Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Resumo

As células mesenquimais adultas revolucionaram a biologia molecular e celular nas últimas décadas. Podem diferenciar-se em diferentes tipos celulares especializados, além de sua grande capacidade de auto-renovação, migração e proliferação. O tecido adiposo é uma das fontes menos invasivas e mais acessíveis de células mesenquimais. Também tem sido relatado para ter rendimentos mais elevados em comparação com outras fontes, bem como propriedades imunomoduladoras superiores. Recentemente, diferentes procedimentos para obtenção de células mesenquimais adultas de diferentes fontes teciduais e espécies animais têm sido publicados. Após avaliação dos critérios de alguns autores, padronizamos uma metodologia aplicável a diferentes propósitos e facilmente reprodutível. Um pool de fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo perirrenal e epididimal nos permitiu desenvolver culturas primárias com morfologia e funcionalidade ideais. As células foram observadas aderidas à superfície plástica por 24 h e exibiram morfologia semelhante a fibroblastos, com prolongamentos e tendência a formar colônias. As técnicas de citometria de fluxo (CF) e imunofluorescência (IF) foram utilizadas para avaliar a expressão dos marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. A capacidade das células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs) de se diferenciar na linhagem adipogênica também foi avaliada usando um coquetel de fatores (4 μM de insulina, 0,5 mM de 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM de dexametasona). Após 48 h, observou-se perda gradual da morfologia fibroblastóide e, aos 12 dias, confirmou-se a presença de gotículas lipídicas positivas para coloração vermelho oleoso. Em resumo, propõe-se um procedimento para obtenção de culturas de ASC ótimas e funcionais para aplicação em medicina regenerativa.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm forte impacto na medicina regenerativa devido à sua alta capacidade de auto-renovação, proliferação, migração e diferenciação em diferentes linhagens celulares ^1,2. Atualmente, uma grande quantidade de pesquisas está se concentrando em seu potencial para o tratamento e diagnóstico de várias doenças.

Existem diferentes fontes de células mesenquimais: medula óssea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta, tecido adiposo, entre outros. São obtidos de diferentes espécies, incluindo humanos, camundongos, ratos, cães e cavalos³. As CTMs derivadas da medula óssea (CTMs) têm sido utilizadas há muitos anos como uma importante fonte de células-tronco na medicina regenerativa e como uma alternativa ao uso de células-tronco embrionárias⁴. Entretanto, as CTMs derivadas do tecido adiposo, ou células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs), são uma alternativa importante com grandes vantagens devido à facilidade de coleta e isolamento, bem como ao rendimento de células obtidas por grama de tecido adiposo ^5,6. Tem sido relatado que a taxa de colheita de CTAs é geralmente maior do que a de^{CTMs 7}. Foi inicialmente proposto que a capacidade reparadora/regenerativa das CTAs era devida à sua capacidade de se diferenciar em outras linhagens celulares⁸. No entanto, pesquisas nos últimos anos têm reforçado o papel primário dos fatores parácrinos liberados pelas CTAs em seu potencial^{reparador9,10}.

O tecido adiposo (TA), além de ser uma reserva energética, interage com os sistemas endócrino, nervoso e cardiovascular. Também está envolvida no crescimento e desenvolvimento pós-natal, na manutenção da homeostase tecidual, reparo tecidual e regeneração. O TA é composto por adipócitos, células musculares lisas vasculares, células endoteliais, fibroblastos, monócitos, macrófagos, linfócitos, pré-adipócitos e ASCs. Estes últimos possuem importante papel na medicina regenerativa devido à sua baixa imunogenicidade^11,12. As CTAs podem ser obtidas por digestão enzimática e processamento mecânico ou por explantes de tecido adiposo. As culturas primárias de ASCs são fáceis de manter, cultivar e expandir. A caracterização fenotípica das CTAs é essencial para verificar a identidade das células, avaliando a expressão de marcadores específicos de membrana por meio de métodos como imunofluorescência e citometria de^fluxo13. A International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e a International Society for Cellular Therapy (ISCT) definiram que as CTAs expressam CD73, CD90 e CD105, enquanto não expressam CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR¹⁴. Esses marcadores, tanto positivos quanto negativos, são, portanto, considerados confiáveis para a caracterização das CTAs.

Este projeto teve como foco descrever um procedimento para o isolamento e identificação de células mesenquimais adultas extraídas da TA de ratos, uma vez que esta fonte de células não apresenta desafios éticos, ao contrário das células-tronco embrionárias. Isso solidifica o procedimento como uma opção viável devido à facilidade de acesso e método minimamente invasivo em comparação com células-tronco derivadas da medula óssea.

As células mesenquimais dessa fonte de tecido têm um papel importante na medicina regenerativa devido à sua capacidade imunomoduladora e baixa rejeição imunológica. Portanto, o presente estudo é parte fundamental de futuras pesquisas sobre seu secretoma e sua aplicação como terapia regenerativa em diferentes doenças, incluindo doenças metabólicas como o diabetes.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo as Diretrizes Mexicanas para Cuidados com Animais, baseadas nas recomendações da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). O protocolo foi revisado, aprovado e registrado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Saúde do Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Remoção de tecido adiposo de ratos por ressecção cirúrgica

1. Preparar dois tubos cônicos com 20 mL de solução antimicótica salina-antimicótica tamponada com fosfato 1x (PBS-AA) estéril (1x PBS, gentamicina [20 μg/mL] e anfotericina [0,5 μg/mL]) e manter no gelo.
2. Selecionar dois ratos Sprague Dawley machos adultos (R. norvegicus) em boas condições de saúde. Certifique-se de que os ratos têm entre 3-4 meses de idade e têm um peso coporal de 350-450 g.
3. Proceder à sedação com 20 mg/kg de cloridrato de xilazina e, 5 minutos após, administrar um anestésico com uma dose de 120 mg/kg de cloridrato de quetamina por via intraperitoneal. Lubrifique ambos os olhos com uma pomada oftálmica para evitar o ressecamento. Em seguida, confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal.
4. Raspar e desinfetar a região abdominal e inguinal com uma solução de iodo. Aplicar campos cirúrgicos para manter a esterilidade. Em seguida, faça uma incisão longitudinal mediana do esterno até a região testicular.
5. Remova o tecido adiposo ao redor do epidídimo e dos rins com pinça estéril e coloque na solução de 1x PBS-AA. Mantenha as amostras no gelo.
6. Sutura da incisão fechada se necessário de acordo com as diretrizes institucionais e eutanásia dos animais com dose intracardíaca de 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Uma vez confirmado o óbito, descarte a carcaça seguindo procedimento(s) institucional(is).
   NOTA: A morte provoca mecanismos de sinalização que afetam o imunofenótipo, a capacidade de diferenciação e o efeito parácrino das células mesenquimais. Assim, a coleta de tecidos é realizada antes da eutanásia. 

2. Isolamento de células mesenquimais do tecido adiposo

1. Remova o tecido adiposo com pinça estéril dentro de um armário de biossegurança e coloque-o sobre papel de filtro estéril em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro para absorver o excesso de PBS.
2. Transferir o tecido adiposo para outra placa de Petri e realizar três lavagens por 5 min cada com 10 mL de solução 1x PBS-AA usando uma pipeta de 10 mL.
3. Desagregar mecanicamente o tecido em fragmentos de aproximadamente 1^cm2 com tesoura e bisturi.
4. Preparar colagenase tipo IV (0,075%) em 20 mL de meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco não suplementado. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 μm e manter a 37 °C.
5. Adicionar a solução de colagenase (20 ml) preparada no passo 2.4 num copo de cristal com o tecido fragmentado e uma barra magnética. Selar o recipiente e incubar sob agitação lenta e contínua a 37 °C.
   NOTA: A digestão enzimática leva aproximadamente 90 min (manter a agitação lenta para preservar a integridade das membranas celulares).
6. Filtrar o homogeneizado através de um filtro de aço inoxidável, tela de 40 mm, abertura de 0,38 mm em uma placa de Petri de 100 mm e coletar a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 50 mL.
7. Adicionar 20 mL de DMEM aquecido e suplementado (10% de soro fetal bovino [SFB], 2 mM de glutamina, 2 mM de piruvato de sódio, 100x solução de aminoácidos não essenciais e 100x de solução antimicótica antimicótica [AA]). Suspender cuidadosamente a fração vascular estromal (VED).
8. Centrifugar a suspensão celular a 290 x g por 10 min, descartar o sobrenadante com pipeta de 25 mL e lavar suavemente as células com 40 mL de meio DMEM não suplementado.
9. Repita esta etapa. Use um novo tubo cônico estéril entre os passos para arrastar a menor quantidade de detritos celulares e gordura.
10. Suspender o pellet em 5 mL de DMEM suplementado com pipeta de 5 mL e transferir para um frasco T-25 cm² . Incubar durante 24 h a 37 °C e 5% CO₂.
11. No dia seguinte, realizar três lavagens com 5 mL de PBS-AA aquecido 1x e duas lavagens com DMEM não suplementado para remoção de restos celulares e células não aderentes. Adicione 5 mL de DMEM fresco, aquecido e suplementado com uma pipeta de 5 mL e troque o meio a cada 3-4 dias.

3. Manutenção e expansão das culturas primárias da ASC

1. Quando as células atingirem 90%-100% de confluência (8 ± 2 dias), lavar duas vezes com 5 mL de DMEM não suplementado. Adicionar 1 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,025% aquecido a 0,025% mM e incubar por 5-7 min a 37 °C.
2. Quando a monocamada celular estiver destacada, adicionar 4 mL de DMEM suplementado e desagregar suavemente a suspensão celular.
3. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, adicione 5 mL de DMEM aquecido e suplementado e suspenda suavemente para homogeneizar.
4. Centrifugar a 290 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e misture suavemente o pellet em 1 mL de DMEM suplementado. Contar as células numa câmara de Neubauer após coloração com azul de Trypan.
5. Por fim, semea-se 2,5 x 10³ células/^cm2 na proporção de 1:4 em frascos T-75. Essa etapa garante a formação de colônias e uma alta taxa de proliferação.

4. Caracterização morfológica de culturas primárias de ASC

1. Observar a morfologia das CTAs sob microscopia invertida.
   NOTA: Antes da montagem para identificação histológica e ASC, trate as lamínulas com uma solução de gelatina a 1%. Irradiar com UV por 15 min.
   1. Retire as lamínulas da solução de etanol a 70% e deixe-as secar por 5 min.
   2. Mergulhe as lamínulas em uma solução estéril de gelatina a 1%, escorra e seque à temperatura ambiente (TR).
   3. Coloque cada tampa em cada poço de uma placa de 6 poços e irradie as placas com luz UV por 15 min.
   4. Semeando uma gota contendo 25 x 10³ células no centro do poço, aguardar 1 min e adicionar 1 mL de meio DMEM suplementado. Incubar durante 96 h a 37 °C e 5% CO₂.
   5. Retire o meio e realize três lavagens com 1x PBS-AA usando uma pipeta de transferência.
   6. Adicione 1 mL de formalina neutra a 3,5% em cada poço e incube por 1 h no TR. Retire cuidadosamente a formalina e adicione 1 mL de etanol 70% frio a cada poço.
   7. Sele a placa com parafilme até o uso, para evitar o ressecamento.
      NOTA: A morfologia celular das ASCs também é avaliada pela coloração de hematoxilina-eosina durante diferentes passagens.
   8. Retire o etanol 70% de cada poço e hidrate as células por 5 min com água destilada. Enquanto isso, filtre as soluções de coloração.
   9. Remover a água e manchar as células sob agitação lenta por 15 min com solução de hematoxilina de Harris.
   10. Retire a solução corante e realize duas lavagens com 1x PBS.
   11. Manchar as células com solução de eosina sob agitação lenta por 1 min. Em seguida, retire a solução e realize duas lavagens com 1x PBS.
   12. Remova cuidadosamente as lamínulas de cada poço e monte as lâminas em uma gota de solução de montagem PBS-glicerol (1:1 v/v).
   13. Coloque uma linha de verniz de unha ao redor da lamínula e observe as lâminas histológicas sob o microscópio de luz.

5. Marcadores de expressão de ASCs por imunofluorescência

1. Prepare o tampão de lavagem contendo 1x PBS-0,05% Tween 20. Realizar as lavagens em RT e com agitação lenta. Lavar as placas três vezes com 2 mL de tampão/poço (incubar por 3 min para cada lavagem).
2. Colocar 1 mL de reagente bloqueador (1:10) e incubar com agitação lenta por 20 min.
3. Adicionar 200 μL (diluição 1:50) dos seguintes anticorpos primários a cada poço: CD9 (camundongo monoclonal), CD34 (coelho policlonal) e anti-CD63 (cabra policlonal). Incubar durante a noite a 4 °C.
4. Lavar novamente as placas três vezes e incubar com 200 μL (diluição 1:50) dos seguintes anticorpos secundários: cabra conjugada IgG FITC anti rato, IgG IgG DyeLight 550 anticabra e IgG Cy3 anti-coelho de cabra.
5. Lavar três vezes com 1x PBS-0,05% Tween 20 e contra-corar os núcleos celulares com 100 μL de DRAQ-7 (diluição: 17 μL em 1 mL de água bidestilada) por 20 min.
6. Lave mais três vezes e monte as lâminas de acordo com os passos 4.1.12-4.1.13. Conservar as amostras protegidas da luz e congeladas até à utilização.
7. Visualize as amostras sob microscopia confocal de epifluorescência utilizando as configurações e softwares adequados recomendados para este equipamento.

6. Marcadores de expressão de CTAs por citometria de fluxo

1. Ajustar uma suspensão de célula única de células tripsinizadas ou descongeladas (subpassagens 3 ou 4) a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL de 1x PBS-5% FBS. Alíquota 100 μL com 100.000 células em tubos centrífugos de 1,5 mL. Use uma alíquota sem etiquetagem para o controle de autofluorescência.
2. Adicione ao repouso todas as quantidades adequadas de Anti-CD105 AF-594 e Anti-CD31 AF-680, de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no escuro durante 20 minutos a 4 °C.
3. Lavar o excesso de coloração com 1 mL de 1x PBS-5% FBS por centrifugação a 250 x g por 5 min e suspender em 300 μL de formalina a 1%.
4. Realizar a aquisição da amostra em citômetro de fluxo. A estratégia de gating das células é baseada em FSC-A vs. SSC-A gating, células únicas fechadas usando SSC-H vs. SSC-A seguido por FSC-A vs. FSC-H.
5. Use o detector Y610-mCherry-A para CD105 AF-594 e o detector R660-APC-A para CD31 AF-680.

7. Diferenciação das CTAs para a linhagem adipogênica

1. Em uma placa de 6 poços, semeie 1 x 10 4 células (^P-4) por cm 2 e incube a 37 °C, 5% CO₂, até 60-80% de confluência (~72-96 h). Induzir diferenciação, aplicando diretamente ao meio de cultura: 4 μM de insulina, 1 μM de 21-acetato de dexametasona (Dxa) e 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Troque o meio de diferenciação a cada 2-3 dias.
2. Preparar uma solução-mãe de 800 μM de insulina em 2 ml de água ultrapura estéril (adicionar 20 μL de HCl 1 N para garantir a dissolução completa) e conservar a -20 °C. Adicionar 10 μL de estoque de insulina, previamente diluído 1:100, e aplicar 10 μL em um volume final de 2 mL por poço.
3. Preparar uma solução-mãe de 1 mM Dxa em 5 ml de água ultrapura estéril (note que não ocorre dissolução total). Conservar a 4 °C. Adicionar 40 μL/poço de uma diluição 1:4 do caldo de Dxa.
4. Preparar um estoque de 100 mM de MIX em 2,5 mL de NaOH 0,1 N, vórtice, e adicionar 40 μL de NaOH 1 N para dissolução completa. Conservar a -70 °C. Adicionar 10 μL/poço de caldo MIX.
5. Filtrar as soluções-mãe através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm antes do armazenamento.
6. No dia 12, lavar as células três vezes com 1x PBS e incubar com 500 μL de formalina a 4% por 1 h em RT. Lave cada poço duas vezes com água destilada seguida, com isopropanol a 60% por 5 min e deixe secar.
7. Adicionar 0,5% de óleo vermelho O diluído em isopropanol a 60% (500 μL/poço) e incubar por 20 min em TR. Lavar com 1 mL de água destilada três vezes e observar em microscópio invertido.
   NOTA: Para reagentes, equipamentos e materiais necessários, consulte a Tabela de Materiais.

Resultados

O tecido adiposo foi obtido de ratos adultos da raça Sprague Dawley, com idade entre 3 e 4 meses de idade e peso corporal de 401 ± 41 g (média geométrica ± DP). O valor médio de 3,8 g de tecido adiposo epididimal e perirrenal correspondeu à análise de 15 extrações experimentais. Após 24 h de cultivo, as populações celulares permaneceram aderidas à superfície plástica e exibiram morfologia heterogênea. A primeira passagem foi realizada aos 8 ± 2 dias, com rendimento de 1,4 ± 0,6 x^10,6 célula...

Discussão

Nas últimas quatro décadas, desde a descoberta das CTMs, vários grupos de pesquisadores descreveram procedimentos para a obtenção de CTMs de diferentes tecidos e espécies. Uma das vantagens do uso de ratos como modelo animal é a sua fácil manutenção e rápido desenvolvimento, bem como a facilidade de obtenção de CTMs a partir do tecido adiposo. Diferentes fontes teciduais têm sido descritas para a obtenção de CTAs, como gordura visceral, perirrenal, epididimal e subcutânea12,13,14,15,16.^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025