骨組織工学のための脱細胞化リンゴ由来の足場( In Vitro および In Vivo)

要約

本研究では、植物由来の生体材料の脱細胞化、物性評価、イメージング、 in vivo 移植の方法、および足場における細胞の播種と分化の方法について詳しく説明します。記載された方法は、骨組織工学的応用のための植物ベースの生体材料の評価を可能にする。

要約

植物由来のセルロース生体材料は、さまざまな組織工学用途に採用されています。 In vivo 研究では、天然由来のセルロースで作られた足場の驚くべき生体適合性が示されています。さらに、これらの足場は複数の組織に関連する構造的特徴を有しており、哺乳類細胞の侵入と増殖を促進します。脱細胞化リンゴのヒパンチウム組織を用いた最近の研究では、その細孔径が海綿骨の孔径と類似していること、および骨形成の分化を効果的にサポートする能力が実証されています。本研究では、骨組織工学(BTE)用途におけるリンゴ由来のセルロース足場の可能性をさらに検討し、in vitro および in vivo の機械的特性を評価しました。MC3T3-E1骨芽細胞をリンゴ由来のセルロース足場に播種し、骨形成能と機械的特性を評価しました。アルカリホスファターゼおよびアリザリンレッドS染色により、分化培地で培養した足場における骨形成分化が確認されました。組織学的検査では、足場全体に広範囲にわたる細胞浸潤と石灰化が示されました。走査型電子顕微鏡(SEM)により、足場の表面に鉱物凝集体が発見され、エネルギー分散型分光法(EDS)により、リン酸塩とカルシウム元素の存在が確認されました。しかし、細胞分化後のヤング率の有意な増加にもかかわらず、健康な骨組織よりも低いままでした。 In vivo 研究では、ラットの頭蓋骨に8週間移植した後、 脱細胞化リンゴ由来の足場内に細胞浸潤と細胞外マトリックスが沈着することが示されました。さらに、骨欠損部から足場を取り外すのに必要な力は、以前に報告された天然の頭蓋骨の骨折荷重と同様でした。全体として、この研究は、リンゴ由来のセルロースがBTEアプリケーションの有望な候補であることが確認されています。ただし、その機械的特性と健康な骨組織の機械的特性の相違により、低耐荷重シナリオへの適用が制限される可能性があります。耐荷重用途のリンゴ由来のセルロース足場の機械的特性を強化するために、追加の構造の再設計と最適化が必要になる場合があります。

概要

怪我や病気によって引き起こされる大きな骨欠損は、^{完全な再生のために}生体材料移植片を必要とすることがよくあります1。骨組織の再生を改善するために設計された現在の技術では、自家移植片、同種移植片、異種移植片、または合成移植片が定期的に^{使用されています2。}自家骨移植は、大きな骨欠損を修復するための「ゴールドスタンダード」移植方法と見なされており、患者から骨を抽出します。ただし、この移植手順には、サイズと形状の制限、組織の可用性、サンプリング部位の罹^患率など、いくつかの欠点があります3。さらに、自家移植手術は、手術部位の感染、その後の骨折、サンプリング部位または再建部位での血腫形成、および術^{後の痛みの影響を受け}やすい4。骨組織工学(BTE)は、従来の骨^{移植方法に代わる}潜在的な方法を提供します5。構造的な生体材料と細胞を組み合わせて、新しい機能的な骨組織を構築します。BTE用の生体材料を設計する際には、マクロ多孔質構造、細胞接着を促進する表面化学、および天然の骨によく似た機械的特性を組み合わせることが重要です⁶。これまでの研究から、BTEに利用される生体材料の理想的な細孔径と弾性率は、グラフ^ト部位にもよるが、そ....

プロトコル

実験プロトコルは、オタワ大学動物管理委員会によってレビューされ、承認されました。

1.足場の準備

1. マンドリンスライサーを使用して、マッキントッシュのりんご(カナダファンシー)を厚さ8mmのスライスに切ります。リンゴのスライスのヒパンチウム組織を5mmx5mmの正方形に切ります。
2. 正方形のサンプルを0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に2日間入れます。
3. 脱細胞化サンプルを脱イオン水で洗浄し、100 mM CaCl₂中で室温(RT)で一晩インキュベートして、残りの界面活性剤を除去します。
4. サンプル(足場など)を70%エタノールで30分間滅菌し、脱イオン水で洗浄し、細胞播種前に24ウェル培養プレートに入れます。

2. 細胞培養と足場播種

1. MC3T3-E1サブクローン4細胞を直径10cmの細胞培養処理ディッシュに入れ、細胞培養条件(37°C、空気95%、_CO25%5%の加湿雰囲気)で維持します。
2. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したEagleの最低限の必須培地であるアルファ修飾(α-MEM)で作られた細胞培養培地を調製します。

ディスカッション

いくつかのin vitroおよびin vivo研究は、植物由来のセルロースの生体適合性と、組織工学におけるその潜在的な使用を実証しています14,15,16,18,19,20、より具体的には骨形成分化をホストするために^20,21

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology