マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

要約

このプロトコルは野生型マウスの皮質をそのまま残している間2光子の顕微鏡検査との単一ニューロンの活動をイメージ投射すること、および部分皮質の突然変異体のマウスの広視野顕微鏡検査が付いている全体のSCをイメージ投射することを含む目がさめているマウスの優秀なcolliculus (SC)のカルシウム応答を、イメージ投射するためのプロシージャを詳述する。

要約

すべての脊椎動物で進化的に保存された中脳構造である上結腸(SC)は、大脳皮質が出現する前の最も洗練された視覚中枢です。~30種類の網膜神経節細胞(RGC)から直接入力を受け、それぞれが特定の視覚的特徴をコード化しています。SCが単に網膜の特徴を継承するのか、それとも追加の潜在的に de novo プロセシングがSCで起こるのかは、とらえどころのないままです。SCにおける視覚情報の神経コーディングを明らかにするために、ここでは、覚醒マウスの2つの相補的な方法で視覚応答を光学的に記録するための詳細なプロトコルを提供します。1つは、2光子顕微鏡を用いて、重なり合う皮質を切除することなく、1細胞の分解能でカルシウム活性を画像化する方法であり、もう1つは、広視野顕微鏡を用いて、皮質がほとんど発達していない変異マウスのSC全体を画像化する方法です。このプロトコルでは、動物調製、ウイルス注入、ヘッドプレート移植、プラグ移植、データ収集、データ解析など、これら2つの方法を詳しく説明します。代表的な結果は、2光子カルシウムイメージングが1細胞分解能で視覚的に誘発された神経応答を明らかにし、広視野カルシウムイメージングがSC全体の神経活動を明らかにすることを示しています。この2つの方法を組み合わせることで、異なるスケールでのSCの神経コードを明らかにすることができ、そのような組み合わせは他の脳領域にも適用できます。

概要

上結腸(SC)は、すべての脊椎動物において重要な視覚中枢です。哺乳類では、網膜および視覚野¹から直接入力を受ける。光記録は皮質2,3,4,5に広く適用されているが、SCでの応用は光アクセスの悪さによって妨げられ^ている6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

プロトコル

すべての実験手順は、動物福祉ガイドラインに従って実施され、北京の中国脳研究所のIACUCによって承認されました。

注:このプロトコルのタイムラインは次のとおりです:1)吸盤を作ります。2)ウイルスを注入する。3)ヘッドプレートを埋め込みます。4)3週間後、プラグを埋め込みます。5)トレッドミルで~3日間の回復と慣れの後、2光子/広視野イメージングを実行します。

1.吸盤の準備(図1A)

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1x)をアクリル皿に一滴垂らし、21Gの平らな針で触れて毛細管現象で先端を満たします。
2. 針の先端を半透明のシリコン接着剤で覆い、約~10分間セットします。
3. シリコーン接着剤をはさみで直径~2mmの円盤に切ります。

2.プラグの準備(図1B)

1. 厚さ0.75mmのプラスチックシムストックを用意し、中央に1cm×1cmの正方形を切り取ります。アクリルブロックを2枚用意します。シムストックとアクリルブロックをアルコールで....

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
最も重要なステップは、ステップ5.2と5.3の開頭手術です。まず、ラムダの後0.5mmの骨は太く、内部に血管があるため、穴あけプロセス中に出血する可能性があります。出血を止めるために適切なジェルフォームを準備する必要があります。.第二に、横洞のすぐ上の骨を取り除くと、血管性動脈硬化症の可能性が高くなります。トラブルシューティ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks