Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Özet

Tüm omurgalılarda evrimsel olarak korunmuş bir orta beyin yapısı olan superior colliculus (SC), serebral korteksin ortaya çıkmasından önceki en karmaşık görsel merkezdir. Her biri belirli bir görsel özelliği kodlayan ~30 tip retinal ganglion hücresinden (RGC'ler) doğrudan girdiler alır. SC'nin sadece retinal özellikleri miras alıp almadığı veya SC'de ek ve potansiyel olarak de novo işlemenin meydana gelip gelmediği belirsizliğini koruyor. SC'deki görsel bilginin nöral kodlamasını ortaya çıkarmak için, burada uyanık farelerde iki tamamlayıcı yöntemle görsel yanıtları optik olarak kaydetmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bir yöntem, üst üste binen korteksi kesmeden tek hücre çözünürlüğünde kalsiyum aktivitesini görüntülemek için iki foton mikroskobu kullanırken, diğeri korteksi büyük ölçüde gelişmemiş bir mutant farenin tüm SC'sini görüntülemek için geniş alan mikroskobu kullanır. Bu protokol, hayvan hazırlama, viral enjeksiyon, başlık plakası implantasyonu, fiş implantasyonu, veri toplama ve veri analizi dahil olmak üzere bu iki yöntemi detaylandırır. Temsili sonuçlar, iki fotonlu kalsiyum görüntülemenin, tek hücre çözünürlüğünde görsel olarak uyarılmış nöronal tepkileri ortaya çıkardığını ve geniş alanlı kalsiyum görüntülemenin tüm SC boyunca nöral aktiviteyi ortaya çıkardığını göstermektedir. Bu iki yöntem birleştirilerek SK'deki nöral kodlama farklı ölçeklerde ortaya çıkarılabilir ve bu kombinasyon beynin diğer bölgelerine de uygulanabilir.

Giriş

Superior colliculus (SC) tüm omurgalılarda önemli bir görme merkezidir. Memelilerde, retinadan ve görsel korteksten^{doğrudan girdi alır 1}. Optik kayıt, korteks 2,3,4,5'e yaygın olarak uygulanırken, SC'deki uygulaması zayıf optik erişimler tarafından engellenmektedir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,^18,19. Bu protokolün amacı, SC'deki nöral aktivitenin optik kaydı için iki tamamlayıcı yöntem hakkında ayrıntılı bilgi sağlamaktır.

SC, kolliküler nöronlara optik erişimi sınırlayan korteks ve transvers sinüsün altında bulunur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yaklaşım, üst üste binen korteksi aspire etmek ve ön-lateral SC 7,9,10,13,14,19'u ortaya çıkarmaktır. Bununla birlikte, SC kortikal girdiler aldığından, böyle bir işlem SC nöronlarının görsel uyaranlara nasıl tepki verdiğini etkileyebilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, korteksi sağlam bırakırken posterior-medial SC'nin yüzeysel tabakasını silikon bir tıkaç ile görüntülemek için alternatif bir protokolü burada detaylandırıyoruz ^8,11. Spesifik olarak, tek hücreli çözünürlük elde etmek için, vahşi tip farelerin posterior-medial SC'sindeki kalsiyum tepkilerini görüntülemek için iki foton mikroskobu uyguladık. Ek olarak, geniş kapsama alanı elde etmek için, posterior korteksi^{gelişmemiş bir} mutant farenin tüm SC'sini görüntülemek için geniş alan mikroskobu uyguladık 20.

Bu protokolde açıklanan iki yöntem birbirini tamamlayıcı niteliktedir. Korteks kesilmeden iki fotonlu kalsiyum görüntüleme, sağlam kortikal girdilerle tek hücre çözünürlüğünde nöral aktiviteyi kaydetmek için uygundur. Geniş alanlı kalsiyum görüntüleme, uzamsal çözünürlükten ödün verirken tüm SC'deki nöral aktiviteyi kaydetmek için uygundur.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler hayvan refahı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Pekin'deki Çin Beyin Araştırmaları Enstitüsü'ndeki IACUC tarafından onaylandı.

NOT: Bu protokolün zaman çizelgesi aşağıdaki gibidir: 1) vantuzu yapın; 2) virüsü enjekte etmek; 3) kafa plakasını implante edin; 4) 3 hafta sonra, fişi implante edin; 5) Koşu bandında ~ 3 günlük bir iyileşme ve alışkanlıktan sonra, iki foton / geniş alan görüntüleme yapın.

1. Vantuz hazırlanması (Şekil 1A)

1. Akrilik bir tabağa bir damla fosfat tamponlu salin (PBS, 1x) koyun ve ucu kılcallık ile doldurmak için 21 G düz bir iğne ile dokunun.
2. İğnenin ucunu yarı saydam bir silikon yapıştırıcı ile kapatın ve yaklaşık ~10 dakika bekletin.
3. Silikon yapıştırıcıyı makasla ~2 mm çapında bir diske kesin.

2. Fişlerin hazırlanması (Şekil 1B)

1. 0,75 mm kalınlığında bir plastik şim stoğu hazırlayın ve ortasından 1 cm x 1 cm'lik bir kare kesin. İki akrilik blok hazırlayın. Şim stoğunu ve akrilik blokları alkolle temizleyin ve lens kağıdı ile silin.
2. Şim stoğunu bir akrilik blok üzerine koyun, açıklığın ~%90'ını doldurmak için silikon yapıştırıcıyı merkeze bırakın (kabarcıkları önleyin), başka bir akrilik blok ve ~1 kg kuvvet ekleyin ve 20 dakika bekleyin.
3. Cerrahi mikroskop altında, silikon yapıştırıcıyı bir neşter ile 1 mm yüksekliğinde ve 1,5 mm genişliğinde üçgen prizmalar üzerinde üçgen baskılı bir kağıt parçasının üzerinde kesin.
4. Üçgen prizmalardaki tozu plastik yapışkan bantla temizleyin ve 5 mm çapında ve 0,15 mm kalınlığında bir cam lamel üzerine koyun.
5. Üçgen prizmalarla lamel bir korona muamelecinin altına koyun, korona muamele ediciyi açın ve aydınlatma görünene kadar lamel yaklaştırın. Birbirlerine yapışana kadar birkaç dakika bu konumda tutun.
   NOT: Bu adım diğer korona tedavi ediciler için farklı olabilir.
6. Tıkaçları bir Petri kabına koyun ve gece boyunca 70 °C'de bir inkübatöre koyun.

3. Hayvanların hazırlanması ve viral yapının enjeksiyonu

1. C57BL / 6J (vahşi tip) ve Emx1-Cre: Pals1^{flox / wt} (kısmi korteks) ²⁰ fareyi 6 haftalıkken (görüntüleme sırasında 9 hafta) kullanın.
2. Cerrahi prosedür için kullanılan tüm malzemeleri ve aletleri sterilize edin.
3. Fareyi %5 izofluran ile uyuşturun ve ardından ameliyat sırasında 1 L / dak akış hızıyla izofluranı %1-2'de tutun. Ayak parmağı sıkıştırma refleksinin olmaması ile anestezi seviyesini onaylayın.
4. Fareyi kulak çubukları ile stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. Ameliyat boyunca kurumasını önlemek için fare gözlerine oftalmik merhem sürün ve termostatik ısıtma yastığı ile vücut ısısını 37 °C'de tutun.
5. Kürkü tıraş edin ve cilt yüzeyini iyodofor ve% 75 etanol ile sterilize edin. Lidokain (5 mg/kg, deri altı enjeksiyon [SQ]), tilidin (2 mg/kg, SQ) ve meloksikam (2 mg/kg, SQ) enjekte edin.
   NOT: Sterilizasyon, analjezi ve lokal anestezi için cerrahi prosedür kurumlar arasında farklılık gösterebilir.
6. Kafatasını ortaya çıkarmak için SC'nin üzerindeki cildi cerrahi makasla çıkarın. Kafatasını pamuklu çubukla temizleyin.
7. Kafatası yüzeyi düz olana kadar stereotaksik çerçeveyi ayarlayın. Dura açığa çıkana kadar lambdanın 0.5 mm yanal ve 0.42 mm önünde bir delik açın.
8. GCaMP6m (rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m; 1 x 10¹³ GC/mL) eksprese eden adeno-ilişkili virüsü (AAV) lambdadan 1 mm ve 1,6 mm derinliklerde eğimli bir cam mikropipetle enjekte edin (uç 40-50 μm çapında 25°'ye eğimlidir).
9. Her derinlikte, 50 nL/dk hızında 100 nL enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra 5 dakika bekleyin. Enjeksiyondan sonra enjektörü yavaşça geri çekin.

4. Başlık plakasının implantasyonu

1. Kafatasının üzerindeki kasları ve dokuları temizleyin ve kafatasını bir bıçakla çizin. Kanama olursa, jel köpük ile durdurun ve kanı temizleyin. Başlık plakasını (Şekil 1C) kendi kendine kürlenen bir diş yapıştırıcısı reçine simenti ile kafatasına tutturun. Spesifik olarak, 3/4 kaşık polimer, üç damla monomer ve bir damla katalizörü buz üzerinde seramik bir kapta karıştırın. Karışımı başlık plakasına ve kafatasına uygulayın. Bunları birbirine yapıştırın ve yapıştırıcının kuruması için 5 dakika bekleyin.
2. Enfeksiyonları önlemek için antibiyotik (ceftiofur sodyum, 5 mg / kg, SQ) enjekte edin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kurtarma için bir ısıtma yastığına yerleştirin. Anesteziden kurtulduktan sonra ev kafesine geri koyun. Ağrı yönetimi için, ameliyattan sonraki 3 gün boyunca fareye ibuprofen içeren içme suyu (0,5 mL / 50 mL) sağlayın.

5. Fişin implantasyonu (Şekil 2)

1. Viral enjeksiyondan 3 hafta sonra fişi implante edin. Fareyi 3.2-3.5 adımlarında açıklandığı gibi stereotaksik bir çerçeveye uyuşturun ve sabitleyin. Olası kanamayı durdurmak için tuzlu suya batırılmış jel köpüğü hazırlayın.
2. Lambdanın 3 mm arkasında ortalanmış bir mikro matkapla 2 mm x 0.5 mm oval delin. Ovalin kenarını çatlayana kadar inceltin. Lameli SC'ye yaklaştırmak için oval kayıt penceresinin önündeki kafatasını inceltin.
3. İnce forseps kullanarak kemik kapaklarını çıkarın. Transvers sinüsün arkasındaki dura'da bir kesi yapın ve dura parçasını çıkarın. Gerekirse, kurumayı önlemek için beyne 3 mL'lik bir şırınga ile yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ekleyin. Kafatasını ve kayıt penceresini jel köpük ve pamuklu çubuklarla kurulayın.
4. Kayıt penceresine bir damla silikon yapıştırıcı bırakın. Fişi negatif basınçla tutmak için vantuzu kullanın. Vantuzu hareket ettirmek için motorlu bir mikromanipülatör kullanın ve lamel kafatasına değene kadar tapayı silikon yapıştırıcıya indirin. Ardından, transvers sinüsü itmek ve SC'yi ortaya çıkarmak için fişi ~1 mm ileri hareket ettirin. Bu adım, silikon yapıştırıcı yapışkan hale gelmeden önce 1-2 dakika içinde yapılmalıdır.
5. Başlık plakasını temizleyin ve başlık plakasına sabitlemek için tapanın sınırına bütil siyanoakrilat ve reçine çimentosu uygulayın.
   NOT: Adım 4.2'de açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlayın.

6. İki fotonlu görüntüleme (Şekil 3)

1. Hayvanı, kafa plakası ile dönen bir koşu bandına sabitleyin. Koşu bandını iki fotonlu bir mikroskobu altına yerleştirin ve yüksekliği uygun bir konuma ayarlayın. Görsel stimülasyon için monitörden ışık kirlenmesini önlemek için objektif ile başlık arasına siyah bir alüminyum koni koyun. Fareyi ~15 dakika alıştırın.
2. Mikroskopta 16x büyütme, 0.8 sayısal açıklık (NA) ve 3 mm çalışma mesafesi (WD) objektifi ile iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirin. GCaMP6m'yi 920 nm'de uyarmak için iki galvo tarayıcı tarafından kontrol edilen mod kilitleme tekniğine sahip bir Ti: safir lazer kullanın. S'deki lazer gücünü ayarlayınampdüzlem 20-80 mW arasında.
3. 4,8 Hz'de 600 μm x 600 μm görüş alanını 2,4 μ m/piksel uzamsal çözünürlükle ve 350 μ m'ye kadar derinlikte görüntü nöral aktivitesini tarayın.
   NOT: Örnekleme hızı ve uzamsal çözünürlük galvo tarayıcılar içindir ve rezonans tarayıcılar için ayarlanmalıdır.
4. Yayılan floresansı dikroik bir ayna ile toplayın ve bir bant geçiren filtreden geçirdikten sonra bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanarak tespit edin.
5. Döner kodlayıcı ile farenin koşu bandındaki hareketini kaydedin. Göz bebeği boyutunu ve konumunu kaydetmek için 50 mm lensli bir kamera kullanın. Stimülasyon bilgisayarı tarafından gönderilen tetikleyicileri kaydederek bu kayıtları ve görüntü alımlarını görsel stimülasyonla senkronize edin.

7. İki fotonlu görüntüleme ile ölçülen kalsiyum yanıtlarının analizi

1. SIMA²¹ veya NoRMCorre²² kullanarak görüntüleme sırasında beyin hareketini düzeltin.
2. Hücre Sihirli Değnek aracını (ImageJ) kullanarak ilgilenilen bir bölgeyi (ROI) manuel olarak çizin ve MATLAB'de bir elips ile sığdırın. Nöropil kontaminasyonunu giderdikten sonra her ROI'nin floresan izlerini çıkarın:
   
   F _true ve F _raw, sırasıyla ROI'nin düzeltilmiş ve ham floresan genlikleridir, F nöropil, çevreleyen nöropilin floresan genliğidir ve r, odak dışı _nöropilkontaminasyon faktörüdür (kurulumumuz için 0.7). R, daha önce açıklandığı gibi, F_true= 0 olan bir kan damarı üzerindeki sinyallerin ölçülmesiyle tahmin edilir^23,24.
3. Her karede²⁵ ortalanmış 15 sn penceresinden sekizinci yüzdebirlik değeri çıkararak yavaş taban çizgisi dalgalanmalarını kaldırın.
4. Bir nöronun görsel tepkilerini, uyaran periyodu sırasında ROI'sindeki floresan genliğinin göreceli değişimi olarak tanımlayın:
   
   F _zirvesi , görsel stimülasyon sırasında floresan izinin tepe genliğidir ve F_{taban çizgisi}, stimülasyondan önceki 0.5 saniyelik bir süre boyunca ortalama genliktir.

8. Geniş alan görüntüleme ve veri analizi (Şekil 4)

1. Tandem lens⁴ ile geniş alanlı bir makroskop oluşturun (Şekil 4A). Tandem lensli makroskop , bir adaptörle bağlanan iki kamera merceğidir (50 mm ve 105 mm) ve büyütme ~2x'tir.
2. Kısmi korteks mutant fareleri adım 3.2-3.5'te açıklandığı gibi hazırlayın. SC'nin her iki tarafının ortasına 200 μm derinlikte GCaMP6m eksprese eden 100 nL AAV enjekte edin.
3. ~ 3 hafta sonra, SC'nin üzerine 5 mm çapında bir lamel yerleştirin. SC'de ortalanmış 4 mm x 3 mm'lik oval bir kraniotomi yapın ve etrafındaki kemiği inceltin. Ardından, lamel doğrudan SC'nin üzerine bastırın ve reçine çimentosu ile sabitleyin.
4. GCaMP6m'yi uyarma filtreli (469 nm ± 35 nm) mavi ışık yayan diyot (LED) ile uyarın. 10 Hz'de bir emisyon filtresinden (525 nm ± 39 nm) geçtikten sonra tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera kullanarak görüntü elde edin. Kamera, 2,63 μm/piksel uzamsal çözünürlükte 5,36 mm x 2,85 mm'lik bir alanı kaplar.
5. Alınan her görüntüyü normalleştirilmiş bir kutu filtresiyle birleştirin ve orijinal boyutunun 1/4'üne kadar alt örnekleyin. Görüntüdeki her piksel için, adım 7.4'te açıklandığı gibi yanıtı tanımlayın.
   NOT: Adım 4.2'de açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlayın.

Sonuçlar

Şekil 1A,B, sırasıyla vantuz ve tapaların nasıl yapılacağını göstermektedir. Şekil 2 , fişin nasıl başarılı bir şekilde implante edileceğini göstermektedir. Tıkaç implante edildikten sonra, Şekil 2D'de gösterildiği gibi posterior-medial SC ortaya çıkar. Şekil 3 , iki foton mikroskobu kullanılarak görüntülenen örnek bir vahşi tip fareden SC nöronlarını...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
En kritik adım, 5.2 ve 5.3 adımlarındaki kraniyotomidir. İlk olarak, lambdanın 0,5 mm arkasındaki kemik kalındır ve içinde kan damarları vardır, bu da delme işlemi sırasında kanamaya neden olabilir. Kanamayı durdurmak için yeterli jel köpük hazırlanmalıdır. İkincisi, transvers sinüsün hemen üzerindeki kemiği çıkarırken iyi bir anjiorreksi olasılığı vardır. Sorun giderme için alternatif bir yaklaşım, ovalin içindeki kemiği inceltmek ve...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks