Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

Riepilogo

Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.

Abstract

Le cellule mesenchimali adulte hanno rivoluzionato la biologia molecolare e cellulare negli ultimi decenni. Possono differenziarsi in diversi tipi di cellule specializzate, oltre alla loro grande capacità di auto-rinnovamento, migrazione e proliferazione. Il tessuto adiposo è una delle fonti meno invasive e più accessibili di cellule mesenchimali. È stato anche segnalato per avere rese più elevate rispetto ad altre fonti, così come proprietà immunomodulatorie superiori. Recentemente sono state pubblicate diverse procedure per ottenere cellule mesenchimali adulte da diverse fonti tissutali e specie animali. Dopo aver valutato i criteri di alcuni autori, abbiamo standardizzato una metodologia applicabile a scopi diversi e facilmente riproducibile. Un pool di frazione vascolare stromale (SVF) proveniente da tessuto adiposo perirenale ed epididimo ci ha permesso di sviluppare colture primarie con morfologia e funzionalità ottimali. Le cellule sono state osservate aderire alla superficie plastica per 24 ore e hanno mostrato una morfologia simile ai fibroblasti, con prolungamenti e tendenza a formare colonie. Sono state utilizzate tecniche di citometria a flusso (FC) e immunofluorescenza (IF) per valutare l'espressione dei marcatori di membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. La capacità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) di differenziarsi nella linea adipogena è stata valutata anche utilizzando un cocktail di fattori (4 μM di insulina, 0,5 mM di 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM di desametasone). Dopo 48 ore, è stata osservata una graduale perdita della morfologia fibroblastoide e, a 12 giorni, è stata confermata la presenza di goccioline lipidiche positive alla colorazione rosso olio. In sintesi, viene proposta una procedura per ottenere colture ASC ottimali e funzionali per l'applicazione in medicina rigenerativa.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno fortemente influenzato la medicina rigenerativa grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento, proliferazione, migrazione e differenziazione in diverse linee cellulari ^1,2. Attualmente, una grande quantità di ricerca si sta concentrando sul loro potenziale per il trattamento e la diagnosi di varie malattie.

Esistono diverse fonti di cellule mesenchimali: midollo osseo, muscolo scheletrico, liquido amniotico, follicoli piliferi, placenta e tessuto adiposo, tra gli altri. Sono ottenuti da diverse specie, tra cui esseri umani, topi, ratti, cani e cavalli³. Le MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) sono state utilizzate per molti anni come fonte importante di cellule staminali nella medicina rigenerativa e come alternativa all'uso di cellule staminali embrionali⁴. Tuttavia, le MSC di derivazione adiposa, o cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC), sono un'alternativa importante con grandi vantaggi grazie alla loro facilità di raccolta e isolamento, nonché alla resa di cellule ottenute per grammo di tessuto adiposo ^5,6. È stato riportato che il tasso di raccolta degli ASC è generalmente superiore a quello dei BMSC⁷. Inizialmente è stato proposto che la capacità riparativa/rigenerativa delle ASC fosse dovuta alla loro capacità di differenziarsi in altre linee cellulari⁸. Tuttavia, la ricerca negli ultimi anni ha rafforzato il ruolo primario dei fattori paracrini rilasciati dalle ASC nel loro potenziale riparativo ^9,10.

Il tessuto adiposo (AT), oltre ad essere una riserva energetica, interagisce con i sistemi endocrino, nervoso e cardiovascolare. È anche coinvolto nella crescita e nello sviluppo postnatale, nel mantenimento dell'omeostasi dei tessuti, nella riparazione e nella rigenerazione dei tessuti. L'AT è composto da adipociti, cellule muscolari lisce vascolari, cellule endoteliali, fibroblasti, monociti, macrofagi, linfociti, preadipociti e ASC. Questi ultimi hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa della loro bassa immunogenicità^11,12. Le ASC possono essere ottenute mediante digestione enzimatica e lavorazione meccanica o mediante espianti di tessuto adiposo. Le colture primarie di ASC sono facili da mantenere, coltivare ed espandere. La caratterizzazione fenotipica delle ASC è essenziale per verificare l'identità delle cellule valutando l'espressione di specifici marcatori di membrana utilizzando metodi quali l'immunofluorescenza e la citometria a flusso¹³. L'International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e l'International Society for Cellular Therapy (ISCT) hanno definito che le ASC esprimono CD73, CD90 e CD105, mentre mancano dell'espressione di CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR¹⁴. Questi marcatori, sia positivi che negativi, sono quindi considerati affidabili per la caratterizzazione delle ASC.

Questo progetto si è concentrato sulla descrizione di una procedura per l'isolamento e l'identificazione di cellule mesenchimali adulte estratte dall'AT dei ratti, poiché questa fonte di cellule non presenta sfide etiche, a differenza delle cellule staminali embrionali. Ciò consolida la procedura come un'opzione praticabile a causa della facilità di accesso e del metodo minimamente invasivo rispetto alle cellule staminali derivate dal midollo osseo.

Le cellule mesenchimali provenienti da questa fonte tissutale hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa delle loro capacità immunomodulatorie e del basso rigetto immunitario. Pertanto, il presente studio è una parte fondamentale della ricerca futura sul loro secretoma e sulla loro applicazione come terapia rigenerativa in diverse malattie, comprese le malattie metaboliche come il diabete.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite seguendo le linee guida messicane per la cura degli animali, basate sulle raccomandazioni dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio internazionale (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Messico). Il protocollo è stato rivisto, approvato e registrato dal Comitato etico per la ricerca sanitaria dell'Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Rimozione del tessuto adiposo dai ratti mediante resezione chirurgica

1. Preparare due provette coniche con 20 ml di soluzione sterile tamponata con fosfato tampone salino-antibiotico antimicotico (PBS-AA) (1x PBS, gentamicina [20 μg/ml] e amfotericina [0,5 μg/ml]) e mantenere su ghiaccio.
2. Selezionare due ratti maschi adulti di Sprague Dawley (R. norvegicus) in buone condizioni di salute. Assicurarsi che i ratti abbiano tra i 3-4 mesi e abbiano un peso coporale di 350-450 g.
3. Procedere alla sedazione con 20 mg/kg di xilazina cloridrato e, 5 minuti dopo, somministrare un anestetico con una dose di 120 mg/kg di ketamina cloridrato per via intraperitoneale. Lubrificare entrambi gli occhi con un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione. Quindi, confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale.
4. Rasare e disinfettare la regione addominale e inguinale con una soluzione di iodio. Applicare teli chirurgici per mantenere la sterilità. Quindi, effettuare un'incisione longitudinale mediana dallo sterno alla regione testicolare.
5. Rimuovere il tessuto adiposo che circonda sia l'epididimo che i reni con una pinza sterile e posizionare nella soluzione 1x PBS-AA. Conservare i campioni sul ghiaccio.
6. Suturare l'incisione chiusa se richiesto dalle linee guida istituzionali ed eutanasia gli animali con una dose intracardiaca di 40 mg/kg di pentobarbital di sodio. Una volta confermata la morte, smaltire la carcassa seguendo la procedura o le procedure istituzionali.
   NOTA: La morte provoca meccanismi di segnalazione che influenzano l'immunofenotipo, la capacità di differenziazione e l'effetto paracrino delle cellule mesenchimali. Quindi, la raccolta dei tessuti viene eseguita prima dell'eutanasia. 

2. Isolamento di cellule mesenchimali dal tessuto adiposo

1. Rimuovere il tessuto adiposo con una pinza sterile all'interno di un armadio di biosicurezza e posizionarlo su carta da filtro sterile in una piastra di Petri di 100 mm di diametro per assorbire il PBS in eccesso.
2. Trasferire il tessuto adiposo in un'altra piastra di Petri ed eseguire tre lavaggi per 5 minuti ciascuno con 10 ml di soluzione 1x PBS-AA utilizzando una pipetta da 10 ml.
3. Disaggregare meccanicamente il tessuto in frammenti di circa 1 cm² usando forbici e bisturi.
4. Preparare la collagenasi di tipo IV (0,075%) in 20 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) non integrato. Filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e conservare a 37 °C.
5. Aggiungere la soluzione di collagenasi (20 ml) preparata al punto 2.4 in un becher di cristallo con il tessuto frammentato e una barra magnetica. Sigillare il contenitore e incubare sotto agitazione lenta e continua a 37 °C.
   NOTA: La digestione enzimatica richiede circa 90 minuti (mantenere una lenta agitazione per preservare l'integrità delle membrane cellulari).
6. Filtrare l'omogenato attraverso un filtro in acciaio inossidabile, 40 mesh, apertura 0,38 mm su una piastra di Petri da 100 mm e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 50 ml.
7. Aggiungere 20 ml di DMEM riscaldato e integrato (siero bovino fetale al 10% [FBS], 2 mM di glutammina, 2 mM di piruvato di sodio, 100x soluzione di aminoacidi non essenziali e 100x soluzione antibiotica antimicotica [AA]). Sospendere con attenzione la frazione vascolare stromale (SVE).
8. Centrifugare la sospensione cellulare a 290 x g per 10 minuti, eliminare il surnatante con una pipetta da 25 ml e lavare delicatamente le cellule con 40 ml di un mezzo DMEM non integrato.
9. Ripetere questo passaggio. Utilizzare un nuovo tubo conico sterile tra i passaggi per trascinare la minima quantità di detriti cellulari e grasso.
10. Sospendere il pellet in 5 ml di DMEM integrato con una pipetta da 5 ml e trasferire in un flacone T-25 cm² . Incubare per 24 ore a 37 °C e 5% CO₂.
11. Il giorno seguente, eseguire tre lavaggi con 5 ml di 1x PBS-AA riscaldato e due lavaggi con DMEM non integrato per rimuovere i detriti cellulari e le cellule non aderenti. Aggiungere 5 ml di DMEM fresco, riscaldato e integrato con una pipetta da 5 ml e cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni.

3. Mantenimento ed espansione delle colture primarie ASC

1. Una volta che le cellule raggiungono il 90% -100% di confluenza (8 ± 2 giorni), lavare due volte con 5 ml di DMEM non integrato. Aggiungere 1 mL di acido etilendiamminotetraacetico riscaldato allo 0,025% (EDTA) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.
2. Quando il monostrato cellulare è staccato, aggiungere 4 ml di DMEM integrato e disaggregare delicatamente la sospensione cellulare.
3. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml, aggiungere 5 ml di DMEM riscaldato e integrato e sospendere delicatamente per omogeneizzare.
4. Centrifugare a 290 x g per 5 min. Scartare il surnatante e mescolare delicatamente il pellet in 1 mL di DMEM integrato. Contare le cellule in una camera Neubauer dopo la colorazione con blu di Trypan.
5. Infine, seminare 2,5 x 10³ cellule/cm² con un rapporto di divisione di 1:4 in boccette T-75. Questo passaggio garantisce la formazione di colonie e un alto tasso di proliferazione.

4. Caratterizzazione morfologica di colture primarie ASC

1. Osservare la morfologia delle ASC al microscopio invertito.
   NOTA: Prima del montaggio per l'istologia e l'identificazione ASC, trattare i vetrini con una soluzione di gelatina all'1%. Irradiare con UV per 15 min.
   1. Rimuovere i vetrini di copertura dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarli asciugare per 5 minuti.
   2. Immergere i vetrini in una soluzione sterile di gelatina all'1%, scolarli e asciugarli a temperatura ambiente (RT).
   3. Posizionare ogni coprivetrino in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e irradiare le piastre con luce UV per 15 minuti.
   4. Seminare una goccia contenente 25 x 10³ cellule al centro del pozzetto, attendere 1 minuto e aggiungere 1 ml di mezzo DMEM integrato. Incubare per 96 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
   5. Rimuovere il fluido ed eseguire tre lavaggi con 1x PBS-AA utilizzando una pipetta di trasferimento.
   6. Aggiungere 1 ml di formalina neutra al 3,5% a ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a RT. Rimuovere con attenzione la formalina e aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 70% in ciascun pozzetto.
   7. Sigillare la piastra con parafilm fino all'uso, per evitare l'essiccazione.
      NOTA: La morfologia cellulare delle ASC viene valutata anche mediante colorazione dell'ematossilina-eosina durante diversi passaggi.
   8. Rimuovere l'etanolo al 70% da ciascun pozzetto e idratare le cellule per 5 minuti con acqua distillata. Nel frattempo, filtrare le soluzioni coloranti.
   9. Rimuovere l'acqua e macchiare le cellule sotto lenta agitazione per 15 minuti con la soluzione di ematossilina di Harris.
   10. Rimuovere la soluzione colorante ed eseguire due lavaggi con 1x PBS.
   11. Colorare le cellule con la soluzione di eosina sotto lenta agitazione per 1 minuto. Quindi, rimuovere la soluzione ed eseguire due lavaggi con 1x PBS.
   12. Rimuovere con attenzione i coperchi da ciascun pozzetto e montare i vetrini su una goccia di soluzione di montaggio PBS-glicerolo (1: 1 v / v).
   13. Posizionare una linea di smalto per unghie attorno al coprivetrino e osservare i vetrini istologici al microscopio ottico.

5. Marcatori di espressione di ASCs mediante immunofluorescenza

1. Preparare il tampone di lavaggio contenente 1x PBS-0,05% Tween 20. Eseguire i lavaggi a RT e con agitazione lenta. Lavare le piastre tre volte con 2 ml di tampone/pozzetto (incubare per 3 minuti per ogni lavaggio).
2. Introdurre 1 mL di reagente bloccante (1:10) e incubare agitando lentamente per 20 minuti.
3. Aggiungere 200 μL (diluizione 1:50) dei seguenti anticorpi primari a ciascun pozzetto: CD9 (topo monoclonale), CD34 (coniglio policlonale) e anti-CD63 (capra policlonale). Incubare per una notte a 4 °C.
4. Lavare nuovamente le piastre tre volte e incubare con 200 μL (diluizione 1:50) dei seguenti anticorpi secondari: capra coniugata IgG FITC antitopo, capra anticapra IgG DyeLight 550 e capra anti coniglio IgG Cy3.
5. Lavare tre volte con 1x PBS-0,05% Tween 20 e controcolorare i nuclei cellulari con 100 μL di DRAQ-7 (diluizione: 17 μL in 1 mL di acqua bidistillata) per 20 min.
6. Lavare altre tre volte e montare i vetrini secondo i passaggi 4.1.12-4.1.13. Conservare i campioni al riparo dalla luce e congelati fino all'uso.
7. Visualizza i campioni al microscopio confocale a epifluorescenza utilizzando le impostazioni e il software appropriati consigliati per questa apparecchiatura.

6. Marcatori di espressione di ASCs mediante citometria a flusso

1. Regolare una sospensione di una singola cellula da cellule tripsinizzate o scongelate (sottopassaggi 3 o 4) ad una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule / ml di 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL con 100.000 cellule in provette da centrifuga da 1,5 ml. Utilizzare un'aliquota senza etichettatura per il controllo dell'autofluorescenza.
2. Aggiungere a riposo tutte le quantità appropriate di Anti-CD105 AF-594 e Anti-CD31 AF-680, secondo le istruzioni del produttore. Incubare al buio per 20 minuti a 4 °C.
3. Lavare la macchia in eccesso con 1 mL di 1x PBS-5% FBS mediante centrifugazione a 250 x g per 5 minuti e sospendere in 300 μL di formalina all'1%.
4. Eseguire l'acquisizione del campione su un citometro a flusso. La strategia di gating delle celle si basa su FSC-A vs. SSC-A gating, singole celle gated utilizzando SSC-H vs. SSC-A seguito da FSC-A vs. FSC-H.
5. Utilizzare il rilevatore Y610-mCherry-A per CD105 AF-594 e R660-APC-A per CD31 AF-680.

7. Differenziazione delle ASC nella linea adipogena

1. In una piastra a 6 pozzetti, seminare 1 x 10 4 cellule (^P-4) per cm 2 e incubare a 37 °C, 5% CO₂, fino alla confluenza del 60-80% (~72-96 h). Indurre la differenziazione, applicando direttamente al terreno di coltura: 4 μM di insulina, 1 μM di desametasone 21-acetato (Dxa) e 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Cambia il mezzo di differenziazione ogni 2-3 giorni.
2. Preparare una soluzione madre di 800 μM di insulina in 2 ml di acqua ultrapura sterile (aggiungere 20 μL di 1 N HCl per garantire la completa dissoluzione) e conservare a -20 °C. Aggiungere 10 μL di scorte di insulina, precedentemente diluita 1:100, e applicare 10 μL ad un volume finale di 2 mL per pozzetto.
3. Preparare una soluzione madre di 1 mM Dxa in 5 mL di acqua ultrapura sterile (notare che non si verifica la dissoluzione completa). Conservare a 4 °C. Aggiungere 40 μL/pozzetto di una diluizione 1:4 del brodo di Dxa.
4. Preparare una scorta di 100 mM di MIX in 2,5 mL di 0,1 N NaOH, vortice, e aggiungere 40 μL di 1 N NaOH per la completa dissoluzione. Conservare a -70 °C. Aggiungere 10 μL/pozzetto di materiale MIX.
5. Filtrare le soluzioni madre attraverso un filtro a siringa sterile da 0,22 μm prima della conservazione.
6. Il giorno 12, lavare le cellule tre volte con 1x PBS e incubare con 500 μL di formalina al 4% per 1 ora a RT. Lavare ogni pozzetto due volte con acqua distillata seguita, con isopropanolo al 60% per 5 minuti e lasciare asciugare.
7. Aggiungere lo 0,5% di olio rosso O diluito in isopropanolo al 60% (500 μL/pozzetto) e incubare per 20 minuti a RT. Lavare con 1 mL di acqua distillata tre volte e osservare al microscopio invertito.
   NOTA: per i reagenti, le attrezzature e i materiali richiesti, fare riferimento alla Tabella dei materiali.

Risultati

Il tessuto adiposo è stato ottenuto da ratti adulti Sprague Dawley di età compresa tra 3 e 4 mesi e con un peso corporeo di 401 ± 41 g (media geometrica ± DS). Un valore medio di 3,8 g di tessuto adiposo epididimo e perirenale corrispondeva all'analisi di 15 estrazioni sperimentali. Dopo 24 ore di coltura, le popolazioni cellulari sono rimaste aderenti alla superficie plastica e hanno mostrato una morfologia eterogenea. Il primo passaggio è stato realizzato a 8 ± 2 giorni, con una resa di 1,4 ± 0,6 x 10⁶

Discussione

Negli ultimi quattro decenni dalla scoperta delle MSC, diversi gruppi di ricercatori hanno descritto procedure per ottenere MSC da diversi tessuti e specie. Uno dei vantaggi dell'utilizzo dei ratti come modello animale è la loro facile manutenzione e il rapido sviluppo, nonché la facilità di ottenere MSC dal tessuto adiposo. Diverse fonti tissutali sono state descritte per ottenere ASC, come il grasso viscerale, perirenale, epididimico e sottocutaneo 12,13,14,15,16.^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025