Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الدراسة ، نقوم بتفصيل طرق إزالة الخلايا ، والتوصيف الفيزيائي ، والتصوير ، وزرع المواد الحيوية النباتية في الجسم الحي ، بالإضافة إلى طرق بذر الخلايا والتمايز في السقالات. تسمح الطرق الموصوفة بتقييم المواد الحيوية النباتية لتطبيقات هندسة أنسجة العظام.

Abstract

تم استخدام المواد الحيوية السليلوز المشتقة من النباتات في تطبيقات هندسة الأنسجة المختلفة. أظهرت الدراسات في الجسم الحي التوافق الحيوي الرائع للسقالات المصنوعة من السليلوز المشتق من المصادر الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك هذه السقالات خصائص هيكلية ذات صلة بأنسجة متعددة ، وتعزز غزو وتكاثر خلايا الثدييات. أظهرت الأبحاث الحديثة التي تستخدم أنسجة Hypanthium التفاح منزوعة الخلايا تشابه حجم المسام مع حجم العظم التربيقي بالإضافة إلى قدرته على دعم التمايز العظمي بشكل فعال. فحصت الدراسة الحالية كذلك إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح لتطبيقات هندسة أنسجة العظام (BTE) وقيمت خصائصها الميكانيكية في المختبر وفي الجسم الحي . تم زرع بانيات MC3T3-E1 preosteoblasts في سقالات السليلوز المشتقة من التفاح والتي تم تقييمها بعد ذلك لإمكاناتها العظمية وخصائصها الميكانيكية. أكد تلطيخ الفوسفاتيز القلوي و S الأحمر الأليزارين التمايز العظمي في السقالات المستزرعة في وسط التمايز. أظهر الفحص النسيجي غزو الخلايا والتمعدن على نطاق واسع عبر السقالات. كشف المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) عن مجاميع معدنية على سطح السقالات ، وأكد التحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS) وجود عناصر الفوسفات والكالسيوم. ومع ذلك ، على الرغم من الزيادة الكبيرة في معامل يونغ بعد تمايز الخلايا ، إلا أنه ظل أقل من الأنسجة العظمية السليمة. أظهرت الدراسات في الجسم الحي تسلل الخلايا وترسب المصفوفة خارج الخلية داخل السقالات المشتقة من التفاح بعد 8 أسابيع من الزرع في كالفاريا الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، كانت القوة المطلوبة لإزالة السقالات من عيب العظام مماثلة لحمل الكسر المبلغ عنه سابقا لعظم الجلفاري الأصلي. بشكل عام ، تؤكد هذه الدراسة أن السليلوز المشتق من التفاح هو مرشح واعد لتطبيقات BTE. ومع ذلك ، فإن الاختلاف بين خواصه الميكانيكية وخصائص الأنسجة العظمية السليمة قد يحد من تطبيقه على سيناريوهات منخفضة الحمل. قد يكون من الضروري إعادة هندسة هيكلية إضافية وتحسينها لتعزيز الخواص الميكانيكية لسقالات السليلوز المشتقة من التفاح للتطبيقات الحاملة.

Introduction

غالبا ما تتطلب عيوب العظام الكبيرة الناتجة عن إصابة أو مرض ترقيع المواد الحيوية للتجديد الكامل1. تستخدم التقنيات الحالية المصممة لتحسين تجديد أنسجة العظام بانتظام الطعوم الذاتية أو الخيفية أو الغريبة أو الاصطناعية2. بالنسبة لتطعيم العظام الذاتي ، الذي يعتبر ممارسة التطعيم "المعيار الذهبي" لإصلاح عيوب العظام الكبيرة ، يتم استخراج العظام من المريض. ومع ذلك ، فإن إجراء التطعيم هذا له العديد من العيوب ، بما في ذلك قيود الحجم والشكل ، وتوافر الأنسجة ، ومراضة موقع أخذ العينات3. علاوة على ذلك ، فإن إجراءات التطعيم الذاتي عرضة لالتهابات موقع الجراحة ، والكسور اللاحقة ، وتشكيل ورم دموي في موقع أخذ العينات أو إعادة بنائه ، وآلام ما بعد الجراحة4. تقدم هندسة أنسجة العظام (BTE) بديلا محتملا لطرق تطعيم العظام التقليدية5. فهو يجمع بين المواد الحيوية الهيكلية والخلايا لبناء أنسجة عظمية وظيفية جديدة. عند تصميم المواد الحيوية ل BTE ، من الأهمية بمكان الجمع بين بنية كبيرة يسهل اختراقها ، وكيمياء السطح التي تعزز ارتباط الخلية ، والخصائص الميكانيكية التي تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في العظام الأصلية6. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن حجم المسام المثالي ومعامل المرونة للمواد الحيوية المستخدمة في BTE هما حوالي 100-200 ميكرومتر7 و 0.1-20 جيجا باسكال ، على التوالي ، اعتمادا على موقع التطعيم8. إلى جانب ذلك ، فإن المسامية والترابط المسامي للسقالات هي عوامل حاسمة تؤثر على هجرة الخلايا ، وانتشار المغذيات ، وتكوين الأوعية8.

أظهر بنك تونس و التعليم نتائج واعدة مع العديد من المواد الحيوية التي تم تطويرها وتقييمها كخيارات بديلة لترقيع العظام. بعض هذه المواد الحيوية هي مواد حثية عظمية ومواد هجينة وهلاميات مائية متقدمة8. تحفز المواد الاستقرائية العظمية تطوير الهياكل العظمية المشكلة حديثا. تتكون المواد الهجينة من بوليمرات اصطناعية و / أو طبيعية8. تحاكي الهلاميات المائية المتقدمة المصفوفة خارج الخلية (ECM) وهي قادرة على تقديم العوامل النشطة بيولوجيا اللازمة لتعزيز تكامل أنسجة العظام8. هيدروكسيباتيت هو مادة تقليدية وخيار شائع ل BTE بسبب تكوينه وتوافقه الحيوي9. الزجاج النشط بيولوجيا هو نوع آخر من المواد الحيوية ل BTE ، والذي ثبت أنه يحفز استجابات خلايا معينة لتنشيط الجينات اللازمة لتكوين العظم10,11. كما تم استخدام البوليمرات القابلة للتحلل ، بما في ذلك بولي (حمض الجليكوليك) وبولي (حمض اللاكتيك) ، على نطاق واسع في تطبيقات BTE12. أخيرا ، أظهرت البوليمرات الطبيعية أو المشتقة بشكل طبيعي مثل الشيتوزان والكيتين والسليلوز البكتيري نتائج مشجعة ل BTE13. ومع ذلك ، في حين أن كل من البوليمرات الاصطناعية والطبيعية تظهر إمكانات ل BTE ، فإن تطوير سقالة وظيفية مع البنية الكلية المطلوبة يتطلب عادة بروتوكولات واسعة النطاق.

على العكس من ذلك ، يمكن اشتقاق هياكل السليلوز العيانية الأصلية بسهولة من النباتات المتنوعة ، وقد أثبتت مجموعتنا البحثية سابقا قابلية تطبيق السقالات القائمة على السليلوز المشتقة من النباتات على عمليات إعادة بناء الأنسجة المختلفة. في الواقع ، بعد معالجة بسيطة للفاعل بالسطح ، قمنا بتسخير البنية المتأصلة للمادة النباتية ، وتسليط الضوء على إمكاناتها كمادة حيوية متعددة الاستخدامات14. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه السقالات القائمة على السليلوز لتطبيقات زراعة خلايا الثدييات في المختبر 14 ، وهي متوافقة حيويا ، وتدعم الأوعية الدموية العفوية تحت الجلد14،15،16،17. أثبتت كل من مجموعتنا البحثية وغيرها أنه يمكن الحصول على هذه السقالات من نباتات محددة بناء على التطبيق المقصود14،15،16،17،18،19،20. على سبيل المثال ، تظهر البنية الوعائية التي لوحظت في سيقان وأوراق النبات تشابها مذهلا مع التركيب الموجود في الأنسجة الحيوانية19. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشكيل سقالات السليلوز المشتقة من النباتات بسهولة وتعريضها لتعديلات كيميائية حيوية سطحية لتحقيق الخصائص المطلوبة16. في دراسة حديثة ، قمنا بدمج مخزن مؤقت للملح أثناء عملية إزالة الخلايا ، مما أدى إلى تعزيز ارتباط الخلية الذي لوحظ في كل من الإعدادات في المختبر وفي الجسم الحي 16. في نفس الدراسة ، أظهرنا قابلية تطبيق سقالات السليلوز المشتقة من النباتات في المواد الحيوية المركبة عن طريق صب الهلاميات المائية على سطح السقالات. في الدراسات الحديثة ، ثبت أن تشغيل السقالات المشتقة من النباتات يعزز فعاليتها18. على سبيل المثال ، كشفت دراسة أجراها Fontana et al. (2017) أن التصاق الخلايا الليفية الجلدية البشرية كان مدعوما بسيقان منزوعة الخلايا مغلفة ب RGD ، في حين أن السيقان غير المطلية لم تظهر نفس القدرة18. علاوة على ذلك ، أظهر المؤلفون أيضا أنه يمكن استخدام سائل الجسم المحاكي المعدل لتمعدن سيقان النباتات منزوعة الخلايا بشكل مصطنع. في دراسات أحدث ، استكشفنا مفهوم تكوين العظم الحساس ميكانيكيا في سقالات السليلوز المشتقة من النباتات وقيمنا إمكاناتها ل BTE17،20. علاوة على ذلك ، استخدم Lee et al. (2019) سقالات مشتقة من النباتات لزراعة الأنسجة الشبيهة بالعظام في بيئة في المختبر 21. من خلال التقييمات الشاملة للمصادر النباتية المختلفة ، حدد المؤلفون السقالات المشتقة من التفاح باعتبارها الأكثر مثالية لثقافة وتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). علاوة على ذلك ، اقترح المؤلفون أن السمات الهيكلية والميكانيكية للسقالات المشتقة من التفاح تلعب دورا محوريا في ملاءمتها للغرض المقصود. نظرا لكونها السقالات الأولية المشتقة من النباتات التي تم تنفيذها في تطبيقات هندسة الأنسجة ، فقد ثبت على نطاق واسع أن السقالات المشتقة من التفاح تمتلك بنية مشابهة بشكل لافت للنظر لتلك الموجودة في العظام البشرية ، لا سيما من حيث مسامها المترابطة التي يتراوح قطرها من 100 إلى 200 ميكرومتر14,21.

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق بشكل أكبر في إمكانات سقالات السليلوز المشتقة من التفاح ل BTE وأجرينا تحليلا لخصائصها الميكانيكية في كل من المختبر والجسم الحي. على الرغم من وجود دراسات حول إمكانات السقالات المشتقة من التفاح ل BTE17،20،21 ، إلا أن خصائصها الميكانيكية لم يتم التحقيق فيها بشكل كاف. أظهرت النتائج غزو الانتشار البري والتمايز العظمي لبانيات MC3T3-E1 preosteoblasts المصنفة في سقالات تم استزراعها في وسط التمايز لمدة 4 أسابيع. كان معامل يونغ لهذه السقالات 192.0 ± 16.6 كيلو باسكال ، وهو أعلى بكثير من تلك الموجودة في السقالات الفارغة (سقالات بدون خلايا مصنفة) (31.6 ± 4.8 كيلو باسكال) والسقالات المصنفة بالخلايا المستزرعة في وسط غير متمايز (24.1 ± 8.8 كيلو باسكال). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن معامل يونغ للأنسجة العظمية البشرية السليمة يقع عادة في نطاق 0.1-2 GPa للعظام التربيقية وحوالي 15-20 GPa للعظام القشرية8. ومع ذلك ، بعد زرع لمدة 8 أسابيع في عيب كالفاري القوارض ، بدا أن السقالات المصنفة بالخلايا مدمجة جيدا في العظام المحيطة ، كما يتضح من متوسط قوة الذروة البالغة 113.6 نيوتن ± 18.2 نيوتن في اختبارات الدفع ، وهو مشابه لحمل الكسر المبلغ عنه سابقا لعظم الجلفاري الأصلي22. بشكل عام ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة وعدا كبيرا ، خاصة بالنسبة للتطبيقات غير الحاملة. ومع ذلك ، لا تمتلك سقالات السليلوز المشتقة من التفاح حاليا الخصائص الميكانيكية اللازمة لمطابقة الأنسجة العظمية المحيطة بدقة في موقع الزرع. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من التطوير لإطلاق العنان للإمكانات الكاملة لهذه السقالات.

Protocol

تمت مراجعة البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية بجامعة أوتاوا.

1. إعداد سقالة

  1. استخدم قطاعة المندولين لتقطيع تفاح ماكنتوش (كندا فانسي) إلى شرائح بسمك 8 مم. قطع أنسجة hypanthium من شرائح التفاح إلى مربعات 5 مم × 5 مم.
  2. ضع العينات المربعة في 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لمدة يومين.
  3. اغسل العينات منزوعة الخلايا بالماء منزوع الأيونات واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT) في 100 mM CaCl2 لإزالة الفاعل بالسطح المتبقي.
  4. تعقيم العينات (أي السقالات) في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، وغسلها بالماء منزوع الأيونات ، ووضعها في طبق استزراع 24 بئرا قبل بذر الخلايا.

2. زراعة الخلايا وبذر السقالة

  1. الحفاظ على MC3T3-E1 Subclone 4 خلايا في أطباق معالجة بزراعة الخلايا بقطر 10 سم في ظروف زراعة الخلايا (37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2).
  2. تحضير وسط زراعة الخلايا المصنوع من الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر - تعديل ألفا (α-MEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
  3. فصل الخلايا عن أطباق الاستزراع عن طريق التربسين (0.05٪ تربسين-EDTA) بمجرد وصولها إلى التقاء 80٪.
  4. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند c.a. 200 × g لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في α-MEM عند 2.5 × 107 خلايا لكل مل.
  5. ماصة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على سطح السقالات ، والسماح للخلايا الالتصاق لمدة 1 ساعة في ظروف زراعة الخلايا. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر استزراع في لوحة الاستزراع.
  6. قم بتجديد وسط الثقافة كل 2-3 أيام لمدة 14 يوما.
  7. قم بإعداد وسط تمايز بإضافة 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 4 مللي مول من فوسفات الصوديوم إلى وسط زراعة الخلايا الموصوف سابقا.
  8. تحفيز تمايز خلايا MC3T3-E1 عن طريق احتضان السقالات في وسط التمايز لمدة 4 أسابيع. تجديد الوسيط كل 3-4 أيام. في موازاة ذلك ، احتضان السقالات في وسط ثقافة غير متمايز (أي وسط بدون مكملات للحث على التمايز) لنفس المدة ، مع نفس جدول التغيير المتوسط ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.

3. قياسات حجم المسام باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر

  1. اغسل السقالات المشتقة من التفاح منزوع الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. احتضان السقالات في 1 مل من 10٪ (v / v) صبغة بيضاء من الكالكوفلور لمدة 25 دقيقة في الظلام في RT.
  3. اغسل السقالات (ن = 3) باستخدام PBS وقم بتصوير ثلاث مناطق تم اختيارها عشوائيا لكل سقالة باستخدام مجهر مسح ليزر رنين عالي السرعة (CLSM) بتكبير 10x ، باستخدام قناة DAPI ، على النحو التالي:
    1. تكوين مرشح انبعاث الليزر: 405 نانومتر (ليزر) ؛ 425-475 نانومتر (انبعاثات)
    2. اضبط طاقة الليزر والكاشف يدويا لضمان الحصول على الصورة الأمثل. احصل على مجموعة z من 20 صورة بحجم خطوة 5 ميكرومتر.
  4. باستخدام برنامج ImageJ ، قم بمعالجة وتحليل الصور متحدة البؤر على النحو التالي:
    1. استخدم وظيفة Z-Project إلى أقصى كثافة لإنشاء صورة ، وقم بتطبيق وظيفة البحث عن الحواف لإبراز حافة المسام.
    2. تتبع المسام يدويا باستخدام أداة التحديد الحر .
    3. تناسب كل مسام كقطع ناقص ، وقم بقياس طول المحور الرئيسي ، وقم بتجميع جميع القياسات (ما مجموعه 54 في الدراسة الحالية - 6 في 3 مناطق مختارة عشوائيا لكل سقالة) ، واحسب متوسط الطول.

4. تحليل توزيع الخلايا باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر

  1. اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثبت السقالات بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق.
  2. اغسل كل سقالة جيدا بالماء منزوع الأيونات ، وتخلل الخلايا بمحلول Triton-X 100 لمدة 5 دقائق ، واغسلها مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان السقالات في 1 مل من حمض دوري 1٪ لمدة 40 دقيقة واشطفها بالماء منزوع الأيونات14,16.
  4. احتضان السقالات في 1 مل من محلول يحتوي على 100 mM ميتابيسلفيت الصوديوم و 0.15 M حمض الهيدروكلوريك ، مع استكمال 100 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم. اغمر السقالات تماما في المحلول.
  5. اغسل السقالات باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتلطيخ نوى الخلية عن طريق احتضان السقالات في محلول DAPI سعة 5 مجم / مل لمدة 10 دقائق في الظلام. اغسل جيدا مرة أخرى وقم بتخزين السقالات في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
  6. تخيل ثلاثة أسطح مختارة عشوائيا لثلاث سقالات مختلفة مصنفة بالخلايا مع CLSM رنين عالي السرعة عند تكبير 10x ، باستخدام قنوات DAPI و TRITC ، على النحو التالي:
    1. تكوين مرشح انبعاث الليزر:
      DAPI: الليزر: 405 نانومتر. الانبعاثات: 425-475 نانومتر
      TRITC: الليزر: 561 نانومتر. الانبعاثات: 570-620 نانومتر
    2. اضبط طاقة الليزر والكاشف يدويا لضمان الحصول على الصورة الأمثل. احصل على مجموعة z من 20 صورة بحجم خطوة 5 ميكرومتر.
  7. استخدم برنامج ImageJ لمعالجة الصور متحدة البؤر وإنشاء أقصى إسقاط في المحور z لتحليل الصور باستخدام وظيفة Z-Project to Maximum Intensity .

5. تحليل الفوسفاتيز القلوي

  1. اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثبت السقالات بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. إصلاح السقالات الفارغة (السقالات بدون خلايا مصنفة) لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
  2. تحضير محلول تلطيخ 5-برومو-4-كلورو-3'-إندوليفوسفات ونيترو-بلو تيترازوليوم (BCIP/NBT) عن طريق إذابة قرص واحد من BCIP/NBT في 10 مل من الماء منزوع الأيونات.
  3. اغسل السقالات الثابتة بمحلول توين 0.05٪ وصمة عار بمحلول BCIP / NBT لمدة 20 دقيقة في RT. اغسل السقالات الملطخة بمحلول توين 0.05٪ وقم بتخزينها في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
  4. تخيل السقالات الملطخة بكاميرا رقمية بدقة 12 ميجابكسل.

6. تحليل ترسب الكالسيوم

  1. اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثبت السقالات بالفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. إصلاح السقالات الفارغة (السقالات بدون خلايا مصنفة) لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
  2. قم بإعداد محلول تلطيخ 2٪ (وزن / حجم) أحمر أليزارين (ARS).
  3. اغسل السقالات الثابتة بالماء منزوع الأيونات وقم بتلطيخها بمحلول ARS لمدة 1 ساعة في RT. اغسل السقالات الملطخة بالماء منزوع الأيونات وقم بتخزينها في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
  4. تخيل السقالات الملطخة بكاميرا رقمية بدقة 12 ميجابكسل.

7. تحليل التمعدن

  1. اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. إصلاح السقالات مع 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة. إصلاح السقالات الفارغة (السقالات بدون خلايا مصنفة) لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
  2. تجفيف العينات في المحاليل التي تحتوي على تركيزات من الإيثانول تزيد من 50٪ إلى 100٪ ، كما هو موضح سابقا23.
  3. إجراء المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والتحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS) لتحليل المجاميع المعدنية على النحو التالي:
    1. جفف العينات باستخدام مجفف النقطة الحرجة ، باتباع بروتوكولالشركة المصنعة 24.
    2. ضع طبقة ذهبية 5 نانومتر على السقالات باستخدام طلاء رش الذهب ، وفقا لبروتوكولالشركة المصنعة 25.
    3. تخيل سطح السقالات باستخدام مجهر إلكتروني ماسح مضبوط على 3 كيلو فولت ، عند تكبير 85x.
    4. قم بإجراء EDS عن طريق ضبط المجهر الإلكتروني الماسح على 15 كيلو فولت. في ثلاث مناطق تم اختيارها عشوائيا لكل سقالة ، احصل على أطياف EDS لتحليل تكوين الركام المعدني.

8. قياسات معامل يونغ

  1. قم بإزالة السقالات المصنفة بالخلايا من وسط الحضانة الخاص بها واختبر العينات على الفور.
  2. باستخدام جهاز ضغط أحادي المحور مصمم خصيصا ومجهز بخلية تحميل 1.5 نيوتن ، قم بضغط السقالات (n = 3 لكل حالة) بمعدل ثابت يبلغ 3 مم · min-1 إلى أقصى إجهاد ضاغط بنسبة 10٪ من ارتفاع السقالة.
  3. أوجد معامل يونغ من ميل الجزء الخطي من منحنيات إجهاد الانفعال. في الدراسة الحالية ، تم تحديد المعامل بين سلالة 9٪ و 10٪.

9. تسلل الخلايا وتحليل التمعدن عن طريق الأنسجة: سقالات في المختبر

  1. اغسل السقالات المصنفة بالخلايا المزروعة في وسط عدم التمايز أو التمايز ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
  2. ثبت السقالات المصنفة بالخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة قبل إعادة التعليق في 70٪ من الإيثانول للتخزين.
  3. علم الأنسجة:
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء التحضير النسيجي بأكمله (التضمين والتقسيم والتلطيخ) الموصوف في الخطوات التالية بواسطة مرفق لويز بيليتييه الأساسي للأنسجة (جامعة أوتاوا).
    1. بعد الجفاف والتضمين في البارافين ، قم بتقطيع العينات إلى أقسام تسلسلية بسمك 5 ميكرومتر ، بدءا من 1 مم داخل السقالات ، وقم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر.
    2. تلطيخ المقاطع ببقع الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) أو فون كوسا (VK).
    3. تخيل المقاطع باستخدام مجهر ماسح الشرائح عند تكبير 40x (n = 1 سقالة في وسط عدم التمايز و n = 2 سقالات في وسط التمايز في الدراسة الحالية).
    4. باستخدام برنامج ImageJ ، قم بتقييم تسلل الخلايا بصريا (تلطيخ H&E) والتمعدن (تلطيخ VK).

10. نموذج عيب الفئران calvarial

  1. احصل على مراجعة البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية المحلية.
  2. قم بإعداد سقالات دائرية (قطرها 5 مم وسمك 1 مم) باتباع القسم 1 الموضح أعلاه واستخدام لكمة خزعة 5 مم.
  3. إجراء حج القحف الثنائي باتباع البروتوكولالمعمول به 26 ، على النحو التالي:
    1. تخدير ذكور الفئران Sprague-Dawley باستخدام isoflurane ، أولا بنسبة 3٪ حتى تصبح فاقدة للوعي ، ثم بنسبة 2-3٪ طوال العملية.
    2. كشف السمحاق والجمجمة عن طريق قطع الجلد المغطي باستخدام شفرة مشرط. إزالة السمحاق.
    3. قم بإنشاء عيوب ثنائية في كل من العظام الجدارية على كل جانب من الخيط السهمي باستخدام مثقاب أسنان مجهز بتريفين بقطر 5 مم تحت ري مستمر بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
    4. نظف العظام المحيطة باستخدام 0.9٪ كلوريد الصوديوم لإزالة أي شظايا عظمية.
    5. ضع السقالات الدائرية منزوعة الخلايا في العيوب.
    6. أغلق الجلد المغطي بخيوط 4-0.
  4. امنح الفئران وصولا غير محدود إلى الطعام والماء وراقبها يوميا.
  5. بعد 8 أسابيع بعد الزرع ، القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO2 وانثقاب الصدر كإجراء ثانوي للقتل الرحيم.
  6. لكشف الجمجمة واستعادة الغرسات ، قم بإزالة الجلد الذي يغطي الجمجمة باستخدام شفرة مشرط.
  7. قطع الجمجمة في العظام الأمامية والقذالية وعلى جانب كل من العظام الجدارية باستخدام مثقاب الأسنان لإزالة الجزء العلوي من الجمجمة تماما.

11. اختبار الدفع للخارج

  1. قم بتوصيل جهاز ضغط أحادي المحور (مع خلية تحميل 445 نيوتن) بوحدة الحصول على بيانات USB.
  2. قم بتوصيل وحدة الحصول على البيانات بجهاز كمبيوتر مزود بتطبيق برنامج الحصول على البيانات.
  3. مباشرة بعد استخراج الجمجمة ، ضع كل عينة (ن = 7 غرسات من 4 في الدراسة الحالية) على حامل العينة لجهاز الضغط أحادي المحور بحيث يكون الجانب الظهري من العظم متجها لأعلى.
  4. اخفض المكبس بمعدل 0.5 مم / دقيقة حتى تلمس الغرسة المستخرجة قليلا.
  5. ابدأ الاختبار عن طريق خفض المكبس من خلال الغرسة حتى الدفع الكامل للخارج أثناء تطبيق الضغط بسرعة ثابتة تبلغ 0.5 مم / دقيقة باستخدام برنامج الحصول على البيانات.
  6. سجل قوة الذروة على منحنى القوة مقابل الإزاحة باستخدام برنامج الحصول على البيانات.

12. تسلل الخلايا وتحليل التمعدن بواسطة الأنسجة: سقالات في الجسم الحي

  1. ثبت الكالفاريا المستخرجة والغرسات في 10٪ فورمالين محايد مخزن لمدة 72 ساعة قبل إعادة التعليق في 70٪ إيثانول للتخزين.
  2. علم الأنسجة:
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء جميع الاستعدادات النسيجية (التضمين والتقسيم والتلطيخ) الموصوفة في الخطوات التالية بواسطة Accel Labs (مونتريال ، كيو سي ، كندا).
    1. قطع العينات (المضمنة في ميثيل ميثاكريلات) إلى أقسام بسمك 6 ميكرومتر على ثلاثة مستويات مختلفة (أعلى وأسفل ونحو المركز) وقم بتركيبها على شرائح مجهرية.
    2. قم بتلطيخ الأقسام إما باستخدام H&E أو ثلاثية الألوان من Masson-Goldner (MGT).
  3. تخيل الأقسام باستخدام مجهر ماسح الشرائح عند تكبير 40x (4 نباتات من 2 في الدراسة الحالية).
  4. باستخدام برنامج ImageJ ، قم بتقييم تسلل الخلايا بصريا (تلطيخ H&E) وترسب الكولاجين (تلطيخ MGT).

النتائج

قياس حجم المسام وتوزيع الخلايا والتمعدن في المختبر (الشكل 1 والشكل 2)
تم تحقيق الإزالة الكاملة للمكونات الخلوية الأصلية لسقالات أنسجة التفاح بعد معالجة السقالات باستخدام SDS و CaCl2 (الشكل 1 أ). أظهرت السقالات بنية مسامية لل...

Discussion

أظهرت العديد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي التوافق الحيوي للسليلوز المشتق من النبات واستخدامه المحتمل في هندسة الأنسجة14،15،16،18،19،20 ، وبشكل أكثر تحديدا لاستضافة ...

Disclosures

بيان تضارب المصالح: M.L.L، M.T. R.J.H.، C.M.C.، I.C. و A.P. هم مخترعون في طلبات براءات الاختراع المقدمة من جامعة أوتاوا وشركة Spiderwort Inc. فيما يتعلق باستخدام السليلوز المشتق من النباتات لتطبيقات BTE. M.L.L. ، R.J.H. ، C.M.C. ، و AP لديهم مصالح مالية في Spiderwort Inc.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (منحة الاكتشاف) ومؤسسة لي كا شينغ. تلقى MLL الدعم من برنامج TalentEdge لمراكز التميز في أونتاريو ، وتم دعم RJH من خلال منحة NSERC للدراسات العليا ومنحة أونتاريو للدراسات العليا (OGS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4′,6-diamidino-2-phenylindoleThermoFisherD1306DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazoliumSigma-AldrichB5655BCIP/NBT
Alizarin red SSigma-AldrichA5533ARS
Ascorbic acidSigma-AldrichA4403Cell Culture
Calcium ChlorideThermoFisherAA12316CaCl2
Calcofluor WhiteSigma-Aldrich18909
Dental drillSurgical tool
EthanolThermoFisher615095000
Fetal bovine serumHyclone LaboratoriesSH30396FBS
FormalinSigma-AldrichHT50112810% Formalin
Goldner's trichrome stainSigma-Aldrich1.00485GTC
Hematoxylin and eosin stainFisher ScientificNC1470670H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscopeNikonNikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Irrigation salineBaxterJF71230.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cellsATCCCRL-2593Pre-osteoblast cells
McIntosh applesCanada Fancy grade
Methyl methacrylateSigma-AldrichM55909Histological embedding
Minimum Essential MediumThermoFisherM0894α-MEM
ParaformaldehydeFisher ScientificO40424%; PFA
Penicillin/StreptomycinHyclone LaboratoriesSV30010Cell Culture
Periodic acidSigma-Aldrich375810
Phosphate buffered salineHyclone Laboratories2810305PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodideInvitrogenp3566
Scanning electron microscopeJEOLJSM-7500F FESEMSEM and EDS
Slide scanner microscopeZeissAXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166SDS
Sodium metabisulphiteSigma-Aldrich31448
Sodium phosphateThermoFisherBP329
Sprague-Dawley ratsCharles-River Laboratories400Male
SuturesEthiconJ494G4-0
TrephineACE Surgical Supply Co583-01825-mm diameter
Triton-X 100ThermoFisher807423
TrypsinHyclone LaboratoriesSH30236.02Cell Culture
TweenFisher ScientificBP337
Universal compression DeviceCellScaleUniVert
Von Kossa stainSigma-Aldrich1.00362Histology

References

  1. Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
  2. Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
  3. Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
  4. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  5. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
  7. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
  8. Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
  9. Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
  10. Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
  11. Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
  12. Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
  13. Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
  14. Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
  15. Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  16. Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
  17. Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
  18. Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
  19. Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  20. Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
  21. Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
  22. Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
  23. Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
  24. . . tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , (2022).
  25. . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
  26. Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
  27. Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
  28. Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
  29. Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
  30. Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
  31. Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
  32. Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved