הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

Abstract

הקוליקולוס העליון (SC), מבנה מוח אמצעי שנשמר אבולוציונית אצל כל בעלי החוליות, הוא מרכז הראייה המתוחכם ביותר לפני הופעתה של קליפת המוח. הוא מקבל קלט ישיר מ ~ 30 סוגים של תאי גנגליון רשתית (RGCs), כאשר כל אחד מהם מקודד תכונה חזותית ספציפית. עדיין לא ברור אם ה-SC פשוט יורש תכונות רשתית או אם מתרחש עיבוד נוסף ופוטנציאלי דה נובו ב-SC. כדי לחשוף את הקידוד העצבי של מידע חזותי ב-SC, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט לרישום אופטי של תגובות חזותיות בשתי שיטות משלימות בעכברים ערים. שיטה אחת משתמשת במיקרוסקופ של שני פוטונים כדי לדמות פעילות סידן ברזולוציה של תא בודד מבלי לבעור את קליפת המוח המכסה אותו, ואילו השיטה השנייה משתמשת במיקרוסקופ רחב שדה כדי לצלם את כל ה-SC של עכבר מוטנטי שקליפת המוח שלו אינה מפותחת ברובה. פרוטוקול זה מפרט את שתי השיטות הללו, כולל הכנת בעלי חיים, הזרקה ויראלית, השתלת לוחית ראש, השתלת תקעים, איסוף נתונים וניתוח נתונים. התוצאות המייצגות מראות כי הדמיית הסידן של שני פוטונים חושפת תגובות עצביות מעוררות חזותית ברזולוציה של תא יחיד, והדמיית הסידן בשדה רחב חושפת פעילות עצבית על פני כל ה-SC. על-ידי שילוב שתי השיטות הללו, ניתן לחשוף את הקידוד העצבי ב-SC בקני מידה שונים, ושילוב כזה יכול להיות מיושם גם על אזורי מוח אחרים.

Introduction

הקוליקולוס העליון (SC) הוא מרכז ראייה חשוב בכל בעלי החוליות. ביונקים הוא מקבל קלט ישיר מהרשתית ומקליפת המוח הראייתית¹. בעוד שהקלטה אופטית יושמה באופן נרחב על קליפת המוח 2,3,4,5, היישום שלה ב-SC מעוכב על ידי גישה אופטית גרועה 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ^....

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים ואושרו על ידי IACUC במכון הסיני לחקר המוח, בייג'ינג.

הערה: ציר הזמן עבור פרוטוקול זה הוא כדלקמן: 1) להכין את היניקה; 2) להזריק את הנגיף; 3) להשתיל את לוחית הראש; 4) לאחר 3 שבועות, להשתיל את התקע; 5) לאחר ~3 ימי התאוששות והתרגלות על ההליכון, בצע הדמיה של שני פוטונים/שדה רחב.

1. הכנת יניקה (איור 1A)

1. הניחו טיפה של מלח חוצץ פוספט (PBS, 1x) בכלי אקרילי וגעו בו עם מחט שטוחה 21 G כדי למלא את הקצה על ידי נימים.
2. מכסים את קצה המחט בדבק סיליקון שקוף ומניחים למשך כ~10 דקות.
3. חותכים....

תוצאות

איורים 1A,B מראים כיצד ליצור את היניקה ואת התקעים, בהתאמה. איור 2 מראה כיצד להשתיל את התקע בהצלחה. לאחר השתלת התקע, ה-SC האחורי-מדיאלי נחשף, כפי שמוצג באיור 2D. איור 3 מראה תגובות סידן של תאי עצב מסוג SC מעכבר פראי לדוגמה שצו.......

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
השלב הקריטי ביותר הוא קרניוטומיה בשלבים 5.2 ו -5.3. ראשית, העצם ב-0.5 מ"מ אחורית ללמדא עבה ובתוכה כלי דם, מה שעלול לגרום לדימום בתהליך הקידוח. קצף ג'ל הולם צריך להיות מוכן לעצור את הדימום. שנית, יש סיכוי טוב לאנגיורקסיס בעת הסרת העצם ממש מעל הסינוס הרוחבי. לפתרון .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks