطة من الأنسجة الدهنية

1. قم بإزالة الأنسجة الدهنية بالملقط المعقم داخل خزانة السلامة البيولوجية وضعها على ورق ترشيح معقم في طبق بتري قطره 100 مم لامتصاص PBS الزائد.
2. انقل الأنسجة الدهنية إلى طبق بتري آخر وقم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 5 دقائق لكل منها 10 مل من محلول 1x PBS-AA باستخدام ماصة سعة 10 مل.
3. قم بتقسيم الأنسجة ميكانيكيا إلى شظايا يبلغ طولها حوالي 1 سم² باستخدام مقص ومشرط.
4. تحضير كولاجيناز من النوع الرابع (0.075٪) في 20 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) غير المكمل غذائيا. قم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر واحفظه عند 37 درجة مئوية.
5. أضف محلول كولاجيناز (20 مل) المحضر في الخطوة 2.4 إلى دورق بلوري مع منديل مجزأ وقضيب مغناطيسي. أغلق الحاوية واحتضانها تحت التحريك البطيء والمستمر عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يستغرق الهضم الأنزيمي حوالي 90 دقيقة (الحفاظ على التحريك البطيء للحفاظ على سلامة أغشية الخلايا).
6. قم بتصفية التجانس من خلال مرشح من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 40 شبكة ، فتحة 0.38 مم على طبق بتري 100 مم وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
7. أضف 20 مل من DMEM الدافئ والمكمل (10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، 2 مللي مول جلوتامين ، 2 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 100x محلول حمض أميني غير أساسي ، و 100x محلول مضاد حيوي [AA]). تعليق بعناية جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVE).
8. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 290 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية بماصة 25 مل ، واغسل الخلايا برفق باستخدام 40 مل من وسط DMEM غير المكمل.
9. كرر هذه الخطوة. استخدم أنبوبا مخروطيا معقم جديدا بين الخطوات لسحب أقل كمية من المخلفات الخلوية والدهون.
10. الحبيبات في 5 مل من DMEM المكمل بماصة 5 مل وانقلها إلى زجاجة T-25 سم² . احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
11. في اليوم التالي ، قم بإجراء ثلاث غسلات مع 5 مل من 1x PBS-AA الدافئ وغسلتين مع DMEM غير المكمل لإزالة حطام الخلايا والخلايا غير الملتصقة. أضف 5 مل من DMEM الطازج والدافئ والمكمل مع ماصة 5 مل وقم بتغيير الوسط كل 3-4 أيام.

3. الحفاظ على الثقافات الأولية ASC وتوسيعها

1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ -100٪ (8 ± 2 أيام) ، اغسل مرتين باستخدام 5 مل من DMEM غير المكمل. أضف 1 مل من التربسين -2 mM الدافئ 0.025٪ حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) واحتضانه لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
2. عندما يتم فصل الطبقة الأحادية للخلية ، أضف 4 مل من DMEM المكمل وقم بتقسيم تعليق الخلية برفق.
3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأضف 5 مل من DMEM الدافئ والمكمل ، ثم برفق للتجانس.
4. أجهزة الطرد المركزي في 290 × ز لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واخلط الحبيبات برفق في 1 مل من DMEM المكمل. عد الخلايا في غرفة نيوباور بعد تلطيخها بتريبان الأزرق.
5. أخيرا ، البذور 2.5 × 10³ خلايا / سم² بنسبة انقسام 1: 4 في قوارير T-75. تضمن هذه الخطوة تكوين مستعمرة ومعدل انتشار مرتفع.

4. التوصيف المورفولوجي للثقافات الأولية ASC

1. مراقبة مورفولوجيا ASCs تحت المجهر المقلوب.
   ملاحظة: قبل التركيب لتحديد الأنسجة و ASC ، عالج أغطية الغطاء بمحلول جيلاتيني 1٪. يشع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
   1. قم بإزالة أغطية الغطاء من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ واتركها تجف لمدة 5 دقائق.
   2. اغمر أغطية الغطاء في محلول جيلاتيني معقم بنسبة 1٪ ، وصفيها وجففها في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. ضع كل غطاء في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار وقم بإشعاع الألواح بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
   4. بذر قطرة تحتوي على 25 × 10³ خلايا في وسط البئر ، وانتظر 1 دقيقة ، وأضف 1 مل من وسط DMEM المضاف. احتضان لمدة 96 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
   5. قم بإزالة الوسط وقم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 1x PBS-AA باستخدام ماصة نقل.
   6. أضف 1 مل من الفورمالين المحايد بنسبة 3.5٪ إلى كل بئر واحتضانه لمدة 1 ساعة في RT. قم بإزالة الفورمالين بعناية وأضف 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ إلى كل بئر.
   7. ختم اللوحة مع parafilm حتى الاستخدام ، لمنع الجفاف.
      ملاحظة: يتم أيضا تقييم التشكل الخلوي ل ASCs عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين خلال الممرات المختلفة.
   8. قم بإزالة 70٪ من الإيثانول من كل بئر ورطب الخلايا لمدة 5 دقائق بالماء المقطر. وفي الوقت نفسه ، قم بتصفية حلول تلطيخ.
   9. قم بإزالة الماء وبقع الخلايا تحت التحريك البطيء لمدة 15 دقيقة بمحلول الهيماتوكسيلين هاريس.
   10. قم بإزالة محلول التلوين وقم بإجراء غسلتين باستخدام 1x PBS.
   11. تلطيخ الخلايا بمحلول eosin تحت التحريض البطيء لمدة 1 دقيقة. ثم ، قم بإزالة المحلول وإجراء غسلتين باستخدام 1x PBS.
   12. قم بإزالة أغطية الغطاء بعناية من كل بئر وقم بتركيب الشرائح على قطرة من محلول تركيب PBS-glycerol (1: 1 فولت / حجم).
   13. ضع خطا من طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء ولاحظ الشرائح النسيجية تحت المجهر الضوئي.

5. علامات التعبير عن ASCs عن طريق التألق المناعي

1. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على 1x PBS-0.05٪ Tween 20. أداء يغسل في RT ومع اهتزاز بطيء. اغسل الأطباق ثلاث مرات ب 2 مل من المخزن المؤقت / البئر (احتضانها لمدة 3 دقائق لكل غسلة).
2. ضع 1 مل من الكاشف المانع (1:10) واحتضنه مع التقليب البطيء لمدة 20 دقيقة.
3. أضف 200 ميكرولتر (تخفيف 1:50) من الأجسام المضادة الأولية التالية إلى كل بئر: CD9 (فأر وحيد النسيلة) ، CD34 (أرنب متعدد النسيلة) ، ومضاد CD63 (ماعز متعدد النسيلة). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
4. اغسل الألواح ثلاث مرات مرة أخرى واحتضانها ب 200 ميكرولتر (1:50 تخفيف) من الأجسام المضادة الثانوية التالية: الماعز المترافق IgG FITC المضاد للفأر ، والحمير المضاد للماعز IgG DyeLight 550 ، والماعز المضاد للأرانب IgG Cy3.
5. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS-0.05٪ Tween 20 وقم بتلطيخ نوى الخلية ب 100 ميكرولتر من DRAQ-7 (التخفيف: 17 ميكرولتر في 1 مل من الماء المقطر المزدوج) لمدة 20 دقيقة.
6. اغسل ثلاث مرات أخرى وقم بتركيب الشرائح وفقا للخطوات 4.1.12-4.1.13. قم بتخزين العينات المحمية من الضوء والمجمدة حتى الاستخدام.
7. تصور العينات تحت المجهر متحد البؤر epifluorescence باستخدام الإعدادات المناسبة والبرامج الموصى بها لهذا الجهاز.

6. علامات التعبير عن ASCs عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. اضبط معلق خلية واحدة من الخلايا المذابة أو المذابة (الممرات الفرعية 3 أو 4) بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / مل من 1x PBS-5٪ FBS. القسمة 100 ميكرولتر مع 100000 خلية في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل. استخدم قسمة واحدة بدون وضع علامات للتحكم التلقائي في التألق.
2. أضف إلى الراحة جميع الكميات المناسبة من Anti-CD105 AF-594 و Anti-CD31 AF-680 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان في الظلام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
3. اغسل البقعة الزائدة ب 1 مل من 1x PBS-5٪ FBS عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وعلقها في 300 ميكرولتر من 1٪ فورمالين.
4. إجراء الحصول على عينة على مقياس التدفق الخلوي. تعتمد استراتيجية البوابات للخلايا على بوابات FSC-A مقابل SSC-A ، والخلايا المفردة ذات البوابات باستخدام SSC-H مقابل SSC-A متبوعة ب FSC-A مقابل FSC-H.
5. استخدم كاشف Y610-mCherry-A لكاشف CD105 AF-594 و R660-APC-A ل CD31 AF-680.

7. تمايز ASCs إلى النسب الدهني

1. في صفيحة ذات 6 آبار ، البذور 1 × 10 4 خلايا (^P-4) لكل سم 2 وتحضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ ، حتى التقاء 60-80٪ (~ 72-96 ساعة). تحفيز التمايز ، وتطبيقه مباشرة على وسط الثقافة: 4 ميكرومتر أنسولين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون 21-أسيتات (Dxa) ، و 0.5 مللي متر من 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (MIX). تغيير وسيط التمايز كل 2-3 أيام.
2. قم بإعداد محلول مخزون من الأنسولين 800 ميكرومتر في 2 مل من الماء المعقم عالي النقاء (أضف 20 ميكرولتر من 1 N HCl لضمان الذوبان الكامل) وتخزينه في -20 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر من مخزون الأنسولين ، المخفف مسبقا 1: 100 ، وقم بتطبيق 10 ميكرولتر بحجم نهائي قدره 2 مل لكل بئر.
3. قم بإعداد محلول مخزون يبلغ 1 mM Dxa في 5 مل من الماء المعقم عالي النقاء (لاحظ أن الذوبان الكامل لا يحدث). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. أضف 40 ميكرولتر / بئر من تخفيف 1: 4 من مخزون Dxa.
4. قم بإعداد مخزون 100 mM من MIX في 2.5 مل من 0.1 N NaOH ، دوامة ، وأضف 40 ميكرولتر من 1 N NaOH للذوبان الكامل. يحفظ في درجة حرارة -70 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر / بئر من مخزون MIX.
5. قم بتصفية محاليل المخزون من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر قبل التخزين.
6. في اليوم 12 ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS واحتضانها ب 500 ميكرولتر من 4٪ فورمالين لمدة 1 ساعة في RT. اغسل كل بئر مرتين بالماء المقطر متبوعا بنسبة 60٪ من الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق واتركه حتى يجف.
7. أضف 0.5٪ زيت أحمر O مخفف في 60٪ إيزوبروبانول (500 ميكرولتر / بئر) واحتضانه لمدة 20 دقيقة في RT. يغسل ب 1 مل من الماء المقطر ثلاث مرات ويلاحظ تحت المجهر المقلوب.
   ملاحظة: بالنسبة للكواشف والمعدات والمواد المطلوبة، راجع جدول المواد.

النتائج

تم الحصول على الأنسجة الدهنية من فئران Sprague Dawley البالغة من العمر 3-4 أشهر ويبلغ وزن جسمها 401 ± 41 جم (المتوسط الهندسي ± SD). تتوافق القيمة المتوسطة البالغة 3.8 جم من الأنسجة الدهنية البربخية وحول الكلى مع تحليل 15 عملية استخراج تجريبية. بعد 24 ساعة من الثقافة ، ظلت مجموعات الخلايا ملتصقة بالسطح البل...

Discussion

في العقود الأربعة الماضية منذ اكتشاف MSCs ، وصفت عدة مجموعات من الباحثين إجراءات الحصول على MSCs من الأنسجة والأنواع المختلفة. واحدة من مزايا استخدام الفئران كنموذج حيواني هي سهولة صيانتها وتطورها السريع ، فضلا عن سهولة الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية. تم وصف مصادر الأنسجة المختلفة للحصول ع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025