בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.

Abstract

תאים מזנכימליים בוגרים חוללו מהפכה בביולוגיה המולקולרית ובביולוגיה התאית בעשורים האחרונים. הם יכולים להתמיין לסוגי תאים מיוחדים שונים, בנוסף ליכולתם הגדולה להתחדשות עצמית, הגירה והתפשטות. רקמת השומן היא אחד המקורות הפחות פולשניים והנגישים ביותר של תאים מזנכימליים. כמו כן, דווח כי יש לו תשואות גבוהות יותר בהשוואה למקורות אחרים, כמו גם תכונות אימונומודולטוריות מעולות. לאחרונה פורסמו נהלים שונים להשגת תאים מזנכימליים בוגרים ממקורות רקמה שונים וממיני בעלי חיים. לאחר הערכת הקריטריונים של מחברים מסוימים, תיקננו מתודולוגיה ישימה למטרות שונות וניתנת לשחזור בקלות. מאגר של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן פרירנלית ואפידידימלית איפשר לנו לפתח תרביות ראשוניות עם מורפולוגיה ופונקציונליות אופטימליות. התאים נצפו דבוקים למשטח הפלסטיק במשך 24 שעות, והציגו מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, עם הארכות ונטייה ליצור מושבות. טכניקות ציטומטריית זרימה (FC) ואימונופלואורסנציה (IF) שימשו להערכת הביטוי של סמני הממברנה CD105, CD9, CD63, CD31 ו- CD34. יכולתם של תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) להתמיין לשושלת האדיפוגנית הוערכה גם באמצעות קוקטייל של גורמים (4 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר 3-מתיל-איזו-בוטיל-קסנטין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון). לאחר 48 שעות, אובדן הדרגתי של מורפולוגיה פיברובלסטואיד נצפתה, ובגיל 12 ימים, נוכחות של טיפות שומנים חיובי שמן כתמים אדום אושר. לסיכום, מוצע הליך להשגת תרביות ASC אופטימליות ותפקודיות ליישום ברפואה רגנרטיבית.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) השפיעו מאוד על הרפואה הרגנרטיבית בשל יכולתם הגבוהה להתחדשות עצמית, התפשטות, הגירה והתמיינות לשושלות תאים שונות ^1,2. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בפוטנציאל שלהם לטיפול ואבחון של מחלות שונות.

ישנם מקורות שונים של תאים מזנכימליים: מח עצם, שרירי שלד, מי שפיר, זקיקי שיער, שליה ורקמת שומן, בין היתר. הם מתקבלים ממינים שונים, כולל בני אדם, עכברים, חולדות, כלבים וסוסים³. MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) שימשו במשך שנים רבות כמקור עיקרי לתאי גזע ברפואה רגנרטיבית וכחלופה לשימוש בתאי גזע עובריים⁴. עם זאת, MSCs נגזר שומן, או תאי גזע נגזר שומן (ASC), הם חלופה חשובה עם יתרונות גדולים בשל קלות האיסוף והבידוד שלהם, כמו גם את התשואה של תאים המתקבלים לכל גרם של רקמת שומן ^5,6. דווח כי קצב הקציר של ASCs הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של BMSCs⁷. בתחילה הוצע כי יכולת התיקון/התחדשות של ASCs נובעת מיכולתם להתמיין לשושלות תאים אחרות⁸. עם זאת, מחקרים בשנים האחרונות חיזקו את התפקיד העיקרי של גורמים פרקריניים ששוחררו על ידי ASCs בפוטנציאל התיקון שלהם ^9,10.

רקמת השומן (AT), בנוסף להיותה עתודת אנרגיה, מקיימת אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית, העצבים והלב וכלי הדם. הוא מעורב גם בצמיחה והתפתחות לאחר הלידה, תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות, תיקון רקמות, והתחדשות. ה- AT מורכב מאדיפוציטים, תאי שריר חלק של כלי הדם, תאי אנדותל, פיברובלסטים, מונוציטים, מקרופאגים, לימפוציטים, פרדיפויטים ו- ASC. אלה האחרונים בעלי תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בשל האימונוגניות הנמוכה שלהם^11,12. ASCs ניתן להשיג על ידי עיכול אנזימטי ועיבוד מכני או על ידי חצילים רקמת שומן. תרבויות ראשוניות של ASCs קלות לתחזוקה, צמיחה והרחבה. אפיון פנוטיפי של ASCs חיוני כדי לאמת את זהות התאים על ידי הערכת הביטוי של סמנים ספציפיים בממברנה באמצעות שיטות כגון immunofluorescence ו cytometry זרימה¹³. הפדרציה הבינלאומית לטיפולי שומן ומדע (IFATS) והאגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT) הגדירו כי ASCs מבטאים CD73, CD90 ו- CD105, בעוד שחסרים את הביטוי של CD11b, CD14, CD19, CD45 ו- HLA-DR¹⁴. סמנים אלה, הן חיוביים והן שליליים, נחשבים לפיכך אמינים לאפיון ASC.

פרויקט זה התמקד בתיאור הליך לבידוד וזיהוי של תאים מזנכימליים בוגרים שהופקו מתאי AT, שכן מקור תאים זה אינו מציב אתגרים אתיים, בניגוד לתאי גזע עובריים. זה ממצק את ההליך כאפשרות מעשית בגלל קלות הגישה והשיטה הזעיר פולשנית בהשוואה לתאי גזע שמקורם במח עצם.

לתאים מזנכימליים ממקור רקמה זה יש תפקיד חשוב ברפואה רגנרטיבית בגלל יכולותיהם האימונומודולטוריות ודחייה חיסונית נמוכה. לכן, המחקר הנוכחי הוא חלק מהותי במחקר עתידי על הפרשתם ויישומם כטיפול רגנרטיבי במחלות שונות, כולל מחלות מטבוליות כגון סוכרת.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המקסיקניות לטיפול בבעלי חיים, בהתבסס על המלצות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, מקסיקו). הפרוטוקול נבדק, אושר ונרשם על ידי ועדת האתיקה לחקר הבריאות של המכון המקסיקני דל סגורו חברתי (R-2021-785-092).

1. הסרת רקמת שומן מחולדות על ידי כריתה כירורגית

1. הכינו שני צינורות חרוטיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח אנטי-מיקרוטית סטרילית 1x פוספט חוצץ (PBS-AA) (1x PBS, גנטמיצין [20 מיקרוגרם/מ"ל], ואמפוטריצין [0.5 מיקרוגרם/מ"ל]) ושמרו על קרח.
2. בחר שני זכרים בוגרים של חולדות Sprague Dawley (R. norvegicus) במצב בריאותי טוב. ודאו שהחולדות בנות 3-4 חודשים ומשקלן הקופורלי הוא 350-450 גרם.
3. המשך להרגעה עם 20 מ"ג / ק"ג קסילזין הידרוכלוריד, וכעבור 5 דקות, מתן הרדמה עם מינון של 120 מ"ג / ק"ג קטמין הידרוכלוריד תוך צפקי. יש לשמן את שתי העיניים במשחה אופתלמית למניעת התייבשות. לאחר מכן, יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה.
4. לגלח ולחטא את אזור הבטן והמפשעה עם תמיסת יוד. החל וילונות כירורגיים כדי לשמור על סטריליות. לאחר מכן, בצע חתך אורכי חציוני מעצם החזה לאזור האשכים.
5. הסר את רקמת השומן המקיפה הן את האפידידימיס והן את הכליות באמצעות מלקחיים סטריליים ומקם בתמיסת PBS-AA 1x. שמור את הדגימות על קרח.
6. יש לתפור את החתך סגור במידת הצורך בהתאם להנחיות המוסדיות ולהרדים את בעלי החיים במינון תוך לבבי של 40 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל. לאחר אישור המוות, יש להשליך את הפגר בהתאם להליכים מוסדיים.
   הערה: המוות מעורר מנגנוני איתות המשפיעים על אימונופנוטיפ, יכולת התמיינות והשפעה פרקרינית של תאים מזנכימליים. לפיכך, איסוף רקמות מבוצע לפני המתת חסד. 

2. בידוד תאים מזנכימליים מרקמת השומן

1. הסר את רקמת השומן עם מלקחיים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית והנח אותה על נייר סינון סטרילי בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ כדי לספוג PBS עודף.
2. מעבירים את רקמת השומן לצלחת פטרי אחרת ומבצעים שלוש שטיפות במשך 5 דקות כל אחת עם 10 מ"ל של תמיסת PBS-AA אחת באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
3. מכנית לפרק את הרקמה לשברים של כ 1 ס"מ² באמצעות מספריים ואזמל.
4. הכינו collagenase סוג IV (0.075%) ב 20 מ"ל של מדיום הנשר של Dulbecco ללא תוספת (DMEM). יש לסנן דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר ולשמור על טמפרטורה של 37°C.
5. הוסף את תמיסת הקולגנאז (20 מ"ל) שהוכנה בשלב 2.4 לתוך קריסטל עם הרקמה המקוטעת ופס מגנטי. יש לאטום את המיכל ולדגור תחת תסיסה איטית ומתמשכת בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: העיכול האנזימטי אורך כ-90 דקות (יש לשמור על ערבוב איטי כדי לשמור על שלמות קרומי התא).
6. סנן את ההומוגנט דרך נירוסטה, 40 רשת, מסנן צמצם 0.38 מ"מ על צלחת פטרי 100 מ"מ ולאסוף את מתלה התא בצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.
7. הוסף 20 מ"ל של DMEM מחומם בתוספת (10% סרום בקר עוברי [FBS], 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ נתרן פירובט, 100x תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, ותמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית 100x [AA]). בזהירות להשעות את מקטע כלי הדם סטרומה (SVE).
8. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 290 x גרם במשך 10 דקות, להשליך את supernatant עם פיפטה 25 מ"ל, ולשטוף בעדינות את התאים עם 40 מ"ל של מדיום DMEM ללא תוספת.
9. חזור על שלב זה. השתמש בצינור חרוטי סטרילי חדש בין השלבים כדי לגרור את הכמות הקטנה ביותר של פסולת תאית ושומן.
10. להשעות את הגלולה ב 5 מ"ל של DMEM בתוספת עם פיפטה 5 מ"ל ולהעביר T-25 ס"מ² בקבוק. יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
11. למחרת, בצע שלוש שטיפות עם 5 מ"ל של PBS-AA מחומם 1x ושתי שטיפות עם DMEM ללא תוספת כדי להסיר פסולת תאים ותאים שאינם דבקים. הוסף 5 מ"ל של DMEM טרי, מחומם, בתוספת פיפטה 5 מ"ל ולשנות את המדיום כל 3-4 ימים.

3. שימור והרחבה של התרבויות הראשוניות של ASC

1. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 90%-100% (8 ± יומיים), יש לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל DMEM ללא תוסף. הוסף 1 מ"ל של 0.025% מחומם טריפסין-2 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ודגור במשך 5-7 דקות ב 37 ° C.
2. כאשר monolayer התא מנותק, להוסיף 4 מ"ל של DMEM בתוספת בעדינות לפרק את השעיית התא.
3. מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של DMEM מחומם, בתוספת ומשהה בעדינות להומוגניזה.
4. צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולערבב בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל של תוסף DMEM. ספרו את התאים בתא נויבאואר לאחר צביעה בכחול טריפאן.
5. לבסוף, זרע 2.5 x 10³ תאים/ס"מ² ביחס פיצול של 1:4 בצלוחיות T-75. צעד זה מבטיח היווצרות מושבות וקצב ריבוי גבוה.

4. אפיון מורפולוגיה של תרבויות ראשוניות ASC

1. שימו לב למורפולוגיה של ASCs תחת מיקרוסקופ הפוך.
   הערה: לפני ההרכבה לצורך זיהוי היסטולוגיה ואוטיזם, יש לטפל בכיסויים בתמיסת ג'לטין 1%. הקרינו עם UV במשך 15 דקות.
   1. הסירו את הכיסויים מתמיסת אתנול 70% והניחו להם להתייבש במשך 5 דקות.
   2. יש לטבול את החלקות בתמיסת ג'לטין סטרילית 1%, לנקז ולייבש בטמפרטורת החדר (RT).
   3. הכניסו כל מכסה לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות והקרינו את הצלחות באור UV למשך 15 דקות.
   4. זרעו טיפה המכילה 25X10³ תאים במרכז הבאר, המתינו דקה והוסיפו 1 מ"ל של מדיום DMEM מוסף. יש לדגור במשך 96 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   5. מוציאים את המדיום ומבצעים שלוש שטיפות עם 1x PBS-AA באמצעות פיפטת העברה.
   6. הוסף 1 מ"ל של פורמלין נייטרלי 3.5% לכל באר ודגר במשך שעה אחת ב- RT. בזהירות להסיר את הפורמלין ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול קר 70% לכל באר.
   7. אטמו את הצלחת בפרפילם עד לשימוש, כדי למנוע התייבשות.
      הערה: המורפולוגיה התאית של ASCs מוערכת גם על ידי צביעת hematoxylin-eosin במהלך מעברים שונים.
   8. הסר את 70% אתנול מכל באר ולחות את התאים במשך 5 דקות עם מים מזוקקים. בינתיים, סננו את פתרונות הצביעה.
   9. מוציאים את המים ומכתימים את התאים בתסיסה איטית למשך 15 דקות עם תמיסת המטוקסילין של האריס.
   10. הסירו את תמיסת הכתמים ובצעו שתי שטיפות עם PBS אחד.
   11. מכתימים את התאים בתמיסת אאוזין תחת תסיסה איטית למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את התמיסה ובצע שתי שטיפות עם PBS 1x.
   12. הסר בזהירות את הכיסויים מכל באר והרכיב את המגלשות על טיפה של תמיסת הרכבה PBS-גליצרול (1:1 v/v).
   13. הניחו קו של לכה סביב הכיסוי והתבוננו בשקופיות ההיסטולוגיות מתחת למיקרוסקופ האור.

5. סמני ביטוי של ASCs על ידי immunofluorescence

1. הכינו את מאגר הכביסה המכיל 1x PBS-0.05% Tween 20. בצעו את השטיפות ב-RT ובטלטול איטי. לשטוף את הצלחות שלוש פעמים עם 2 מ"ל של חיץ / באר (לדגור במשך 3 דקות עבור כל כביסה).
2. מניחים 1 מ"ל של מגיב חוסם (1:10) ודגורים עם תסיסה איטית במשך 20 דקות.
3. הוסף 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים העיקריים הבאים לכל באר: CD9 (עכבר חד שבטי), CD34 (ארנב רב-שבטי) ואנטי-CD63 (עז רב-שבטית). לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
4. שטפו את הצלחות שלוש פעמים שוב ודגרו עם 200 μL (דילול 1:50) של הנוגדנים המשניים הבאים: עז מצומדת נגד עכבר IgG FITC, חמור נגד עז IgG DyeLight 550, ועז נגד ארנב IgG Cy3.
5. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS-0.05% Tween 20 ולהכתים את גרעיני התא ב-100 μL של DRAQ-7 (דילול: 17 μL ב-1 מ"ל מים מזוקקים כפול) למשך 20 דקות.
6. שטפו שלוש פעמים נוספות והרכיבו את המגלשות לפי שלבים 4.1.12-4.1.13. יש לאחסן את הדגימות מוגנות מפני אור ומוקפאות עד לשימוש.
7. דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפיפלואורסצנטי באמצעות ההגדרות והתוכנה המתאימות המומלצות לציוד זה.

6. סמני ביטוי של ASCs לפי ציטומטריית זרימה

1. התאם תרחיף תא בודד מתאים שעברו טריפסינזציה או הפשרה (תת-מעברים 3 או 4) בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל של 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL עם 100,000 תאים בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. השתמש ב- aliquot אחד ללא תיוג עבור בקרת הפלואורסצנטיות האוטומטית.
2. הוסף למנוחה את כל הכמויות המתאימות של Anti-CD105 AF-594 ו- Anti-CD31 AF-680, בהתאם להוראות היצרן. לדגור בחושך במשך 20 דקות ב 4 ° C.
3. יש לשטוף את הכתם העודף עם 1 מ"ל של 1x PBS-5% FBS על ידי צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ולהשהות ב 300 μL של 1% פורמלין.
4. בצע רכישת דגימה על ציטומטר זרימה. אסטרטגיית ה-gating של התאים מבוססת על גידור FSC-A לעומת SSC-A, תאים בודדים מגודרים באמצעות SSC-H לעומת SSC-A ואחריו FSC-A לעומת FSC-H.
5. השתמש בגלאי Y610-mCherry-A עבור CD105 AF-594 וגלאי R660-APC-A עבור CD31 AF-680.

7. בידול ASCs לשושלת האדיפוגנית

1. בצלחת 6 בארות, זרע 1 x 10 4 תאים (^P-4) לכל ס"מ 2 ודגור ב 37 ° C, 5% CO², עד 60-80% מפגש (~ 72-96 שעות). השראת התמיינות ישירות על מדיום התרבית: 4 מיקרומטר אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון 21-אצטט (Dxa), ו-0.5 מילימטר של 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (MIX). שנה את מדיום הבידול כל 2-3 ימים.
2. הכינו תמיסת מלאי של 800 מיקרומטר אינסולין ב-2 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים (הוסיפו 20 מיקרוליטר של 1 N HCl כדי להבטיח פירוק מלא) ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הוסף 10 μL של מלאי אינסולין, בעבר מדולל 1:100, ולהחיל 10 μL בנפח הסופי של 2 מ"ל לכל באר.
3. הכינו תמיסת מלאי של 1 mM Dxa ב 5 מ"ל של מים סטריליים טהורים במיוחד (שים לב כי המסה מלאה אינה מתרחשת). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הוסף 40 μL/well של דילול 1:4 של מלאי Dxa.
4. הכינו מלאי של 100 מילימטר של MIX ב-2.5 מ"ל של 0.1 N NaOH, מערבולת, והוסיפו 40 מיקרוליטר של 1 N NaOH לפירוק מלא. יש לאחסן בטמפרטורה של -70°C. הוסף 10 μL / באר של מלאי MIX.
5. סנן את תמיסות המלאי דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל 0.22 מיקרומטר לפני האחסון.
6. ביום ה-12, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS 1x ולדגור עם 500 μL של 4% פורמלין במשך שעה אחת ב-RT. לשטוף כל באר פעמיים עם מים מזוקקים ולאחר מכן, על ידי 60% איזופרופנול במשך 5 דקות ולתת להתייבש.
7. הוסיפו 0.5% שמן אדום O מדולל ב-60% איזופרופנול (500 מיקרוליטר/באר) ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. שטפו עם 1 מ"ל מים מזוקקים שלוש פעמים והתבוננו תחת מיקרוסקופ הפוך.
   הערה: לקבלת ריאגנטים, ציוד וחומרים נדרשים, עיין בטבלת החומרים.

תוצאות

רקמת השומן התקבלה מחולדות בוגרות של Sprague Dawley בגילאי 3-4 חודשים ומשקל גוף של 401 ± 41 גרם (ממוצע גיאומטרי ± SD). ערך ממוצע של 3.8 גרם של רקמת שומן אפידידימלית ופרירנלית התאים לניתוח של 15 מיצויים ניסיוניים. לאחר 24 שעות של תרבית, אוכלוסיות התאים נותרו דבוקות למשטח הפלסטיק והציגו מורפולוגיה הטרוגנית. ה...

Discussion

בארבעת העשורים האחרונים מאז גילוי MSCs, כמה קבוצות של חוקרים תיארו הליכים להשגת MSCs מרקמות ומינים שונים. אחד היתרונות של שימוש בחולדות כמודל של בעלי חיים הוא התחזוקה הקלה וההתפתחות המהירה שלהן, כמו גם הקלות של קבלת MSCs מרקמת השומן. מקורות רקמה שונים תוארו לקבלת ASCs, כגון ויסצרלי, פריrenal, epididymal, ו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025