عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية لعزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (MSCs) من فئران Sprague Dawley.

Abstract

أحدثت خلايا اللحمة المتوسطة البالغة ثورة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية في العقود الأخيرة. يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة ، بالإضافة إلى قدرتها الكبيرة على التجديد الذاتي والهجرة والانتشار. الأنسجة الدهنية هي واحدة من أقل المصادر الغازية والأكثر سهولة للخلايا الوسيطة. كما تم الإبلاغ عن أن لها غلات أعلى مقارنة بالمصادر الأخرى ، فضلا عن خصائص مناعية فائقة. في الآونة الأخيرة ، تم نشر إجراءات مختلفة للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة البالغة من مصادر الأنسجة المختلفة والأنواع الحيوانية. بعد تقييم معايير بعض المؤلفين ، قمنا بتوحيد منهجية قابلة للتطبيق لأغراض مختلفة ويمكن استنساخها بسهولة. سمحت لنا مجموعة من الأجزاء الوعائية اللحمية (SVF) من الأنسجة الدهنية حول الكلى والبربخ بتطوير ثقافات أولية مع مورفولوجيا ووظائف مثالية. لوحظت الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي لمدة 24 ساعة ، وأظهرت مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، مع إطالة وميل لتشكيل مستعمرات. تم استخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FC) والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن علامات الغشاء CD105 و CD9 و CD63 و CD31 و CD34. كما تم تقييم قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) على التمايز في السلالة الشحمية باستخدام مزيج من العوامل (4 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي متر 3-ميثيل أيزو بوتيل زانثين ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون). بعد 48 ساعة ، لوحظ فقدان تدريجي لمورفولوجيا الخلايا الليفية ، وفي 12 يوما ، تم تأكيد وجود قطرات دهنية إيجابية لتلطيخ الزيت الأحمر. باختصار ، يقترح إجراء للحصول على ثقافات ASC المثلى والوظيفية للتطبيق في الطب التجديدي.

Introduction

أثرت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة على الطب التجديدي بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي والانتشار والهجرة والتمايز إلى سلالات خلايا مختلفة ^1,2. حاليا ، يركز قدر كبير من الأبحاث على إمكاناتها لعلاج وتشخيص الأمراض المختلفة.

هناك مصادر مختلفة لخلايا اللحمة المتوسطة: نخاع العظام ، والعضلات الهيكلية ، والسائل الأمنيوسي ، وبصيلات الشعر ، والمشيمة ، والأنسجة الدهنية ، من بين أمور أخرى. يتم الحصول عليها من أنواع مختلفة ، بما في ذلك البشر والفئران والجرذان والكلاب والخيول³. تم استخدام MSCs المشتقة من نخاع العظام (BMSCs) لسنوات عديدة كمصدر رئيسي للخلايا الجذع....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المكسيكية لرعاية الحيوان ، بناء على توصيات جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999 ، المكسيك). تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه وتسجيله من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الصحية التابعة للمعهد المكسيكي للبحوث الاجتماعية (R-2021-785-092).

1. إزالة الأنسجة الدهنية من الفئران عن طريق الاستئصال الجراحي

1. تحضير أنبوبين مخروطيين مع 20 مل من محلول مضاد حيوي ملحي معقم 1x فوسفات (PBS-AA) (1x PBS ، جنتاميسين [20 ميكروغرام / مل] ، وأمفوتريسين [0.5 ميكروغرام / مل]) والحفاظ على الجليد.
2. حدد اثنين من ذكور الفئران Sprague Dawl....

النتائج

تم الحصول على الأنسجة الدهنية من فئران Sprague Dawley البالغة من العمر 3-4 أشهر ويبلغ وزن جسمها 401 ± 41 جم (المتوسط الهندسي ± SD). تتوافق القيمة المتوسطة البالغة 3.8 جم من الأنسجة الدهنية البربخية وحول الكلى مع تحليل 15 عملية استخراج تجريبية. بعد 24 ساعة من الثقافة ، ظلت مجموعات الخلايا ملتصقة بالسطح البل.......

Discussion

في العقود الأربعة الماضية منذ اكتشاف MSCs ، وصفت عدة مجموعات من الباحثين إجراءات الحصول على MSCs من الأنسجة والأنواع المختلفة. واحدة من مزايا استخدام الفئران كنموذج حيواني هي سهولة صيانتها وتطورها السريع ، فضلا عن سهولة الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية. تم وصف مصادر الأنسجة المختلفة للحصول ع?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025