Визуализация кальция в Верхнем колликулусе мышей

Резюме

В этом протоколе подробно описана процедура визуализации кальциевых ответов в верхнем бугорке (СК) бодрствующих мышей, включая визуализацию активности одного нейрона с помощью двухфотонной микроскопии с оставлением коры нетронутой у мышей дикого типа, а также визуализацию всей СК с помощью широкопольной микроскопии у мутантных мышей с частичной корой.

Аннотация

Верхняя колликула (СК), эволюционно консервативная структура среднего мозга у всех позвоночных, является наиболее сложным зрительным центром до появления коры головного мозга. Он получает прямые входные данные от ~30 типов ганглиозных клеток сетчатки (RGC), каждый из которых кодирует определенную визуальную особенность. Остается неясным, наследует ли СК просто особенности сетчатки, или же в СК происходит дополнительная и потенциально de novo обработка. Чтобы выявить нейронное кодирование визуальной информации в СК, мы приводим здесь подробный протокол оптической регистрации зрительных реакций с помощью двух взаимодополняющих методов у бодрствующих мышей. Один метод использует двухфотонную микроскопию для визуализации активности кальция в разрешении одной клетки без абляции коры головного мозга, в то время как другой использует широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, кора головного мозга которой в значительной степени не развита. В этом протоколе подробно описаны эти два метода, включая подготовку животных, инъекцию вируса, имплантацию головной пластины, имплантацию пробки, сбор данных и анализ данных. Репрезентативные результаты показывают, что двухфотонная кальциевая визуализация выявляет визуально вызванные нейронные реакции при разрешении одной клетки, а широкопольная кальциевая визуализация показывает нейронную активность во всем СК. Комбинируя эти два метода, можно выявить нейронное кодирование в СК в разных масштабах, и такая комбинация может быть применена и к другим областям мозга.

Введение

Верхний бугорок (СК) является важным зрительным центром у всех позвоночных. У млекопитающих он получает прямые входные сигналы от сетчатки и зрительной коры¹. В то время как оптическая регистрация широко применяется в коре^{головного} мозга 2,3,4,5, ее применение в СК затруднено плохими оптическими доступами 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями по благополучию животных и одобрены IACUC при Китайском институте исследований мозга в Пекине.

ПРИМЕЧАНИЕ: График этого протокола следующий: 1) сделать присоску; 2) ввести вирус; 3) имплантировать наголовную пластину; 4) через 3 недели имплантировать заглушку; 5) После ~3 дней восстановления и привыкания на беговой дорожке выполните двухфотонную / широкоугольную визуализацию.

1. Подготовка присоски (Рисунок 1А)

1. Нанесите каплю фосфатно-солевого буфера (PBS, 1x) в ....

Результаты

На рисунках 1A, B показано, как изготовить присоску и пробки соответственно. На рисунке 2 показано, как успешно имплантировать пробку. После имплантации пробки обнажается задне-медиальная СК, как показано на рисунке 2D. Н.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Наиболее ответственным этапом является трепанация черепа на этапах 5.2 и 5.3. Во-первых, кость на 0,5 мм позади лямбды толстая и имеет кровеносные сосуды внутри, что может вызвать кровотечение в процессе сверления. Для остановки кровотечения следует ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks