تصوير الكالسيوم في القولون العلوي للفأر

Summary

يفصل هذا البروتوكول الإجراء الخاص بتصوير استجابات الكالسيوم في القولون العلوي (SC) للفئران المستيقظة ، بما في ذلك تصوير نشاط الخلايا العصبية المفردة باستخدام المجهر ثنائي الفوتون مع ترك القشرة سليمة في الفئران البرية ، وتصوير SC بأكمله بالمجهر واسع المجال في الفئران الطافرة ذات القشرة الجزئية.

Abstract

القولون العلوي (SC) ، وهو هيكل دماغي متوسط محفوظ تطوريا في جميع الفقاريات ، هو المركز البصري الأكثر تطورا قبل ظهور القشرة الدماغية. يتلقى مدخلات مباشرة من ~ 30 نوعا من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، مع كل ترميز ميزة بصرية محددة. لا يزال من بعيد المنال ما إذا كان SC يرث ببساطة ميزات الشبكية أو إذا حدثت معالجة إضافية وربما جديدة في SC. للكشف عن الترميز العصبي للمعلومات المرئية في SC ، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتسجيل الاستجابات المرئية بصريا بطريقتين متكاملتين في الفئران المستيقظة. تستخدم إحدى الطرق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتصوير نشاط الكالسيوم بدقة خلية واحدة دون إزالة القشرة المتراكبة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الفحص المجهري واسع المجال لتصوير SC بالكامل للفأر الطافر الذي تكون قشرته غير متطورة إلى حد كبير. يفصل هذا البروتوكول هاتين الطريقتين ، بما في ذلك تحضير الحيوانات ، والحقن الفيروسي ، وزرع الألواح الأمامية ، وزرع السدادة ، والحصول على البيانات ، وتحليل البيانات. تظهر النتائج التمثيلية أن تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون يكشف عن استجابات عصبية مستثارة بصريا بدقة خلية واحدة ، ويكشف تصوير الكالسيوم واسع المجال عن النشاط العصبي عبر SC بأكمله. من خلال الجمع بين هاتين الطريقتين ، يمكن للمرء أن يكشف عن الترميز العصبي في SC بمقاييس مختلفة ، ويمكن أيضا تطبيق هذا المزيج على مناطق الدماغ الأخرى.

Introduction

القولون العلوي (SC) هو مركز بصري مهم في جميع الفقاريات. في الثدييات ، يتلقى مدخلات مباشرة من شبكية العين والقشرة البصرية¹. بينما تم تطبيق التسجيل البصري على نطاق واسع على القشرة²،³،⁴،⁵ ، فإن تطبيقه في SC يعوقه ضعف الوصول البصري⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11،¹²،13،14،15،¹⁶<....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا لإرشادات رعاية الحيوان وتمت الموافقة عليها من قبل IACUC في المعهد الصيني لأبحاث الدماغ ، بكين.

ملاحظة: الجدول الزمني لهذا البروتوكول هو كما يلي: 1) جعل الالتصاق كوب. 2) حقن الفيروس. 3) زرع صفيحة الرأس. 4) بعد 3 أسابيع ، زرع القابس. 5) بعد ~ 3 أيام الانتعاش والتعود على حلقة مفرغة ، إجراء التصوير ثنائي الفوتون / واسع المجال.

1. تحضير كوب شفط (الشكل 1 أ)

1. قم بإيداع قطرة من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، 1x) في طبق أكريليك ولمسه بإبرة مسطحة 21 جم لملء الطرف بالشعيرات الدموية.
2. قم بتغطية طرف الإبر....

النتائج

يوضح الشكلان 1 أ ، ب كيفية صنع كوب الشفط والمقابس ، على التوالي. يوضح الشكل 2 كيفية زرع القابس بنجاح. بعد زرع القابس ، يتم الكشف عن SC الخلفي الإنسي ، كما هو موضح في الشكل 2D. يوضح الشكل 3 استجابات الكالسيوم للخلايا العصب?.......

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
الخطوة الأكثر أهمية هي حج القحف في الخطوتين 5.2 و 5.3. أولا ، العظم عند 0.5 مم خلف لامدا سميك ويحتوي على أوعية دموية بداخله ، مما قد يسبب النزيف أثناء عملية الحفر. يجب تحضير رغوة هلام كافية لوقف النزيف. ثانيا ، هناك فرصة جيدة للإصابة بالتهاب الأوعية الدمو.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks