Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

요약

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

초록

모든 척추동물에서 진화적으로 보존된 중뇌 구조인 상구(superior colliculus, SC)는 대뇌피질이 출현하기 전에 가장 정교한 시각 중추입니다. ~30가지 유형의 망막 신경절 세포(RGC)로부터 직접 입력을 받으며, 각 세포는 특정 시각적 특징을 인코딩합니다. SC가 단순히 망막 특징을 물려받는지, 아니면 SC에서 추가적이고 잠재적으로 새로운 처리가 발생하는지는 여전히 파악하기 어렵습니다. SC에서 시각 정보의 신경 코딩을 밝히기 위해 깨어 있는 쥐에서 두 가지 보완적인 방법으로 시각적 반응을 광학적으로 기록하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 한 가지 방법은 이광자 현미경을 사용하여 중첩 피질을 절제하지 않고 단일 세포 해상도로 칼슘 활성을 이미지화하는 반면, 다른 방법은 광시야 현미경을 사용하여 피질이 거의 발달하지 않은 돌연변이 쥐의 전체 SC를 이미지화합니다. 이 프로토콜은 동물 준비, 바이러스 주입, 헤드플레이트 이식, 플러그 주입, 데이터 수집 및 데이터 분석을 포함한 이 두 가지 방법을 자세히 설명합니다. 대표적인 결과는 이광자 칼슘 이미징이 단일 세포 해상도에서 시각적으로 유발된 신경 반응을 나타내고 광시야 칼슘 이미징이 SC 전체에 걸쳐 신경 활동을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 두 가지 방법을 결합하면 SC의 신경 코딩을 서로 다른 규모로 밝힐 수 있으며 이러한 조합은 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있습니다.

서문

상구(superior colliculus, SC)는 모든 척추동물에서 중요한 시각 중추입니다. 포유류에서는 망막과 시각 피질(visual cortex)1로부터 직접 입력을^받는다. 광학 기록은 피질 2,3,4,5에 널리 적용되어 왔지만, SC에서의 적용은 열악한 광학 액세스 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17에 의해 방해를 받는다

프로토콜

모든 실험 절차는 동물 복지 지침에 따라 수행되었으며 베이징에 있는 중국 뇌 연구소의 IACUC의 승인을 받았습니다.

참고: 이 프로토콜의 타임라인은 다음과 같습니다: 1) 흡입 컵을 만드십시오. 2) 바이러스를 주입합니다. 3) 헤드플레이트를 이식합니다. 4) 3 주 후, 플러그를 이식하십시오. 5) 트레드밀에서 ~3일의 회복 및 습관화 후 이광자/광시야 이미징을 수행합니다.

1. 흡입 컵 준비(그림 1A)

1. 아크릴 접시에 인산염 완충 식염수(PBS, 1x) 한 방울을 넣고 21G의 납작한 바늘로 만져 모세관으로 팁을 채웁니다.
2. 바늘 끝을 반투명 실리콘 접착제로 덮고 약 ~10분 동안 고정합니다.
3. 실리콘 접착제를 가위로 직경 ~ 2mm의 디스크로 자릅니다.

2. 플러그 준비(그림 1B)

1. 0.75mm 두께의 플라스틱 심 스톡을 준비하고 중앙....

토론

프로토콜의 중요한 단계
가장 중요한 단계는 5.2단계와 5.3단계의 개두술입니다. 첫째, 람다 뒤쪽 0.5mm의 뼈는 두껍고 내부에 혈관이 있어 시추 과정에서 출혈이 발생할 수 있습니다. 출혈을 멈추기 위해 적절한 젤 폼을 준비해야 합니다. 둘째, 횡동(transverse sinus) 바로 위의 뼈를 제거할 때 혈관 손상증이 발생할 가능성이 높습니다. 문제 해결을 위한 한 가지 다른 방법은 타원형 내부?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks