Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Résumé

Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Résumé

Le colliculus supérieur (SC), une structure du mésencéphale conservée au cours de l’évolution chez tous les vertébrés, est le centre visuel le plus sophistiqué avant l’émergence du cortex cérébral. Il reçoit des entrées directes de ~30 types de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC), chacune codant pour une caractéristique visuelle spécifique. Il reste difficile de savoir si le CS hérite simplement des caractéristiques rétiniennes ou si un traitement supplémentaire et potentiellement de novo se produit dans le CS. Pour révéler le codage neuronal de l’information visuelle dans le SC, nous fournissons ici un protocole détaillé pour enregistrer optiquement les réponses visuelles avec deux méthodes complémentaires chez les souris éveillées. Une méthode utilise la microscopie à deux photons pour imager l’activité du calcium à une seule résolution cellulaire sans ablation du cortex superposé, tandis que l’autre utilise la microscopie à grand champ pour imager l’ensemble du SC d’une souris mutante dont le cortex est en grande partie sous-développé. Ce protocole détaille ces deux méthodes, y compris la préparation des animaux, l’injection virale, l’implantation de la plaque de tête, l’implantation du bouchon, l’acquisition de données et l’analyse des données. Les résultats représentatifs montrent que l’imagerie calcique à deux photons révèle des réponses neuronales évoquées visuellement à une résolution unicellulaire, et que l’imagerie calcique à grand champ révèle une activité neuronale dans l’ensemble du SC. En combinant ces deux méthodes, on peut révéler le codage neuronal dans le CS à différentes échelles, et une telle combinaison peut également être appliquée à d’autres régions du cerveau.

Introduction

Le colliculus supérieur (SC) est un centre visuel important chez tous les vertébrés. Chez les mammifères, il reçoit des entrées directes de la rétine et du cortex visuel¹. Alors que l’enregistrement optique a été largement appliqué au cortex 2,3,4,5, son application dans le SC est entravée par de mauvais accès optiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives sur le bien-être animal et approuvées par l’IACUC de l’Institut chinois de recherche sur le cerveau de Beijing.

REMARQUE : L’échéancier de ce protocole est le suivant : 1) faire la ventouse ; 2) injecter le virus ; 3) implanter la plaque de tête ; 4) après 3 semaines, implantez le bouchon ; 5) Après une récupération et une accoutumance de ~3 jours sur le tapis roulant, effectuez une imagerie à deux photons/grand champ.

1. Préparation d’une ventouse (Figure 1A)

Discussion

Étapes critiques du protocole
L’étape la plus critique est la craniotomie aux étapes 5.2 et 5.3. Tout d’abord, l’os à 0,5 mm en arrière de la lambda est épais et contient des vaisseaux sanguins, ce qui peut provoquer des saignements pendant le processus de forage. Une mousse de gel adéquate doit être préparée pour arrêter le saignement. Deuxièmement, il y a un bon risque d’angiorrhexie lors de l’ablation de l’os juste au-dessus du sinus transverse. Pour le dépannage, une autre.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks