小鼠上丘的钙成像

摘要

该方案详细介绍了在清醒小鼠的上丘（SC）中对钙反应进行成像的过程，包括用双光子显微镜成像单神经元活动，同时在野生型小鼠中保持皮层完整，以及在部分皮层突变小鼠中用宽场显微镜对整个SC进行成像。

摘要

上丘（SC）是所有脊椎动物进化上保守的中脑结构，是大脑皮层出现之前最复杂的视觉中心。它接收来自 ~30 种视网膜神经节细胞 （RGC） 的直接输入，每种细胞编码特定的视觉特征。SC 是否只是继承视网膜特征，或者 SC 中是否发生了额外的和潜在的 从头 处理，仍然难以捉摸。为了揭示SC中视觉信息的神经编码，我们在这里提供了一个详细的协议，以在清醒小鼠中使用两种互补方法光学记录视觉反应。一种方法使用双光子显微镜以单细胞分辨率对钙活性进行成像，而不消融覆盖的皮层，而另一种方法使用宽视场显微镜对皮层基本未发育的突变小鼠的整个SC进行成像。该协议详细介绍了这两种方法，包括动物制备、病毒注射、头板植入、栓子植入、数据采集和数据分析。代表性结果表明，双光子钙成像揭示了单细胞分辨率下的视觉诱发神经元反应，而宽视野钙成像揭示了整个SC的神经活动。通过结合这两种方法，人们可以揭示SC中不同尺度的神经编码，并且这种组合也可以应用于其他大脑区域。

引言

上丘（SC）是所有脊椎动物的重要视觉中枢。在哺乳动物中，它接收来自视网膜和视觉皮层的直接输入¹。虽然光学记录已广泛应用于皮层 2,3,4,5，^但其在 SC 中的应用受到不良光学访问的阻碍 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

研究方案

所有实验程序均按照动物福利指南进行，并得到北京中国脑科学研究院IACUC的批准。

注意：该协议的时间表如下：1）制作吸盘;2）注射病毒;3）植入头板;4）3周后，植入塞子;5） 在跑步机上恢复和适应 ~3 天后，进行双光子/宽视场成像。

1.吸盘的准备（图1A）

1. 将一滴磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）放入丙烯酸培养皿中，并用21G扁平针触摸它，以通过毛细管填充尖端。
2. 用半透明的硅胶粘合剂覆盖针尖，并放置约~10分钟。
3. 用剪刀将硅胶粘合剂剪成直径为 ~2 毫米的圆盘。

2.插头的准备（图1B）

1. 准备一个 0.75 毫米厚的塑料垫片，并在中心切出一个 1 厘米 x 1 厘米的正方形。准备两个亚克力块。用酒精清洁垫片和亚克力块，然后用镜头纸擦拭。
2. 将垫片放在一个亚克力块上，将硅胶粘合剂沉积到中心以填充~90%的开口（避免气泡），添加另一个亚克力块和~1 kg力，然后等待20分钟。
3. 在手术显微镜....

讨论

协议中的关键步骤
最关键的一步是步骤 5.2 和 5.3 中的开颅手术。首先，λ后方 0.5 毫米处的骨头很厚，里面有血管，在钻孔过程中会导致出血。应准备足够的凝胶泡沫来止血。其次，切除横窦上方的骨头时，很有可能发生血管出血。对于故障排除，另一种方法是将椭圆形内的骨头变薄并一块一块地移除。另一个技巧是在提升前浸泡骨头，使硬脑膜更容易从骨头上分离并防止出血。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks