Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Zusammenfassung

Der Colliculus superior (SC), eine evolutionär konservierte Mittelhirnstruktur bei allen Wirbeltieren, ist das am weitesten entwickelte Sehzentrum vor der Entstehung der Großhirnrinde. Es empfängt direkte Eingaben von ~30 Arten von retinalen Ganglienzellen (RGCs), von denen jede ein bestimmtes visuelles Merkmal kodiert. Es bleibt unklar, ob der SC einfach nur Netzhautmerkmale erbt oder ob eine zusätzliche und möglicherweise de novo Verarbeitung im SC stattfindet. Um die neuronale Kodierung visueller Informationen im SC aufzudecken, stellen wir hier ein detailliertes Protokoll zur optischen Aufzeichnung visueller Reaktionen mit zwei komplementären Methoden in wachen Mäusen zur Verfügung. Eine Methode verwendet Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Kalziumaktivität mit Einzelzellauflösung abzubilden, ohne den überlagernden Kortex abzutragen, während die andere Weitfeldmikroskopie verwendet, um die gesamte SC einer mutierten Maus abzubilden, deren Kortex weitgehend unentwickelt ist. In diesem Protokoll werden diese beiden Methoden detailliert beschrieben, einschließlich der Tierpräparation, der Virusinjektion, der Kopfplattenimplantation, der Plug-Implantation, der Datenerfassung und der Datenanalyse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung visuell evozierte neuronale Reaktionen bei Einzelzellauflösung zeigt, und die Weitfeld-Kalzium-Bildgebung zeigt neuronale Aktivität über das gesamte SC. Durch die Kombination dieser beiden Methoden kann man die neuronale Kodierung im SC auf verschiedenen Skalen aufdecken, und eine solche Kombination kann auch auf andere Hirnregionen angewendet werden.

Einleitung

Der Colliculus superior (SC) ist ein wichtiges Sehzentrum bei allen Wirbeltieren. Bei Säugetieren erhält es direkte Eingaben von der Netzhaut und dem visuellen Kortex¹. Während die optische Aufzeichnung im Kortex 2,3,4,5 weit verbreitet ist, wird ihre Anwendung im SC durch schlechte optische Zugänge behindert 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 <....

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Tierschutzrichtlinien durchgeführt und von der IACUC am Chinesischen Institut für Hirnforschung, Peking, genehmigt.

HINWEIS: Der Zeitplan für dieses Protokoll ist wie folgt: 1) Herstellung des Saugnapfes; 2) das Virus injizieren; 3) Implantieren Sie die Kopfplatte; 4) Implantieren Sie nach 3 Wochen den Pfropfen; 5) Führen Sie nach einer ~3-tägigen Erholung und Gewöhnung auf dem Laufband eine Zwei-Photonen-/Weitfeld-Bildgebung durch.

1. Vorbereitung eines Saugnapfes (Abbildung 1A)

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Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Der kritischste Schritt ist die Kraniotomie in den Schritten 5.2 und 5.3. Erstens ist der Knochen 0,5 mm hinter dem Lambda dick und enthält Blutgefäße im Inneren, die während des Bohrvorgangs zu Blutungen führen können. Es sollte ein geeigneter Gelschaum vorbereitet werden, um die Blutung zu stoppen. Zweitens besteht eine gute Wahrscheinlichkeit für eine Angiorrhexis, wenn der Knochen direkt über der Sinus transversum entfernt wird. Zur Fehlerbehebung besteht ei.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks