Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Zusammenfassung

Adulte mesenchymale Zellen haben in den letzten Jahrzehnten die Molekular- und Zellbiologie revolutioniert. Sie können sich in verschiedene spezialisierte Zelltypen differenzieren, zusätzlich zu ihrer großen Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Migration und Proliferation. Fettgewebe ist eine der am wenigsten invasiven und am leichtesten zugänglichen Quellen für mesenchymale Zellen. Es wurde auch berichtet, dass es im Vergleich zu anderen Quellen höhere Erträge sowie überlegene immunmodulatorische Eigenschaften aufweist. In jüngster Zeit wurden verschiedene Verfahren zur Gewinnung adulter mesenchymaler Zellen aus verschiedenen Gewebequellen und Tierarten veröffentlicht. Nachdem wir die Kriterien einiger Autoren ausgewertet hatten, haben wir eine Methodik standardisiert, die für verschiedene Zwecke anwendbar und leicht reproduzierbar ist. Ein Pool von stromaler vaskulärer Fraktion (SVF) aus perirenalem und epididymalem Fettgewebe ermöglichte es uns, Primärkulturen mit optimaler Morphologie und Funktionalität zu entwickeln. Es wurde beobachtet, dass die Zellen 24 h lang an der plastischen Oberfläche hafteten und eine fibroblastenähnliche Morphologie mit Verlängerungen und einer Tendenz zur Bildung von Kolonien aufwiesen. Mittels Durchflusszytometrie (FC) und Immunfluoreszenz (IF) wurde die Expression der Membranmarker CD105, CD9, CD63, CD31 und CD34 untersucht. Die Fähigkeit von Fettstammzellen (ASCs), sich in die adipogene Linie zu differenzieren, wurde ebenfalls anhand eines Cocktails von Faktoren (4 μM Insulin, 0,5 mM 3-Methyl-iso-butyl-xanthin und 1 μM Dexamethason) bewertet. Nach 48 Stunden wurde ein allmählicher Verlust der Fibroblastoid-Morphologie beobachtet, und nach 12 Tagen wurde das Vorhandensein von Lipidtröpfchen bestätigt, die positiv für eine ölrote Färbung waren. Zusammenfassend wird ein Verfahren vorgeschlagen, um optimale und funktionelle ASC-Kulturen für die Anwendung in der regenerativen Medizin zu erhalten.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben die regenerative Medizin aufgrund ihrer hohen Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Proliferation, Migration und Differenzierung in verschiedene Zelllinien stark beeinflusst ^1,2. Derzeit konzentriert sich ein großer Teil der Forschung auf ihr Potenzial für die Behandlung und Diagnose verschiedener Krankheiten.

Es gibt verschiedene Quellen für mesenchymale Zellen: Knochenmark, Skelettmuskulatur, Fruchtwasser, Haarfollikel, Plazenta und Fettgewebe, um nur einige zu nennen. Sie werden von verschiedenen Spezies gewonnen, darunter Menschen, Mäuse, Ratten, ....

Protokoll

Alle Versuchsverfahren wurden nach den mexikanischen Richtlinien für die Tierhaltung durchgeführt, basierend auf den Empfehlungen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexiko). Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Gesundheitsforschung des Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) geprüft, genehmigt und registriert.

1. Entfernung von Fettgewebe bei Ratten durch chirurgische Resektion

1. Bereiten Sie zwei konische Röhrchen mit 20 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösungs-Antibiotika-Antimykotikum....

Diskussion

In den letzten vier Jahrzehnten seit der Entdeckung von MSCs haben mehrere Forschergruppen Verfahren zur Gewinnung von MSCs aus verschiedenen Geweben und Spezies beschrieben. Einer der Vorteile der Verwendung von Ratten als Tiermodell ist ihre einfache Pflege und schnelle Entwicklung sowie die einfache Gewinnung von MSCs aus Fettgewebe. Für die Gewinnung von ASCs wurden verschiedene Gewebequellen beschrieben, wie z. B. viszerales, perirenales, Nebenhoden- und subkutanes Fett 12,13,14,15,16.^<.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025