Scaffold decellularizzati derivati da mele per l'ingegneria del tessuto osseo in vitro e in vivo

Riepilogo

In questo studio, descriviamo in dettaglio i metodi di decellularizzazione, caratterizzazione fisica, imaging e impianto in vivo di biomateriali a base vegetale, nonché metodi per la semina e la differenziazione cellulare negli scaffold. I metodi descritti consentono la valutazione di biomateriali di origine vegetale per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo.

Abstract

I biomateriali di cellulosa di origine vegetale sono stati impiegati in varie applicazioni di ingegneria tissutale. Studi in vivo hanno dimostrato la notevole biocompatibilità di scaffold realizzati in cellulosa derivata da fonti naturali. Inoltre, questi scaffold possiedono caratteristiche strutturali rilevanti per più tessuti e promuovono l'invasione e la proliferazione delle cellule dei mammiferi. Recenti ricerche che utilizzano tessuto di ipanzio di mela decellularizzato hanno dimostrato la somiglianza della dimensione dei suoi pori con quella dell'osso trabecolare, nonché la sua capacità di supportare efficacemente la differenziazione osteogenica. Il presente studio ha ulteriormente esaminato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo (BTE) e ha valutato le loro proprietà meccaniche in vitro e in vivo . I preosteoblasti MC3T3-E1 sono stati seminati in scaffold di cellulosa derivati da mele che sono stati poi valutati per il loro potenziale osteogenico e le proprietà meccaniche. La colorazione con fosfatasi alcalina e rosso alizarina S ha confermato la differenziazione osteogenica in scaffold coltivati in terreno di differenziamento. L'esame istologico ha dimostrato un'invasione cellulare diffusa e una mineralizzazione attraverso gli scaffold. La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha rivelato aggregati minerali sulla superficie degli scaffold e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) ha confermato la presenza di elementi fosfato e calcio. Tuttavia, nonostante un aumento significativo del modulo di Young in seguito alla differenziazione cellulare, è rimasto inferiore a quello del tessuto osseo sano. Studi in vivo hanno mostrato l'infiltrazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare all'interno degli scaffold derivati da mele decellularizzate dopo 8 settimane di impianto nella calvaria di ratto. Inoltre, la forza richiesta per rimuovere le impalcature dal difetto osseo era simile al carico di frattura precedentemente riportato dell'osso calvario nativo. Nel complesso, questo studio conferma che la cellulosa derivata dalla mela è un candidato promettente per le applicazioni BTE. Tuttavia, la dissomiglianza tra le sue proprietà meccaniche e quelle del tessuto osseo sano può limitarne l'applicazione a scenari a basso carico. Potrebbero essere necessarie ulteriori reingegnerizzazioni e ottimizzazioni strutturali per migliorare le proprietà meccaniche degli scaffold in cellulosa derivati dal melo per applicazioni portanti.

Introduzione

I difetti ossei di grandi dimensioni causati da una lesione o da una malattia spesso richiedono innesti di biomateriali per una rigenerazione completa¹. Le attuali tecniche progettate per migliorare la rigenerazione del tessuto osseo utilizzano regolarmente innesti autologhi, allogenici, xenogenici o sintetici². Per l'innesto osseo autologo, considerato la pratica di innesto "gold standard" per riparare grandi difetti ossei, l'osso viene estratto dal paziente. Tuttavia, questa procedura di innesto presenta diversi inconvenienti, tra cui limitazioni di dimensioni e forma, disponibilità di tessuti e morbilità del sito di c....

Protocollo

I protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Ottawa.

1. Preparazione dell'impalcatura

1. Usa un'affettatrice a mandolina per tagliare le mele McIntosh (Canada Fancy) a fette spesse 8 mm. Tagliare il tessuto di ipanzio delle fette di mela in quadrati di 5 mm x 5 mm.
2. Mettere i campioni quadrati in sodio dodecilsolfato (SDS) allo 0,1% per 2 giorni.
3. Lavare i campioni decellularizzati con acqua deionizzata e incubarli per una notte a temperatura ambiente (RT) in 100 mM CaCl₂ per rimuovere il tensioattivo rimanente.
....

Discussione

Diversi studi in vitro e in vivo hanno dimostrato la biocompatibilità della cellulosa di origine vegetale e il suo potenziale utilizzo nell'ingegneria tissutale 14,15,16,18,19,20, più specificamente per ospitare la differenziazione osteogenica^20,21

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology