Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.

Résumé

Les cellules mésenchymateuses adultes ont révolutionné la biologie moléculaire et cellulaire au cours des dernières décennies. Ils peuvent se différencier en différents types de cellules spécialisées, en plus de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de migration et de prolifération. Le tissu adipeux est l’une des sources les moins invasives et les plus accessibles de cellules mésenchymateuses. Il a également été rapporté pour avoir des rendements plus élevés par rapport à d’autres sources, ainsi que des propriétés immunomodulatrices supérieures. Récemment, différentes procédures pour obtenir des cellules mésenchymateuses adultes à partir de différentes sources de tissus et d’espèces animales ont été publiées. Après avoir évalué les critères de certains auteurs, nous avons normalisé une méthodologie applicable à différents usages et facilement reproductible. Un pool de fraction vasculaire stromale (SVF) provenant de tissus adipeux périrénaux et épididymaires nous a permis de développer des cultures primaires avec une morphologie et une fonctionnalité optimales. Les cellules ont été observées collées à la surface plastique pendant 24 h et présentaient une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste, avec des prolongements et une tendance à former des colonies. Des techniques de cytométrie en flux (FC) et d’immunofluorescence (IF) ont été utilisées pour évaluer l’expression des marqueurs membranaires CD105, CD9, CD63, CD31 et CD34. La capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA) à se différencier dans la lignée adipogène a également été évaluée à l’aide d’un cocktail de facteurs (4 μM d’insuline, 0,5 mM de 3-méthyl-iso-butyl-xanthine et 1 μM de dexaméthasone). Après 48 h, une perte progressive de la morphologie fibroblastoïde a été observée, et à 12 jours, la présence de gouttelettes lipidiques positives à la coloration rouge d’huile a été confirmée. En résumé, une procédure est proposée pour obtenir des cultures d’ASC optimales et fonctionnelles pour une application en médecine régénérative.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont fortement impacté la médecine régénérative en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de prolifération, de migration et de différenciation en différentes lignées cellulaires ^1,2. Actuellement, de nombreuses recherches se concentrent sur leur potentiel pour le traitement et le diagnostic de diverses maladies.

Il existe différentes sources de cellules mésenchymateuses: moelle osseuse, muscle squelettique, liquide amniotique, follicules pileux, placenta et tissu adipeux, entre autres. Ils sont obtenus à partir de différentes espèces, y compris les humains, les souris, les rats, les chiens et les chevaux³. Les CSM dérivées de la moelle osseuse (CSMB) sont utilisées depuis de nombreuses années comme source majeure de cellules souches en médecine régénérative et comme alternative à l’utilisation de cellules souches embryonnaires⁴. Cependant, les CSM dérivées du tissu adipeux, ou cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA), sont une alternative importante avec de grands avantages en raison de leur facilité de collecte et d’isolement, ainsi que du rendement en cellules obtenues par gramme de tissu adipeux ^5,6. Il a été signalé que le taux de récolte des ASC est généralement plus élevé que celui des CSB⁷. Il a été initialement proposé que la capacité réparatrice / régénérative des ASC était due à leur capacité à se différencier en d’autres lignées cellulaires⁸. Cependant, les recherches menées ces dernières années ont renforcé le rôle primordial des facteurs paracrines libérés par les ASC dans leur potentiel réparateur ^9,10.

Le tissu adipeux (AT), en plus d’être une réserve d’énergie, interagit avec les systèmes endocrinien, nerveux et cardiovasculaire. Il est également impliqué dans la croissance et le développement postnatals, le maintien de l’homéostasie tissulaire, la réparation des tissus et la régénération. L’AT est composé d’adipocytes, de cellules musculaires lisses vasculaires, de cellules endothéliales, de fibroblastes, de monocytes, de macrophages, de lymphocytes, de préadipocytes et d’ASC. Ces derniers possèdent un rôle important en médecine régénérative en raison de leur faible immunogénicité^11,12. Les ASC peuvent être obtenus par digestion enzymatique et traitement mécanique ou par explants de tissu adipeux. Les cultures primaires des ASC sont faciles à maintenir, à développer et à développer. La caractérisation phénotypique des ASC est essentielle pour vérifier l’identité des cellules en évaluant l’expression de marqueurs membranaires spécifiques à l’aide de méthodes telles que l’immunofluorescence et la cytométrie en flux¹³. L’International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) et l’International Society for Cellular Therapy (ISCT) ont défini que les ASC expriment CD73, CD90 et CD105, tout en manquant de l’expression de CD11b, CD14, CD19, CD45 et HLA-DR¹⁴. Ces marqueurs, tant positifs que négatifs, sont donc considérés comme fiables pour la caractérisation des ASC.

Ce projet était axé sur la description d’une procédure d’isolement et d’identification de cellules mésenchymateuses adultes extraites de l’AT de rats, car cette source de cellules ne présente pas de défis éthiques, contrairement aux cellules souches embryonnaires. Cela solidifie la procédure en tant qu’option viable en raison de la facilité d’accès et de la méthode peu invasive par rapport aux cellules souches dérivées de la moelle osseuse.

Les cellules mésenchymateuses de cette source tissulaire jouent un rôle important dans la médecine régénérative en raison de leurs capacités immunomodulatrices et de leur faible rejet immunitaire. Par conséquent, la présente étude est un élément fondamental de la recherche future sur leur sécrétome et leur application en tant que thérapie régénérative dans différentes maladies, y compris les maladies métaboliques telles que le diabète.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices mexicaines sur les soins aux animaux, basées sur les recommandations de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexique). Le protocole a été examiné, approuvé et enregistré par le Comité d’éthique pour la recherche en santé de l’Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Ablation du tissu adipeux de rats par résection chirurgicale

1. Préparer deux tubes coniques avec 20 mL de solution antimycotique saline-antibiotique tamponnée au phosphate 1x (PBS-AA) stérile (1x PBS, gentamicine [20 μg/mL] et amphotéricine [0,5 μg/mL]) et conserver sur la glace.
2. Choisissez deux rats Sprague Dawley mâles adultes (R. norvegicus) en bonne santé. Assurez-vous que les rats ont entre 3-4 mois et ont un poids cooral de 350-450 g.
3. Procéder à la sédation avec 20 mg / kg de chlorhydrate de xylazine et, 5 minutes plus tard, administrer un anesthésique à une dose de 120 mg / kg de chlorhydrate de kétamine par voie intrapéritonéale. Lubrifiez les deux yeux avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement. Ensuite, confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale.
4. Rasez et désinfectez la région abdominale et inguinelle avec une solution d’iode. Appliquez des champs chirurgicaux pour maintenir la stérilité. Ensuite, faites une incision longitudinale médiane du sternum à la région testiculaire.
5. Retirer le tissu adipeux entourant l’épididyme et les reins avec une pince stérile et placer dans la solution 1x PBS-AA. Conservez les échantillons sur la glace.
6. Suturer l’incision fermée si nécessaire selon les directives institutionnelles et euthanasier les animaux avec une dose intracardiaque de 40 mg / kg de pentobarbital sodique. Une fois le décès confirmé, éliminer la carcasse en suivant la ou les procédures institutionnelles.
   REMARQUE: La mort provoque des mécanismes de signalisation qui affectent l’immunophénotype, la capacité de différenciation et l’effet paracrine des cellules mésenchymateuses. Par conséquent, la collecte de tissus est effectuée avant l’euthanasie. 

2. Isolement des cellules mésenchymateuses du tissu adipeux

1. Retirez le tissu adipeux à l’aide d’une pince stérile dans une enceinte de biosécurité et placez-le sur du papier filtre stérile dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre pour absorber l’excès de PBS.
2. Transférer le tissu adipeux dans une autre boîte de Petri et effectuer trois lavages de 5 minutes chacun avec 10 ml de 1x solution PBS-AA à l’aide d’une pipette de 10 ml.
3. Désagréger mécaniquement le tissu en fragments d’environ 1 cm² à l’aide de ciseaux et d’un scalpel.
4. Préparer la collagénase de type IV (0,075 %) dans 20 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) non supplémenté. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm et maintenir à 37 °C.
5. Ajouter la solution de collagénase (20 mL) préparée à l’étape 2.4 dans un bécher en cristal avec le tissu fragmenté et une barre magnétique. Sceller le récipient et incuber sous agitation lente et continue à 37 °C.
   REMARQUE: La digestion enzymatique dure environ 90 minutes (maintenir une agitation lente pour préserver l’intégrité des membranes cellulaires).
6. Filtrer l’homogénat à travers un filtre à 40 mailles en acier inoxydable à ouverture de 0,38 mm sur une boîte de Petri de 100 mm et recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 50 mL.
7. Ajouter 20 mL de DMEM réchauffé et supplémenté (sérum bovin fœtal à 10 %, glutamine 2 mM, pyruvate de sodium 2 mM, solution d’acides aminés non essentiels 100x et solution antimycotique antibiotique [AA] 100x). Suspendre délicatement la fraction vasculaire stromale (SVE).
8. Centrifuger la suspension cellulaire à 290 x g pendant 10 min, jeter le surnageant avec une pipette de 25 ml et laver délicatement les cellules avec 40 mL d’un milieu DMEM non supplémenté.
9. Répétez cette étape. Utilisez un nouveau tube conique stérile entre les étapes pour faire glisser le moins de détritus cellulaires et de graisse.
10. Suspendre la pastille dans 5 mL de DMEM supplémenté avec une pipette de 5 mL et transférer dans une bouteille T-25 cm² . Incuber pendant 24 h à 37 °C et 5% CO₂.
11. Le lendemain, effectuez trois lavages avec 5 mL de 1x PBS-AA chauffé et deux lavages avec du DMEM non supplémenté pour éliminer les débris cellulaires et les cellules non adhérentes. Ajouter 5 ml de DMEM frais, réchauffé et supplémenté à l’aide d’une pipette de 5 ml et changer le milieu tous les 3-4 jours.

3. Maintien et expansion des cultures primaires de l’ASC

1. Une fois que les cellules atteignent 90% - 100% de confluence (8 ± 2 jours), laver deux fois avec 5 ml de DMEM non supplémenté. Ajouter 1 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) réchauffé à 0,025 % de trypsine-2 mM et incuber pendant 5 à 7 minutes à 37 °C.
2. Lorsque la monocouche cellulaire est détachée, ajouter 4 mL de DMEM supplémenté et désagréger doucement la suspension cellulaire.
3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, ajouter 5 mL de DMEM réchauffé et supplémenté et suspendre doucement pour homogénéiser.
4. Centrifuger à 290 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et mélanger délicatement la pastille dans 1 mL de DMEM supplémenté. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer après coloration au bleu de trypan.
5. Enfin, semer 2,5 x 10³ cellules/^cm2 à un rapport fractionné de 1:4 dans des fioles T-75. Cette étape assure la formation de colonies et un taux de prolifération élevé.

4. Caractérisation morphologique des cultures primaires ASC

1. Observer la morphologie des ASC sous microscopie inversée.
   REMARQUE: Avant le montage pour l’histologie et l’identification ASC, traiter les lamelles de couverture avec une solution de gélatine à 1%. Irradier aux UV pendant 15 min.
   1. Retirer les lamelles de couverture de la solution d’éthanol à 70% et les laisser sécher pendant 5 min.
   2. Immerger les lames de couverture dans une solution stérile de gélatine à 1 %, égoutter et sécher à température ambiante (RT).
   3. Placez chaque lamelle de couverture dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et irradiez les plaques avec de la lumière UV pendant 15 min.
   4. Ensemencer une goutte contenant 25 x 10³ cellules au centre du puits, attendre 1 min et ajouter 1 mL de milieu DMEM supplémenté. Incuber pendant 96 h à 37 °C et 5% CO₂.
   5. Retirez le milieu et effectuez trois lavages avec 1x PBS-AA à l’aide d’une pipette de transfert.
   6. Ajouter 1 mL de formol neutre à 3,5 % dans chaque puits et incuber pendant 1 h à TA. Retirer délicatement le formol et ajouter 1 mL d’éthanol froid à 70 % dans chaque puits.
   7. Sceller la plaque avec du parafilm jusqu’à utilisation, pour éviter le dessèchement.
      NOTE: La morphologie cellulaire des ASC est également évaluée par coloration de l’hématoxyline-éosine au cours de différents passages.
   8. Retirez l’éthanol à 70% de chaque puits et hydratez les cellules pendant 5 min avec de l’eau distillée. Pendant ce temps, filtrer les solutions de coloration.
   9. Retirer l’eau et colorer les cellules sous agitation lente pendant 15 min avec la solution d’hématoxyline de Harris.
   10. Retirez la solution de coloration et effectuez deux lavages avec 1x PBS.
   11. Colorer les cellules avec une solution d’éosine sous agitation lente pendant 1 min. Ensuite, retirez la solution et effectuez deux lavages avec 1x PBS.
   12. Retirez délicatement les lames de couvercle de chaque puits et montez les lames sur une goutte de solution de montage PBS-glycérol (1:1 v/v).
   13. Placez une ligne de vernis à ongles autour de la lamelle de couverture et observez les lames histologiques au microscope optique.

5. Marqueurs d’expression des ASC par immunofluorescence

1. Préparez le tampon de lavage contenant 1x PBS-0,05% Tween 20. Effectuer les lavages à RT et avec des secousses lentes. Lavez les assiettes trois fois avec 2 ml de tampon/puits (incuber pendant 3 min pour chaque lavage).
2. Placer 1 mL de réactif bloquant (1:10) et incuber en agitant lentement pendant 20 min.
3. Ajouter 200 μL (dilution 1:50) des anticorps primaires suivants dans chaque puits : CD9 (souris monoclonale), CD34 (lapin polyclonal) et anti-CD63 (chèvre polyclonale). Incuber pendant une nuit à 4 °C.
4. Laver les plaques trois fois de nouveau et incuber avec 200 μL (dilution 1:50) des anticorps secondaires suivants: chèvre conjuguée anti-souris IgG FITC, âne anti-chèvre IgG DyeLight 550 et chèvre anti-lapin IgG Cy3.
5. Laver trois fois avec 1x PBS-0,05% Tween 20 et contre-colorer les noyaux cellulaires avec 100 μL de DRAQ-7 (dilution: 17 μL dans 1 mL d’eau distillée double) pendant 20 min.
6. Lavez trois fois de plus et montez les lames conformément aux étapes 4.1.12-4.1.13. Conservez les échantillons à l’abri de la lumière et congelés jusqu’à utilisation.
7. Visualisez les échantillons sous microscopie confocale à épifluorescence à l’aide des paramètres appropriés et du logiciel recommandé pour cet équipement.

6. Marqueurs d’expression des ASC par cytométrie de flux

1. Ajuster une suspension unicellulaire à partir de cellules trypsinisées ou décongelées (sous-passages 3 ou 4) à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL de 1x PBS-5% FBS. Aliquote 100 μL avec 100 000 cellules dans des tubes centrifugeuses de 1,5 mL. Utilisez une partie aliquote sans marquage pour le contrôle de l’autofluorescence.
2. Ajouter au repos toutes les quantités appropriées d’Anti-CD105 AF-594 et d’Anti-CD31 AF-680, selon les instructions du fabricant. Incuber dans l’obscurité pendant 20 min à 4 °C.
3. Laver l’excès de tache avec 1 mL de 1x PBS-5% FBS par centrifugation à 250 x g pendant 5 min et suspendre dans 300 μL de formol à 1%.
4. Effectuer l’acquisition d’échantillons sur un cytomètre en flux. La stratégie de contrôle des cellules est basée sur le contrôle FSC-A par rapport à SSC-A, les cellules individuelles sont fermées en utilisant SSC-H par rapport à SSC-A suivies de FSC-A par rapport à FSC-H.
5. Utilisez le détecteur Y610-mCherry-A pour le détecteur CD105 AF-594 et le détecteur R660-APC-A pour CD31 AF-680.

7. Différenciation des ASC par rapport à la lignée adipogène

1. Dans une plaque à 6 puits, ensemencer 1 x 10 4 cellules (^P-4) par cm2 et incuber à 37 °C, 5% CO₂, jusqu’à confluence à 60-80% (~^72-96 h). Induire la différenciation, en appliquant directement sur le milieu de culture : 4 μM d’insuline, 1 μM de dexaméthasone 21-acétate (Dxa), et 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (MIX). Changez le milieu de différenciation tous les 2-3 jours.
2. Préparer une solution mère d’insuline 800 μM dans 2 mL d’eau ultrapure stérile (ajouter 20 μL de HCl 1 N pour assurer une dissolution complète) et conserver à -20 °C. Ajouter 10 μL de stock d’insuline, préalablement dilué 1:100, et appliquer 10 μL à un volume final de 2 mL par puits.
3. Préparer une solution mère de 1 mM Dxa dans 5 mL d’eau ultrapure stérile (notez qu’il n’y a pas dissolution complète). Conserver à 4 °C. Ajouter 40 μL/puits d’une dilution 1:4 du stock de Dxa.
4. Préparer un bouillon de 100 mM de MIX dans 2,5 mL de NaOH 0,1 N, vortex, et ajouter 40 μL de NaOH 1 N pour une dissolution complète. Conserver à -70 °C. Ajouter 10 μL/puits de bouillon MIX.
5. Filtrer les solutions mères à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm avant de les stocker.
6. Le jour 12, laver les cellules trois fois avec 1x PBS et incuber avec 500 μL de formol à 4 % pendant 1 h à TA. Laver chaque puits deux fois avec de l’eau distillée suivie de 60% d’isopropanol pendant 5 min et laisser sécher.
7. Ajouter 0,5 % de rouge d’huile O dilué dans de l’isopropanol à 60 % (500 μL/puits) et incuber pendant 20 min à TA. Laver trois fois avec 1 mL d’eau distillée et observer au microscope inversé.
   REMARQUE : Pour connaître les réactifs, l’équipement et les matériaux requis, reportez-vous au Tableau des matériaux.

Résultats

Le tissu adipeux a été obtenu à partir de rats Sprague Dawley adultes âgés de 3 à 4 mois et pesant 401 ± 41 g (moyenne géométrique ± écart-type). Une valeur moyenne de 3,8 g de tissu adipeux pérididymaire et périrénal correspondait à l’analyse de 15 extractions expérimentales. Après 24 h de culture, les populations cellulaires sont restées collées à la surface plastique et présentaient une morphologie hétérogène. Le premier passage a été réalisé à 8 ± 2 jours, avec un rendement de 1,4 ± 0...

Discussion

Au cours des quatre dernières décennies, depuis la découverte des CSM, plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des procédures pour obtenir des CSM à partir de différents tissus et espèces. L’un des avantages de l’utilisation de rats comme modèle animal est leur facilité d’entretien et leur développement rapide, ainsi que la facilité d’obtenir des CSM à partir de tissu adipeux. Différentes sources tissulaires ont été décrites pour obtenir des ASC, telles que la graisse viscérale, périrénale,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025