Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Özet

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Özet

Yetişkin mezenkimal hücreler son yıllarda moleküler ve hücre biyolojisinde devrim yaratmıştır. Kendini yenileme, göç etme ve çoğalma konusundaki büyük kapasitelerine ek olarak, farklı uzmanlaşmış hücre tiplerine farklılaşabilirler. Yağ dokusu, mezenkimal hücrelerin en az invaziv ve en erişilebilir kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kaynaklara kıyasla daha yüksek verime ve üstün immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, farklı doku kaynaklarından ve hayvan türlerinden yetişkin mezenkimal hücrelerin elde edilmesi için farklı prosedürler yayınlanmıştır. Bazı yazarların kriterlerini değerlendirdikten sonra, farklı amaçlara uygulanabilir ve kolayca tekrarlanabilir bir metodolojiyi standartlaştırdık. Perirenal ve epididim yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon (SVF) havuzu, optimal morfoloji ve işlevselliğe sahip primer kültürler geliştirmemizi sağladı. Hücrelerin 24 saat boyunca plastik yüzeye yapıştığı gözlendi ve uzamalar ve koloniler oluşturma eğilimi ile fibroblast benzeri bir morfoloji sergiledi. CD105, CD9, CD63, CD31 ve CD34 membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akım sitometrisi (FC) ve immünofloresan (IF) teknikleri kullanıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) adipojenik soya farklılaşma kabiliyeti de bir faktör kokteyli (4 μM insülin, 0.5 mM 3-metil-izo-bütil-ksantin ve 1 μM deksametazon) kullanılarak değerlendirildi. 48 saat sonra, fibroblastoid morfolojide kademeli bir kayıp gözlendi ve 12 günde, yağ kırmızısı lekelenmesine pozitif lipit damlacıklarının varlığı doğrulandı. Özetle, rejeneratif tıpta uygulama için optimal ve fonksiyonel ASC kültürlerinin elde edilmesi için bir prosedür önerilmektedir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendini yenileme, çoğalma, göç etme ve farklı hücre soylarına farklılaşma konusundaki yüksek kapasiteleri nedeniyle rejeneratif tıbbı güçlü bir şekilde etkilemiştir ^1,2. Şu anda, çok sayıda araştırma, çeşitli hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyellerine odaklanmaktadır.

Farklı mezenkimal hücre kaynakları vardır: kemik iliği, iskelet kası, amniyotik sıvı, saç kökleri, plasenta ve yağ dokusu, diğerleri arasında. İnsanlar, fareler, sıçanlar, köpekler ve atlar dahil olmak üzere farklı türlerden elde edilirler³. Kemik ....

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nin (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Meksika) tavsiyelerine dayanarak, Meksika Hayvan Bakımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) Sağlık Araştırmaları Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş, onaylanmış ve tescil edilmiştir.

1. Sıçanlardan yağ dokusunun cerrahi rezeksiyon ile çıkarılması

1. 20 mL steril 1x fosfat tamponlu salin-antibiyotik antimikotik (PBS-AA) çözeltisi (1x PBS, gentamisin [20 μg / mL] ve amfoterisin [0.5 μg ....

Tartışmalar

MSC'lerin keşfinden bu yana geçen kırk yılda, birkaç araştırmacı grubu, MSC'leri farklı doku ve türlerden elde etmek için prosedürleri tanımlamıştır. Sıçanları bir hayvan modeli olarak kullanmanın avantajlarından biri, kolay bakım ve hızlı gelişimlerinin yanı sıra MSC'leri yağ dokusundan elde etmenin kolaylığıdır. ASC'lerin elde edilmesi için viseral, perirenal, epididim ve subkutan yağ 12,13,14,15,16 gibi farklı doku kaynakları tanımlanmıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025