Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Özet

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Özet

Yetişkin mezenkimal hücreler son yıllarda moleküler ve hücre biyolojisinde devrim yaratmıştır. Kendini yenileme, göç etme ve çoğalma konusundaki büyük kapasitelerine ek olarak, farklı uzmanlaşmış hücre tiplerine farklılaşabilirler. Yağ dokusu, mezenkimal hücrelerin en az invaziv ve en erişilebilir kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kaynaklara kıyasla daha yüksek verime ve üstün immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, farklı doku kaynaklarından ve hayvan türlerinden yetişkin mezenkimal hücrelerin elde edilmesi için farklı prosedürler yayınlanmıştır. Bazı yazarların kriterlerini değerlendirdikten sonra, farklı amaçlara uygulanabilir ve kolayca tekrarlanabilir bir metodolojiyi standartlaştırdık. Perirenal ve epididim yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon (SVF) havuzu, optimal morfoloji ve işlevselliğe sahip primer kültürler geliştirmemizi sağladı. Hücrelerin 24 saat boyunca plastik yüzeye yapıştığı gözlendi ve uzamalar ve koloniler oluşturma eğilimi ile fibroblast benzeri bir morfoloji sergiledi. CD105, CD9, CD63, CD31 ve CD34 membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akım sitometrisi (FC) ve immünofloresan (IF) teknikleri kullanıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) adipojenik soya farklılaşma kabiliyeti de bir faktör kokteyli (4 μM insülin, 0.5 mM 3-metil-izo-bütil-ksantin ve 1 μM deksametazon) kullanılarak değerlendirildi. 48 saat sonra, fibroblastoid morfolojide kademeli bir kayıp gözlendi ve 12 günde, yağ kırmızısı lekelenmesine pozitif lipit damlacıklarının varlığı doğrulandı. Özetle, rejeneratif tıpta uygulama için optimal ve fonksiyonel ASC kültürlerinin elde edilmesi için bir prosedür önerilmektedir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendini yenileme, çoğalma, göç etme ve farklı hücre soylarına farklılaşma konusundaki yüksek kapasiteleri nedeniyle rejeneratif tıbbı güçlü bir şekilde etkilemiştir ^1,2. Şu anda, çok sayıda araştırma, çeşitli hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyellerine odaklanmaktadır.

Farklı mezenkimal hücre kaynakları vardır: kemik iliği, iskelet kası, amniyotik sıvı, saç kökleri, plasenta ve yağ dokusu, diğerleri arasında. İnsanlar, fareler, sıçanlar, köpekler ve atlar dahil olmak üzere farklı türlerden elde edilirler³. Kemik iliği kaynaklı MSC'ler (BMSC'ler) uzun yıllardır rejeneratif tıpta önemli bir kök hücre kaynağı olarak ve embriyonik kök hücrelerin kullanımına alternatif olarak kullanılmaktadır⁴. Ancak adipoz kaynaklı MSC'ler veya adipoz kaynaklı kök hücreler (ASC'ler), toplanma ve izolasyon kolaylığının yanı sıra gram yağ dokusu başına elde edilen hücre verimi ^5,6 nedeniyle büyük avantajlara sahip önemli bir alternatiftir. ASC'lerin hasat oranının genellikle BMSC'lerinkinden daha yüksek olduğu bildirilmiştir⁷. Başlangıçta, ASC'lerin onarıcı / rejeneratif kapasitesinin, diğer hücre soylarına farklılaşma yeteneklerinden kaynaklandığı öne sürülmüştür⁸. Bununla birlikte, son yıllarda yapılan araştırmalar, ASC'ler tarafından salınan parakrin faktörlerin onarıcı potansiyellerinde birincil rolünü güçlendirmiştir ^9,10.

Yağ dokusu (AT), bir enerji rezervi olmasının yanı sıra, endokrin, sinir ve kardiyovasküler sistemlerle etkileşime girer. Ayrıca doğum sonrası büyüme ve gelişme, doku homeostazının korunması, doku onarımı ve yenilenmesinde rol oynar. AT, adipositler, vasküler düz kas hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, monositler, makrofajlar, lenfositler, preadipositler ve ASC'lerden oluşur. İkincisi, düşük immünojeniteleri nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir^11,12. ASC'ler enzimatik sindirim ve mekanik işlemle veya yağ dokusu eksplantları ile elde edilebilir. ASC'lerin birincil kültürlerinin bakımı, büyümesi ve genişletilmesi kolaydır. ASC'lerin fenotipik karakterizasyonu, immünofloresan ve akış sitometrisi¹³ gibi yöntemleri kullanarak spesifik membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hücrelerin kimliğini doğrulamak için gereklidir. Uluslararası Yağ Tedavisi ve Bilim Federasyonu (IFATS) ve Uluslararası Hücresel Terapi Derneği (ISCT), ASC'lerin CD73, CD90 ve CD105'i ifade ettiğini, ancak CD11b, CD14, CD19, CD45 ve HLA-DR¹⁴ ifadesinden yoksun olduğunu tanımlamıştır. Bu nedenle, hem pozitif hem de negatif olan bu belirteçler, ASC'lerin karakterizasyonu için güvenilir kabul edilir.

Bu proje, sıçanların AT'sinden ekstrakte edilen yetişkin mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için bir prosedürün tanımlanmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre kaynağı, embriyonik kök hücrelerin aksine, etik zorluklar sunmamaktadır. Bu, kemik iliği kaynaklı kök hücrelere kıyasla erişim kolaylığı ve minimal invaziv yöntem nedeniyle prosedürü uygulanabilir bir seçenek olarak sağlamlaştırır.

Bu doku kaynağından elde edilen mezenkimal hücreler, immünomodülatör yetenekleri ve düşük immün rejeksiyonları nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, bu çalışma, sekretomları ve diyabet gibi metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere farklı hastalıklarda rejeneratif tedavi olarak uygulamaları ile ilgili gelecekteki araştırmaların temel bir parçasıdır.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nin (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Meksika) tavsiyelerine dayanarak, Meksika Hayvan Bakımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) Sağlık Araştırmaları Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş, onaylanmış ve tescil edilmiştir.

1. Sıçanlardan yağ dokusunun cerrahi rezeksiyon ile çıkarılması

1. 20 mL steril 1x fosfat tamponlu salin-antibiyotik antimikotik (PBS-AA) çözeltisi (1x PBS, gentamisin [20 μg / mL] ve amfoterisin [0.5 μg / mL]) içeren iki konik tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
2. Sağlık durumu iyi olan iki yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanı (R. norvegicus) seçin. Sıçanların 3-4 aylık olduğundan ve 350-450 g koporal ağırlığa sahip olduklarından emin olun.
3. 20 mg / kg ksilazin hidroklorür ile sedasyona devam edin ve 5 dakika sonra intraperitoneal olarak 120 mg / kg ketamin hidroklorür dozunda bir anestezi uygulayın. Kurumayı önlemek için her iki gözü de oftalmik bir merhemle yağlayın. Ardından, pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın.
4. Karın ve kasık bölgesini iyot çözeltisi ile tıraş edin ve dezenfekte edin. Steriliteyi korumak için cerrahi örtüler uygulayın. Daha sonra, sternumdan testis bölgesine medyan uzunlamasına bir kesi yapın.
5. Hem epididimis hem de böbrekleri çevreleyen yağ dokusunu steril forseps ile çıkarın ve 1x PBS-AA çözeltisine yerleştirin. Örnekleri buz üzerinde tutun.
6. Kurumsal kılavuzlara göre gerekirse insizyonu kapalı olarak dikin ve 40 mg / kg sodyum pentobarbital intrakardiyak doz ile hayvanları ötenazi yapın. Ölüm onaylandıktan sonra, kurumsal prosedür (ler) i izleyerek karkası atın.
   NOT: Ölüm, mezenkimal hücrelerin immünofenotipini, farklılaşma kapasitesini ve parakrin etkisini etkileyen sinyal mekanizmalarını ortaya çıkarır. Bu nedenle, doku toplama ötenaziden önce gerçekleştirilir. 

2. Mezenkimal hücrelerin yağ dokusundan izolasyonu

1. Bir biyogüvenlik kabini içindeki steril forsepsli yağ dokusunu çıkarın ve fazla PBS'yi emmek için 100 mm çapında bir Petri kabında steril filtre kağıdına yerleştirin.
2. Yağ dokusunu başka bir Petri kabına aktarın ve 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 mL 1x PBS-AA çözeltisi ile her biri 5 dakika boyunca üç yıkama gerçekleştirin.
3. Makas ve neşter kullanarak dokuyu mekanik olarak yaklaşık 1^cm2'lik parçalara ayırın.
4. Kollajenaz tip IV'ü (% 0.075), takviye edilmemiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) 20 mL'sinde hazırlayın. 0,22 μm şırınga filtresinden süzün ve 37 °C'de tutun.
5. Adım 2.4'te hazırlanan kollajenaz çözeltisini (20 mL) parçalanmış doku ve manyetik bir çubukla kristal bir beher içine ekleyin. Kabı kapatın ve 37 ° C'de yavaş ve sürekli ajitasyon altında inkübe edin.
   NOT: Enzimatik sindirim yaklaşık 90 dakika sürer (hücre zarlarının bütünlüğünü korumak için yavaş karıştırmayı sürdürün).
6. Homojenatı 100 mm'lik bir Petri kabı üzerinde paslanmaz çelik, 40 ağ, 0,38 mm diyafram açıklığı filtresinden süzün ve hücre süspansiyonunu steril 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın.
7. 20 mL ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin (% 10 fetal sığır serumu [FBS], 2 mM glutamin, 2 mM sodyum piruvat, 100x esansiyel olmayan amino asit çözeltisi ve 100x antibiyotik antimikotik çözeltisi [AA]). Stromal vasküler fraksiyonu (SVE) dikkatlice askıya alın.
8. Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj edin, süpernatantı 25 mL'lik bir pipetle atın ve hücreleri 40 mL'lik takviyesiz bir DMEM ortamıyla nazikçe yıkayın.
9. Bu adımı yineleyin. En az miktarda hücresel detritus ve yağ sürüklemek için adımlar arasında yeni bir steril konik tüp kullanın.
10. Peletleri 5 mL'lik bir pipetle 5 mL takviyeli DMEM'de askıya alın ve bir T-25^cm2 şişeye aktarın. 37 ° C'de 24 saat ve % 5 CO_2'de inkübe edin.
11. Ertesi gün, hücre kalıntılarını ve yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için 5 mL ısıtılmış 1x PBS-AA ile üç yıkama ve takviye edilmemiş DMEM ile iki yıkama gerçekleştirin. 5 mL'lik bir pipetle 5 mL taze, ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin ve ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.

3. ASC birincil kültürlerinin korunması ve genişletilmesi

1. Hücreler% 90 -% 100 birleşmeye ulaştığında (8 ± 2 gün), 5 mL takviye edilmemiş DMEM ile iki kez yıkayın. 1 mL ısıtılmış% 0.025 Tripsin-2 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin.
2. Hücre tek katmanı ayrıldığında, 4 mL takviyeli DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça ayrıştırın.
3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın, 5 mL ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin ve homojenize etmek için hafifçe askıya alın.
4. 5 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti 1 mL takviyeli DMEM içinde yavaşça karıştırın. Trypan mavisi ile boyandıktan sonra Neubauer odasındaki hücreleri sayın.
5. Son olarak, T-75 şişelerinde 1:4 bölünmüş oranda 2,5 x 10³ hücre/^cm2 tohumlayın. Bu adım koloni oluşumunu ve yüksek çoğalma oranını sağlar.

4. ASC primer kültürlerinin morfoloji karakterizasyonu

1. ASC'lerin morfolojisini ters mikroskopi altında gözlemleyin.
   NOT: Histoloji ve ASC tanımlaması için montajdan önce, kapaklara %1'lik bir jelatin çözeltisi uygulayın. 15 dakika boyunca UV ile ışınlayın.
   1. Kapak kapaklarını %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve 5 dakika kurumasını bekleyin.
   2. Kapakları steril %1 jelatin çözeltisine batırın, boşaltın ve oda sıcaklığında (RT) kurutun.
   3. Her bir kapak kaymasını 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin ve plakaları 15 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın.
   4. Kuyunun ortasına 25 x 10³ hücre içeren bir damla tohumlayın, 1 dakika bekleyin ve 1 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin. 37 ° C'de 96 saat ve % 5 CO_2'de inkübe edin.
   5. Ortamı çıkarın ve bir transfer pipeti kullanarak 1x PBS-AA ile üç yıkama gerçekleştirin.
   6. Her bir kuyucuğa 1 mL% 3.5 nötr formalin ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
   7. Kurumasını önlemek için plakayı kullanana kadar parafilmle kapatın.
      NOT: ASC'lerin hücresel morfolojisi, farklı pasajlar sırasında hematoksilin-eozin boyaması ile de değerlendirilir.
   8. % 70 etanol'ü her bir kuyudan çıkarın ve hücreleri damıtılmış suyla 5 dakika nemlendirin. Bu arada, boyama çözeltilerini filtreleyin.
   9. Suyu çıkarın ve Harris'in hematoksilin çözeltisi ile 15 dakika boyunca yavaş ajitasyon altında hücreleri lekeleyin.
   10. Boyama solüsyonunu çıkarın ve 1x PBS ile iki yıkama yapın.
   11. Hücreleri 1 dakika boyunca yavaş ajitasyon altında eozin çözeltisi ile lekeleyin. Ardından, çözeltiyi çıkarın ve 1x PBS ile iki yıkama yapın.
   12. Kapak kapaklarını her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve slaytları bir damla PBS-gliserol montaj çözeltisi (1: 1 v / v) üzerine monte edin.
   13. Kapak kaymasının etrafına bir tırnak verniği çizgisi yerleştirin ve ışık mikroskobu altında histolojik slaytları gözlemleyin.

5. ASC'lerin immünofloresan ile ekspresyon belirteçleri

1. 1x PBS-0.05% Tween 20 içeren yıkama tamponunu hazırlayın. Yıkamaları RT'de ve yavaş çalkalayarak gerçekleştirin. Plakaları 2 mL tampon / kuyu ile üç kez yıkayın (her yıkama için 3 dakika inkübe edin).
2. 1 mL bloke edici reaktif (1:10) yerleştirin ve 20 dakika boyunca yavaş ajitasyonla inkübe edin.
3. Her bir kuyucuğa aşağıdaki birincil antikorlardan 200 μL (1:50 seyreltme) ekleyin: CD9 (monoklonal fare), CD34 (poliklonal tavşan) ve anti-CD63 (poliklonal keçi). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
4. Plakaları üç kez tekrar yıkayın ve aşağıdaki ikincil antikorların 200 μL (1:50 seyreltmesi) ile inkübe edin: anti fare IgG FITC konjuge keçi, eşek anti-keçi IgG DyeLight 550 ve keçi anti tavşan IgG Cy3.
5. 1x PBS-0.05% Tween 20 ile üç kez yıkayın ve hücre çekirdeklerini 20 dakika boyunca 100 μL DRAQ-7 (seyreltme: 1 mL çift damıtılmış suda 17 μL) ile karşı boyayın.
6. Üç kez daha yıkayın ve slaytları 4.1.12-4.1.13 adımlarına göre monte edin. Işıktan korunan ve dondurulan numuneleri kullanıma kadar saklayın.
7. Bu ekipman için önerilen uygun ayarları ve yazılımı kullanarak numuneleri epifloresan konfokal mikroskopi altında görselleştirin.

6. ASC'lerin akış sitometrisi ile ekspresyon belirteçleri

1. Tripsinize edilmiş veya çözülmüş hücrelerden (alt pasajlar 3 veya 4) tek bir hücre süspansiyonunu, 1 x 10⁶ hücre / mL'lik 1x PBS-5% FBS konsantrasyonunda ayarlayın. Aliquot 100 μL, 1.5 mL santrifüj tüplerinde 100.000 hücreli. Otomatik floresan kontrolü için etiketleme yapmadan bir aliquot kullanın.
2. Üreticinin talimatlarına göre tüm uygun miktarlarda Anti-CD105 AF-594 ve Anti-CD31 AF-680'i dinlenmeye ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
3. Fazla lekeyi 1 mL 1x PBS-5% FBS ile 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleme ile yıkayın ve 300 μL% 1 formalin içinde askıya alın.
4. Bir akış sitometresinde numune alımı gerçekleştirin. Hücrelerin geçit stratejisi, FSC-A ve SSC-A geçidine, SSC-H ve SSC-A kullanılarak kapılı tek hücrelere ve ardından FSC-A'ya karşı FSC-H'ye dayanmaktadır.
5. CD105 AF-594 için Y610-mCherry-A dedektörü ve CD31 AF-680 için R660-APC-A dedektörü kullanın.

7. ASC'lerin adipojenik soya farklılaşması

1. 6 delikli bir plakada, cm2 başına 1 x 10 4 hücre (^P-4 ) tohumlayın ve% 60-80 birleşime (~^72-96 saat) kadar 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin. Doğrudan kültür ortamına uygulayarak farklılaşmayı indükleyin: 4 μM insülin, 1 μM deksametazon 21-asetat (Dxa) ve 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (MIX). Farklılaştırma ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.
2. 2 mL steril ultra saf suda 800 μM insülin stok çözeltisi hazırlayın (tam çözünmeyi sağlamak için 20 μL 1 N HCl ekleyin) ve -20 ° C'de saklayın. Daha önce 1:100 oranında seyreltilmiş 10 μL insülin stoğu ekleyin ve kuyucuk başına 2 mL'lik son hacimde 10 μL uygulayın.
3. 5 mL steril ultra saf suda 1 mM Dxa'lık bir stok çözeltisi hazırlayın (tam çözünmenin gerçekleşmediğini unutmayın). 4 °C'de saklayın. Dxa stoğunun 1:4 seyreltmesinden 40 μL/kuyu ekleyin.
4. 2,5 mL 0,1 N NaOH, vorteks içinde 100 mM'lik bir MIX stoğu hazırlayın ve tam çözünme için 40 μL 1 N NaOH ekleyin. -70 °C'de saklayın. 10 μL/kuyu MIX stoğu ekleyin.
5. Stok çözeltilerini depolamadan önce 0,22 μm steril şırınga filtresinden geçirin.
6. 12. günde, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca 500 μL% 4 formalin ile inkübe edin. Her bir kuyuyu damıtılmış suyla iki kez yıkayın, ardından 5 dakika boyunca% 60 izopropanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın.
7. % 60 izopropanol (500 μL / kuyu) içinde seyreltilmiş% 0.5 yağ kırmızısı O ekleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
   NOT: Gerekli reaktifler, ekipman ve malzemeler için Malzeme Tablosuna bakın.

Sonuçlar

Yağ dokusu, 3-4 aylık ve vücut ağırlığı 401 ± 41 g (geometrik ortalama ± SD) olan yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından elde edildi. Ortalama 3.8 g epididim ve perirenal yağ dokusu değeri, 15 deneysel ekstraksiyonun analizine karşılık geldi. 24 saatlik kültürden sonra, hücre popülasyonları plastik yüzeye yapışmış kaldı ve heterojen bir morfoloji sergiledi. İlk pasaj, toplam sekiz deneyde 1.4 ± 0.6 x 10⁶ hücre verimi ile 8 ± 2 günde gerçekleştirildi. Doğrudan parlak alan g?...

Tartışmalar

MSC'lerin keşfinden bu yana geçen kırk yılda, birkaç araştırmacı grubu, MSC'leri farklı doku ve türlerden elde etmek için prosedürleri tanımlamıştır. Sıçanları bir hayvan modeli olarak kullanmanın avantajlarından biri, kolay bakım ve hızlı gelişimlerinin yanı sıra MSC'leri yağ dokusundan elde etmenin kolaylığıdır. ASC'lerin elde edilmesi için viseral, perirenal, epididim ve subkutan yağ 12,13,14,15,16 gibi farklı doku kaynakları tanımlanmıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025