用于体外和体内骨组织工程的脱细胞苹果衍生支架

摘要

在这项研究中，我们详细介绍了植物基生物材料的脱细胞、物理表征、成像和 体内 植入方法，以及支架中细胞接种和分化的方法。所描述的方法允许评估用于骨组织工程应用的植物基生物材料。

摘要

植物来源的纤维素生物材料已被用于各种组织工程应用。 体内 研究表明，由天然来源的纤维素制成的支架具有显着的生物相容性。此外，这些支架具有与多种组织相关的结构特征，它们促进哺乳动物细胞的侵袭和增殖。最近使用脱细胞苹果蒺菌组织的研究表明，其孔径与小梁骨的孔径相似，并且能够有效支持成骨分化。本研究进一步研究了苹果衍生纤维素支架在骨组织工程（BTE）应用中的潜力，并评估了其 体外 和 体内 力学性能。将 MC3T3-E1 成骨前细胞接种在苹果来源的纤维素支架中，然后评估其成骨潜力和机械性能。碱性磷酸酶和茜素红 S 染色证实了在分化培养基中培养的支架的成骨分化。组织学检查显示整个支架上有广泛的细胞侵袭和矿化。扫描电子显微镜（SEM）显示支架表面有矿物聚集体，能量色散光谱（EDS）证实了磷酸盐和钙元素的存在。然而，尽管细胞分化后杨氏模量显着增加，但仍低于健康骨组织。 体内 研究表明，在大鼠颅骨中植入 8 周后， 脱细胞的苹果衍生支架内的细胞浸润和细胞外基质的沉积。此外，从骨缺损中移除支架所需的力与先前报道的自体颅骨骨折负荷相似。总体而言，这项研究证实了苹果衍生的纤维素是BTE应用的有前途的候选者。然而，其机械性能与健康骨组织之间的差异可能会限制其在低承重情况下的应用。可能需要进行额外的结构重新设计和优化，以增强用于承重应用的苹果衍生纤维素支架的机械性能。

引言

由损伤或疾病引起的大骨缺损通常需要生物材料移植物才能完全再生¹.目前旨在改善骨组织再生的技术通常使用自体、同种异体、异种或合成移植物²。对于自体骨移植，被认为是修复大骨缺损的“金标准”移植实践，从患者身上提取骨骼。然而，这种移植手术有几个缺点，包括大小和形状限制、组织可用性和采样部位发病率³。此外，自体移植手术容易受到手术部位感染、随后的骨折、取样或重建部位血肿形成以及术后疼痛的影响⁴.骨组织工程 （BTE） 为传统骨移植方法提供了一种潜在的替代方案⁵.它结合了结构性生物材料和细胞来构建新的功能性骨组织。在设计用于 BTE 的生物材料时，将大孔结构、促进细胞附着的表面化学以及与天然骨非常相似的机械性能相结合至关重要⁶.过去的研究表明，BTE 中使用的生物材料的理想孔径和弹性模量分别约为 100-200 μm⁷ 和 0.1-20 GPa，具体取决于接枝位点⁸。此外，支架的孔隙度和孔隙互连性是影响细胞迁移、营养扩散和血管生成的关键因素⁸。

BTE在开发和评....

研究方案

实验方案由渥太华大学动物护理委员会审查和批准。

1. 支架准备

1. 使用曼陀林切片机将麦金托什苹果（Canada Fancy）切成 8 毫米厚的薄片。将苹果片的 hypanthium 组织切成 5 毫米 x 5 毫米的正方形。
2. 将方形样品置于 0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 中 2 天。
3. 用去离子水洗涤脱细胞样品，并在室温 （RT） 下在 100 mM CaCl₂ 中孵育过夜以除去剩余的表面活性剂。
4. 在70%乙醇中对样品（即支架）灭菌30分钟，用去离子水洗涤，并在细胞接种前将其置于24孔培养板中。

2. 细胞培养和支架接种

1. 在细胞培养条件下（在95%空气和5%CO₂的湿化气氛中为37°C），在直径为10cm的细胞培养处理的培养皿中维持MC3T3-E1亚克隆4细胞。
2. 制备由 Eagle 最低必需培养基 - α 修饰 （α-MEM） 制成的细胞培养基，并补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素。
3. 一旦细胞达到80%汇合度，通过胰蛋白酶消化（0.05%胰蛋白酶-EDTA）将细胞从培养皿中分离出来。
4. 将细胞悬液以约200× <....

讨论

几项体外和体内研究已经证明了植物来源纤维素的生物相容性及其在组织工程中的潜在用途 14,15,16,18,19,20，更具体地说是用于宿主成骨分化 ^20,21.本研究的目的是进一步研究苹果衍生的纤维素.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology