A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية لعزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (MSCs) من فئران Sprague Dawley.

Abstract

أحدثت خلايا اللحمة المتوسطة البالغة ثورة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية في العقود الأخيرة. يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة ، بالإضافة إلى قدرتها الكبيرة على التجديد الذاتي والهجرة والانتشار. الأنسجة الدهنية هي واحدة من أقل المصادر الغازية والأكثر سهولة للخلايا الوسيطة. كما تم الإبلاغ عن أن لها غلات أعلى مقارنة بالمصادر الأخرى ، فضلا عن خصائص مناعية فائقة. في الآونة الأخيرة ، تم نشر إجراءات مختلفة للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة البالغة من مصادر الأنسجة المختلفة والأنواع الحيوانية. بعد تقييم معايير بعض المؤلفين ، قمنا بتوحيد منهجية قابلة للتطبيق لأغراض مختلفة ويمكن استنساخها بسهولة. سمحت لنا مجموعة من الأجزاء الوعائية اللحمية (SVF) من الأنسجة الدهنية حول الكلى والبربخ بتطوير ثقافات أولية مع مورفولوجيا ووظائف مثالية. لوحظت الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي لمدة 24 ساعة ، وأظهرت مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، مع إطالة وميل لتشكيل مستعمرات. تم استخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FC) والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن علامات الغشاء CD105 و CD9 و CD63 و CD31 و CD34. كما تم تقييم قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) على التمايز في السلالة الشحمية باستخدام مزيج من العوامل (4 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي متر 3-ميثيل أيزو بوتيل زانثين ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون). بعد 48 ساعة ، لوحظ فقدان تدريجي لمورفولوجيا الخلايا الليفية ، وفي 12 يوما ، تم تأكيد وجود قطرات دهنية إيجابية لتلطيخ الزيت الأحمر. باختصار ، يقترح إجراء للحصول على ثقافات ASC المثلى والوظيفية للتطبيق في الطب التجديدي.

Introduction

أثرت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة على الطب التجديدي بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي والانتشار والهجرة والتمايز إلى سلالات خلايا مختلفة 1,2. حاليا ، يركز قدر كبير من الأبحاث على إمكاناتها لعلاج وتشخيص الأمراض المختلفة.

هناك مصادر مختلفة لخلايا اللحمة المتوسطة: نخاع العظام ، والعضلات الهيكلية ، والسائل الأمنيوسي ، وبصيلات الشعر ، والمشيمة ، والأنسجة الدهنية ، من بين أمور أخرى. يتم الحصول عليها من أنواع مختلفة ، بما في ذلك البشر والفئران والجرذان والكلاب والخيول3. تم استخدام MSCs المشتقة من نخاع العظام (BMSCs) لسنوات عديدة كمصدر رئيسي للخلايا الجذع....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المكسيكية لرعاية الحيوان ، بناء على توصيات جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999 ، المكسيك). تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه وتسجيله من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الصحية التابعة للمعهد المكسيكي للبحوث الاجتماعية (R-2021-785-092).

1. إزالة الأنسجة الدهنية من الفئران عن طريق الاستئصال الجراحي

  1. تحضير أنبوبين مخروطيين مع 20 مل من محلول مضاد حيوي ملحي معقم 1x فوسفات (PBS-AA) (1x PBS ، جنتاميسين [20 ميكروغرام / مل] ، وأمفوتريسين [0.5 ميكروغرام / مل]) والحفاظ على الجليد.
  2. حدد اثنين من ذكور الفئران Sprague Dawl....

النتائج

تم الحصول على الأنسجة الدهنية من فئران Sprague Dawley البالغة من العمر 3-4 أشهر ويبلغ وزن جسمها 401 ± 41 جم (المتوسط الهندسي ± SD). تتوافق القيمة المتوسطة البالغة 3.8 جم من الأنسجة الدهنية البربخية وحول الكلى مع تحليل 15 عملية استخراج تجريبية. بعد 24 ساعة من الثقافة ، ظلت مجموعات الخلايا ملتصقة بالسطح البل.......

Discussion

في العقود الأربعة الماضية منذ اكتشاف MSCs ، وصفت عدة مجموعات من الباحثين إجراءات الحصول على MSCs من الأنسجة والأنواع المختلفة. واحدة من مزايا استخدام الفئران كنموذج حيواني هي سهولة صيانتها وتطورها السريع ، فضلا عن سهولة الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية. تم وصف مصادر الأنسجة المختلفة للحصول ع?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمعهد المكسيكي للضمان الاجتماعي (IMSS) ومستشفى الأطفال في المكسيك ، فيديريكو غوميز (HIMFG) وموظفي Bioterio في تنسيق أبحاث IMSS ، للدعم المقدم لتنفيذ هذا المشروع. نشكر المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا على منحة AOC (815290) وأنطونيو دوارتي رييس على الدعم الفني في المواد السمعية والبصرية.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BHyCloneSV30078.01
Analytical balanceSartoriusAX224
Antibody anti- CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Antibody anti-C63Santa CruzSc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)RD Systems.No. F103B
Bottle Top Filter SterileCORNING10718003
Cell and Tissue Culture FlasksBIOFIL170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slidesSIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with LidCORNING25810
Centrifuge conical tubesHeTTICHROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubesFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Culture tubesGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterFree version
CytoFlex LX cytometerBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin yellowishHycel300
Ethanol 96%Baker64-17-5
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING35-010-CV
GelatinSIGMA Aldrich128111163
GentamicinGIBCO15750045
Glycerin-High PurityHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc.50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Free version
Biological Safety Cabinet Class IINuAire12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40CK40-G100
Non-essential amino acids 100XGIBCO11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μLFinnpipetteE97743
Micropipettes 2-20 μLFinnpipetteF54167
Micropipettes 20-200 μLFinnpipetteG32419
Micropipettes 100-1000 μLFinnpipetteFJ39895
Nitrogen tank liquidTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehydeSIGMA AldrichSLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell cultureCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker7447-40-7
Potassium Phosphate DibasicJ.T Baker2139900
S1 Pipette FillersThermo Sc9531
Serological pipette 5 mLPYREXL010005
Serological pipette 10 mLPYREXL010010
Sodium bicarbonateJ.T Baker144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker15368426
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousJ.T Baker7558-79-4
Sodium pyruvateGIBCO BRL11840-048
Syringe Filter SterileCORNING431222
SpectrophotometerPerkinElmer Lambda 25L6020060
Titer plate shakerLAB-LINE1250
Transfer pipetsSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue stainGIBCO1198566
Trypsin From Porcine PancreasSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)Pet's PharmaQ-7972-025

References

  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved