Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley

Резюме

В этом протоколе описывается методология выделения и идентификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученных из жировой ткани, от крыс Sprague Dawley.

Аннотация

Взрослые мезенхимальные клетки произвели революцию в молекулярной и клеточной биологии в последние десятилетия. Они могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток, в дополнение к их большой способности к самообновлению, миграции и пролиферации. Жировая ткань является одним из наименее инвазивных и наиболее доступных источников мезенхимальных клеток. Также сообщалось, что он имеет более высокие урожаи по сравнению с другими источниками, а также превосходные иммуномодулирующие свойства. В последнее время были опубликованы различные процедуры получения взрослых мезенхимальных клеток из разных источников тканей и видов животных. Оценив критерии некоторых авторов, мы стандартизировали методологию, которая применима к разным целям и легко воспроизводима. Пул стромально-васкулярной фракции (СВФ) из околопочечной и придатковой жировой ткани позволил разработать первичные культуры с оптимальной морфологией и функциональностью. Наблюдалось, что клетки прилипали к пластиковой поверхности в течение 24 часов и проявляли фибробластоподобную морфологию с удлинениями и тенденцией к образованию колоний. Методы проточной цитометрии (ФК) и иммунофлуоресценции (ИФ) использовались для оценки экспрессии мембранных маркеров CD105, CD9, CD63, CD31 и CD34. Способность стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ИСС), дифференцироваться в адипогенную линию также оценивалась с использованием коктейля факторов (инсулин 4 мкМ, 3-метил-изо-бутилксантин 0,5 мМ и дексаметазон 1 мкМ). Через 48 ч наблюдалась постепенная потеря морфологии фибробластоидов, а через 12 дней было подтверждено наличие липидных капель, положительных для окрашивания масла в красный цвет. Таким образом, предложена процедура получения оптимальных и функциональных культур ASC для применения в регенеративной медицине.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) оказали сильное влияние на регенеративную медицину из-за их высокой способности к самообновлению, пролиферации, миграции и дифференцировке в различные клеточные линии ^1,2. В настоящее время большое количество исследований сосредоточено на их потенциале для лечения и диагностики различных заболеваний.

Существуют различные источники мезенхимальных клеток: костный мозг, скелетные мышцы, амниотическая жидкость, волосяные фолликулы, плацента и жировая ткань. Их получают от разных видов, включая людей, мышей, крыс, собак и лошадей³

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с мексиканскими рекомендациями по уходу за животными, основанными на рекомендациях Международной ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Протокол был рассмотрен, одобрен и зарегистрирован Комитетом по этике исследований в области здравоохранения Мексиканского социального института (R-2021-785-092).

1. Удаление жировой ткани у крыс путем хирургической резекции

1. Подготовьте две конические пробирки с 20 мл стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора антибиотика (PBS-AA) (1x ....

Результаты

Жировая ткань была получена от взрослых крыс Sprague Dawley в возрасте 3-4 месяцев и с массой тела 401 ± 41 г (среднее геометрическое ± SD). Среднее значение 3,8 г придатка яичка и околопочечной жировой ткани соответствовало анализу 15 экспериментальных экстракций. После 24 ч культивирования клеточные.......

Обсуждение

За последние четыре десятилетия с момента открытия МСК несколько групп исследователей описали процедуры получения МСК из разных тканей и видов. Одним из преимуществ использования крыс в качестве животной модели является простота их содержания и быстрого развития, а также легкость по?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025