Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley

Резюме

В этом протоколе описывается методология выделения и идентификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученных из жировой ткани, от крыс Sprague Dawley.

Аннотация

Взрослые мезенхимальные клетки произвели революцию в молекулярной и клеточной биологии в последние десятилетия. Они могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток, в дополнение к их большой способности к самообновлению, миграции и пролиферации. Жировая ткань является одним из наименее инвазивных и наиболее доступных источников мезенхимальных клеток. Также сообщалось, что он имеет более высокие урожаи по сравнению с другими источниками, а также превосходные иммуномодулирующие свойства. В последнее время были опубликованы различные процедуры получения взрослых мезенхимальных клеток из разных источников тканей и видов животных. Оценив критерии некоторых авторов, мы стандартизировали методологию, которая применима к разным целям и легко воспроизводима. Пул стромально-васкулярной фракции (СВФ) из околопочечной и придатковой жировой ткани позволил разработать первичные культуры с оптимальной морфологией и функциональностью. Наблюдалось, что клетки прилипали к пластиковой поверхности в течение 24 часов и проявляли фибробластоподобную морфологию с удлинениями и тенденцией к образованию колоний. Методы проточной цитометрии (ФК) и иммунофлуоресценции (ИФ) использовались для оценки экспрессии мембранных маркеров CD105, CD9, CD63, CD31 и CD34. Способность стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ИСС), дифференцироваться в адипогенную линию также оценивалась с использованием коктейля факторов (инсулин 4 мкМ, 3-метил-изо-бутилксантин 0,5 мМ и дексаметазон 1 мкМ). Через 48 ч наблюдалась постепенная потеря морфологии фибробластоидов, а через 12 дней было подтверждено наличие липидных капель, положительных для окрашивания масла в красный цвет. Таким образом, предложена процедура получения оптимальных и функциональных культур ASC для применения в регенеративной медицине.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) оказали сильное влияние на регенеративную медицину из-за их высокой способности к самообновлению, пролиферации, миграции и дифференцировке в различные клеточные линии ^1,2. В настоящее время большое количество исследований сосредоточено на их потенциале для лечения и диагностики различных заболеваний.

Существуют различные источники мезенхимальных клеток: костный мозг, скелетные мышцы, амниотическая жидкость, волосяные фолликулы, плацента и жировая ткань. Их получают от разных видов, включая людей, мышей, крыс, собак и лошадей³. МСК, полученные из костного мозга (BMSC), уже много лет используются в качестве основного источника стволовых клеток в регенеративной медицине и в качестве альтернативы использованию эмбриональных стволовых клеток⁴. Тем не менее, МСК, полученные из жировой ткани, или стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ASC), являются важной альтернативой с большими преимуществами из-за простоты их сбора и выделения, а также выхода клеток, полученных на грамм жировой ткани ^5,6. Сообщалось, что урожайность ИСС, как правило, выше, чем у БМСК⁷. Первоначально было высказано предположение, что репаративная/регенеративная способность ИСС обусловлена их способностью дифференцироваться в другие клеточные линии⁸. Однако исследования последних лет подтвердили первостепенную роль паракринных факторов, выделяемых ИСС, в их репаративном потенциале ^9,10.

Жировая ткань (АТ), помимо того, что является энергетическим резервом, взаимодействует с эндокринной, нервной и сердечно-сосудистой системами. Он также участвует в постнатальном росте и развитии, поддержании гомеостаза тканей, восстановлении и регенерации тканей. АТ состоит из адипоцитов, клеток гладких мышц сосудов, эндотелиальных клеток, фибробластов, моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, преадипоцитов и ИСС. Последние играют важную роль в регенеративной медицине из-за их низкой иммуногенности^11,12. ASC могут быть получены путем ферментативного расщепления и механической обработки или эксплантатами жировой ткани. Первичные культуры ИСС легко поддерживать, выращивать и расширять. Фенотипическая характеристика ИСС имеет важное значение для проверки идентичности клеток путем оценки экспрессии специфических мембранных маркеров с использованием таких методов, как иммунофлуоресценция и проточная цитометрия¹³. Международная федерация жировой терапии и науки (IFATS) и Международное общество клеточной терапии (ISCT) определили, что ASC экспрессируют CD73, CD90 и CD105, в то время как в них отсутствует экспрессия CD11b, CD14, CD19, CD45 и HLA-DR¹⁴. Таким образом, эти маркеры, как положительные, так и отрицательные, считаются надежными для характеристики ИСС.

Этот проект был сосредоточен на описании процедуры выделения и идентификации взрослых мезенхимальных клеток, извлеченных из АТ крыс, поскольку этот источник клеток не представляет этических проблем, в отличие от эмбриональных стволовых клеток. Это делает процедуру жизнеспособным вариантом из-за простоты доступа и минимально инвазивного метода по сравнению со стволовыми клетками, полученными из костного мозга.

Мезенхимальные клетки из этого тканевого источника играют важную роль в регенеративной медицине из-за их иммуномодулирующих способностей и низкого иммунного отторжения. Таким образом, настоящее исследование является фундаментальной частью будущих исследований их секретома и их применения в качестве регенеративной терапии при различных заболеваниях, включая метаболические заболевания, такие как диабет.

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с мексиканскими рекомендациями по уходу за животными, основанными на рекомендациях Международной ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Протокол был рассмотрен, одобрен и зарегистрирован Комитетом по этике исследований в области здравоохранения Мексиканского социального института (R-2021-785-092).

1. Удаление жировой ткани у крыс путем хирургической резекции

1. Подготовьте две конические пробирки с 20 мл стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора антибиотика (PBS-AA) (1x PBS, гентамицин [20 мкг / мл] и амфотерицин [0,5 мкг / мл]) и держите на льду.
2. Выберите двух взрослых самцов крыс породы Sprague Dawley (R. norvegicus) в хорошем состоянии здоровья. Убедитесь, что крысы находятся в возрасте от 3 до 4 месяцев и имеют общий вес 350-450 г.
3. Приступайте к седации 20 мг / кг гидрохлорида ксилазина, а через 5 минут введите анестетик в дозе 120 мг / кг гидрохлорида кетамина внутрибрюшинно. Смажьте оба глаза офтальмологической мазью, чтобы предотвратить высыхание. Затем подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса.
4. Побрейте и продезинфицируйте брюшную и паховую область раствором йода. Применяйте хирургические простыни для поддержания стерильности. Затем сделайте срединный продольный разрез от грудины до области яичек.
5. Удалите жировую ткань, окружающую придаток яичка и почки, стерильными щипцами и поместите в 1x раствор PBS-AA. Храните образцы на льду.
6. Зашивайте разрез, если это требуется в соответствии с руководящими принципами учреждения, и усыпляйте животных внутрисердечной дозой 40 мг / кг пентобарбитала натрия. Как только смерть будет подтверждена, утилизируйте тушу в соответствии с институциональной процедурой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смерть вызывает сигнальные механизмы, которые влияют на иммунофенотип, способность к дифференцировке и паракринный эффект мезенхимальных клеток. Следовательно, сбор тканей проводится перед эвтаназией. 

2. Выделение мезенхимальных клеток из жировой ткани

1. Удалите жировую ткань стерильными щипцами в шкафу биобезопасности и поместите ее на стерильную фильтровальную бумагу в чашку Петри диаметром 100 мм, чтобы поглотить излишки PBS.
2. Перенесите жировую ткань в другую чашку Петри и выполните три промывки в течение 5 минут каждое 10 мл 1x раствора PBS-AA с помощью пипетки объемом 10 мл.
3. Механически разложите ткань на фрагменты примерно по 1 см² с помощью ножниц и скальпеля.
4. Приготовьте коллагеназу IV типа (0,075%) в 20 мл модифицированной среды Дульбекко (DMEM) без добавок. Фильтруйте через шприцевой фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 37 °C.
5. Добавьте раствор коллагеназы (20 мл), приготовленный на этапе 2.4, в кристаллический стакан с фрагментированной тканью и магнитным стержнем. Закройте контейнер и инкубируйте при медленном и непрерывном перемешивании при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное переваривание занимает около 90 минут (поддерживайте медленное перемешивание, чтобы сохранить целостность клеточных мембран).
6. Отфильтруйте гомогенат через фильтр из нержавеющей стали 40 меш с апертурой 0,38 мм на чашке Петри диаметром 100 мм и соберите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
7. Добавьте 20 мл подогретого ДМЭМ (10% фетальная бычья сыворотка [FBS], 2 мМ глютамина, 2 мМ пирувата натрия, 100-кратный раствор заменимых аминокислот и 100-кратный антимикотический раствор антибиотика [АА]). Осторожно суспендировать стромально-васкулярную фракцию (СВЕ).
8. Центрифугируйте клеточную суспензию при 290 x g в течение 10 мин, выбросьте надосадочную жидкость пипеткой объемом 25 мл и осторожно промойте клетки 40 мл среды DMEM без добавок.
9. Повторите этот шаг. Используйте новую стерильную коническую трубку между шагами, чтобы протащить наименьшее количество клеточного детрита и жира.
10. Суспендировать гранулы в 5 мл дополненного ДМЭМ с помощью пипетки объемом 5 мл и переложить во флакон Т-25 см² . Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂.
11. На следующий день выполните три промывания 5 мл подогретого 1x PBS-AA и два промывания без добавок DMEM для удаления клеточного мусора и неадгезивных клеток. Добавьте 5 мл свежего, подогретого, дополненного ДМЭМ пипеткой объемом 5 мл и меняйте среду каждые 3-4 дня.

3. Сохранение и расширение первичных культур ИСС

1. Как только клетки достигнут слияния 90%-100% (8 ± 2 дня), дважды промойте 5 мл ДМЭМ без добавок. Добавьте 1 мл подогретого 0,025% трипсина-2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируйте в течение 5-7 минут при 37 ° C.
2. Когда клеточный монослой отслоится, добавьте 4 мл дополненного DMEM и аккуратно дезагрегируйте клеточную суспензию.
3. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл, добавьте 5 мл нагретого дополненного DMEM и осторожно суспендируйте для гомогенизации.
4. Центрифуга при 290 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно смешайте гранулы с 1 мл добавленного ДМЭМ. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра после окрашивания трипановым синим.
5. Наконец, высевают 2,5 x 10³ ячейки / см² с соотношением сторон 1: 4 в колбах Т-75. Этот этап обеспечивает образование колоний и высокую скорость пролиферации.

4. Морфологическая характеристика первичных культур ИСС

1. Наблюдайте морфологию ИСС при инвертированной микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой для гистологии и идентификации ASC обработайте покровные стекла 1% раствором желатина. Облучать ультрафиолетом в течение 15 мин.
   1. Извлеките покровные стекла из 70% раствора этанола и дайте им высохнуть в течение 5 минут.
   2. Погрузите покровные стекла в стерильный 1% раствор желатина, слейте воду и высушите при комнатной температуре (RT).
   3. Поместите каждое покровное стекло в каждую лунку 6-луночной пластины и облучайте пластины ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
   4. Засейте каплю, содержащую 25 x 10³ клеток, в центр лунки, подождите 1 минуту и добавьте 1 мл добавленной среды DMEM. Инкубировать в течение 96 ч при 37 °C и 5% CO₂.
   5. Удалите среду и выполните три стирки 1x PBS-AA с помощью пипетки для переноса.
   6. Добавьте 1 мл 3,5% нейтрального формалина в каждую лунку и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Осторожно удалите формалин и добавьте 1 мл холодного 70% этанола в каждую лунку.
   7. Запечатайте пластину парапленкой до использования, чтобы предотвратить высыхание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная морфология ИСС также оценивается путем окрашивания гематоксилин-эозином во время различных пассажей.
   8. Удалите 70% этанола из каждой лунки и гидратируйте клетки в течение 5 минут дистиллированной водой. Тем временем отфильтруйте окрашивающие растворы.
   9. Удалите воду и окрашивайте клетки при медленном перемешивании в течение 15 минут раствором гематоксилина Харриса.
   10. Удалите пятновыводящий раствор и выполните две стирки с 1x PBS.
   11. Окрашивают клетки раствором эозина при медленном перемешивании в течение 1 мин. Затем удалите раствор и выполните две стирки с 1x PBS.
   12. Осторожно снимите покровные стекла с каждой лунки и установите направляющие на каплю монтажного раствора PBS-глицерина (1:1 v/v).
   13. Нанесите линию лака для ногтей вокруг покровного стекла и понаблюдайте за гистологическими предметными стеклами под световым микроскопом.

5. Маркеры экспрессии ИСС методом иммунофлюоресценции

1. Подготовьте буфер для стирки, содержащий 1x PBS-0,05% Tween 20. Выполняйте стирку при RT и медленном встряхивании. Вымойте пластины три раза с 2 мл буфера/лунки (выдерживайте в течение 3 минут при каждой стирке).
2. Поместите 1 мл блокирующего реагента (1:10) и инкубируйте при медленном перемешивании в течение 20 минут.
3. Добавьте 200 мкл (разведение 1:50) следующих первичных антител в каждую лунку: CD9 (моноклональная мышь), CD34 (поликлональный кролик) и анти-CD63 (поликлональная коза). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
4. Вымойте пластины еще раз три раза и инкубируйте с 200 мкл (разведение 1:50) следующих вторичных антител: конъюгированный козий IgG FITC против мыши, IgG DyeLight 550 против осла и IgG Cy3 против коз против кролика.
5. Промойте три раза 1x PBS-0,05% Tween 20 и покрасьте ядра клеток 100 мкл DRAQ-7 (разведение: 17 мкл в 1 мл двойной дистиллированной воды) в течение 20 мин.
6. Вымойте еще три раза и установите горки в соответствии с шагами 4.1.12-4.1.13. Храните образцы в защищенном от света и замороженном месте до использования.
7. Визуализируйте образцы при эпифлуоресцентной конфокальной микроскопии, используя соответствующие настройки и программное обеспечение, рекомендованное для этого оборудования.

6. Маркеры экспрессии ИСС методом проточной цитометрии

1. Отрегулируйте одноклеточную суспензию из трипсинизированных или размороженных клеток (субпассажи 3 или 4) в концентрации 1 x 10⁶ клеток / мл 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 мкл со 100 000 клеток в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Используйте одну аликвоту без маркировки для контроля автофлуоресценции.
2. Добавьте в остальное все необходимое количество Anti-CD105 AF-594 и Anti-CD31 AF-680 в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать в темноте 20 мин при 4 °C.
3. Отмойте излишки пятна 1 мл 1x PBS-5% FBS центрифугированием при 250 x g в течение 5 мин и суспендируйте в 300 мкл 1% формалина.
4. Выполните сбор образца на проточном цитометре. Стратегия стробирования ячеек основана на стробировании FSC-A против SSC-A, одиночные клетки закрыты с использованием SSC-H против SSC-A, за которыми следует FSC-A против FSC-H.
5. Используйте детектор Y610-mCherry-A для CD105 AF-594 и детектор R660-APC-A для CD31 AF-680.

7. Дифференциация ИСС в адипогенную линию

1. В 6-луночную пластину высевают 1 x 10 4 клеток (^P-4) на см 2 и инкубируют при 37 ° C, 5% CO₂, до слияния 60-80% (~ 72-96 ч). Индуцируют дифференцировку, применяя непосредственно к питательной среде: 4 мкМ инсулина, 1 мкМ дексаметазона 21-ацетата (Dxa) и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (MIX). Меняйте дифференцированную среду каждые 2-3 дня.
2. Приготовьте исходный раствор 800 мкМ инсулина в 2 мл стерильной сверхчистой воды (добавьте 20 мкл 1 N HCl для обеспечения полного растворения) и храните при -20 °C. Добавьте 10 мкл инсулина, предварительно разбавленного 1:100, и внесите 10 мкл в конечном объеме 2 мл на лунку.
3. Приготовьте исходный раствор 1 мМ Dxa в 5 мл стерильной сверхчистой воды (обратите внимание, что полного растворения не происходит). Хранить при температуре 4 °C. Добавьте 40 мкл на лунку разбавления Dxa в соотношении 1:4.
4. Приготовьте запас из 100 мМ MIX в 2,5 мл 0,1 N NaOH, вихревой и добавьте 40 мкл 1 N NaOH для полного растворения. Хранить при температуре -70 °C. Добавьте 10 мкл / лунку бульона MIX.
5. Перед хранением отфильтруйте исходные растворы через стерильный шприцевой фильтр размером 0,22 мкм.
6. На 12-й день трижды промойте клетки 1x PBS и инкубируйте с 500 мкл 4% формалина в течение 1 ч при ЛТ. Промойте каждую лунку дважды дистиллированной водой, затем 60% изопропанолом в течение 5 мин и дайте высохнуть.
7. Добавьте 0,5% масляный красный O, разбавленный 60% изопропанолом (500 мкл / лунка), и инкубируйте в течение 20 мин при RT. Промойте 1 мл дистиллированной воды три раза и наблюдайте под перевернутым микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о необходимых реагентах, оборудовании и материалах см. в таблице материалов.

Результаты

Жировая ткань была получена от взрослых крыс Sprague Dawley в возрасте 3-4 месяцев и с массой тела 401 ± 41 г (среднее геометрическое ± SD). Среднее значение 3,8 г придатка яичка и околопочечной жировой ткани соответствовало анализу 15 экспериментальных экстракций. После 24 ч культивирования клеточные...

Обсуждение

За последние четыре десятилетия с момента открытия МСК несколько групп исследователей описали процедуры получения МСК из разных тканей и видов. Одним из преимуществ использования крыс в качестве животной модели является простота их содержания и быстрого развития, а также легкость по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025