Scaffold decellularizzati derivati da mele per l'ingegneria del tessuto osseo in vitro e in vivo

Riepilogo

In questo studio, descriviamo in dettaglio i metodi di decellularizzazione, caratterizzazione fisica, imaging e impianto in vivo di biomateriali a base vegetale, nonché metodi per la semina e la differenziazione cellulare negli scaffold. I metodi descritti consentono la valutazione di biomateriali di origine vegetale per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo.

Abstract

I biomateriali di cellulosa di origine vegetale sono stati impiegati in varie applicazioni di ingegneria tissutale. Studi in vivo hanno dimostrato la notevole biocompatibilità di scaffold realizzati in cellulosa derivata da fonti naturali. Inoltre, questi scaffold possiedono caratteristiche strutturali rilevanti per più tessuti e promuovono l'invasione e la proliferazione delle cellule dei mammiferi. Recenti ricerche che utilizzano tessuto di ipanzio di mela decellularizzato hanno dimostrato la somiglianza della dimensione dei suoi pori con quella dell'osso trabecolare, nonché la sua capacità di supportare efficacemente la differenziazione osteogenica. Il presente studio ha ulteriormente esaminato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo (BTE) e ha valutato le loro proprietà meccaniche in vitro e in vivo . I preosteoblasti MC3T3-E1 sono stati seminati in scaffold di cellulosa derivati da mele che sono stati poi valutati per il loro potenziale osteogenico e le proprietà meccaniche. La colorazione con fosfatasi alcalina e rosso alizarina S ha confermato la differenziazione osteogenica in scaffold coltivati in terreno di differenziamento. L'esame istologico ha dimostrato un'invasione cellulare diffusa e una mineralizzazione attraverso gli scaffold. La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha rivelato aggregati minerali sulla superficie degli scaffold e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) ha confermato la presenza di elementi fosfato e calcio. Tuttavia, nonostante un aumento significativo del modulo di Young in seguito alla differenziazione cellulare, è rimasto inferiore a quello del tessuto osseo sano. Studi in vivo hanno mostrato l'infiltrazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare all'interno degli scaffold derivati da mele decellularizzate dopo 8 settimane di impianto nella calvaria di ratto. Inoltre, la forza richiesta per rimuovere le impalcature dal difetto osseo era simile al carico di frattura precedentemente riportato dell'osso calvario nativo. Nel complesso, questo studio conferma che la cellulosa derivata dalla mela è un candidato promettente per le applicazioni BTE. Tuttavia, la dissomiglianza tra le sue proprietà meccaniche e quelle del tessuto osseo sano può limitarne l'applicazione a scenari a basso carico. Potrebbero essere necessarie ulteriori reingegnerizzazioni e ottimizzazioni strutturali per migliorare le proprietà meccaniche degli scaffold in cellulosa derivati dal melo per applicazioni portanti.

Introduzione

I difetti ossei di grandi dimensioni causati da una lesione o da una malattia spesso richiedono innesti di biomateriali per una rigenerazione completa¹. Le attuali tecniche progettate per migliorare la rigenerazione del tessuto osseo utilizzano regolarmente innesti autologhi, allogenici, xenogenici o sintetici². Per l'innesto osseo autologo, considerato la pratica di innesto "gold standard" per riparare grandi difetti ossei, l'osso viene estratto dal paziente. Tuttavia, questa procedura di innesto presenta diversi inconvenienti, tra cui limitazioni di dimensioni e forma, disponibilità di tessuti e morbilità del sito di campionamento³. Inoltre, le procedure di innesto autologo sono suscettibili di infezioni del sito chirurgico, conseguenti fratture, formazione di ematomi nel sito di prelievo o ricostruito e dolore post-operatorio⁴. L'ingegneria del tessuto osseo (BTE) offre una potenziale alternativa ai metodi convenzionali di innesto osseo⁵. Combina biomateriali strutturali e cellule per costruire nuovo tessuto osseo funzionale. Quando si progettano biomateriali per la BTE, è fondamentale combinare una struttura macroporosa, una chimica superficiale che promuova l'adesione cellulare e proprietà meccaniche che assomiglino molto a quelle dell'osso nativo⁶. Ricerche precedenti hanno indicato che la dimensione dei pori e il modulo elastico ideali per i biomateriali utilizzati nella BTE sono rispettivamente di circa 100-200 μm⁷ e 0,1-20 GPa, a seconda del sito di innesto⁸. Inoltre, la porosità e l'interconnessione dei pori degli scaffold sono fattori critici che influenzano la migrazione cellulare, la diffusione dei nutrienti e l'angiogenesi⁸.

La BTE ha mostrato risultati promettenti con vari biomateriali sviluppati e valutati come opzioni alternative agli innesti ossei. Alcuni di questi biomateriali sono materiali osteoinduttivi, materiali ibridi e idrogel avanzati⁸. I materiali osteoinduttivi stimolano lo sviluppo di strutture ossee di nuova formazione. I materiali ibridi sono composti da polimeri sintetici e/o naturali⁸. Gli idrogel avanzati imitano la matrice extracellulare (ECM) e sono in grado di fornire i fattori bioattivi necessari per promuovere l'integrazione del tessuto osseo⁸. L'idrossiapatite è un materiale tradizionale e una scelta comune per la BTE grazie alla sua composizione e biocompatibilità⁹. Il vetro bioattivo è un altro tipo di biomateriale per la BTE, che ha dimostrato di stimolare specifiche risposte cellulari per attivare i geni necessari per l'osteogenesi^10,11. Anche i polimeri biodegradabili, tra cui il poli(acido glicolico) e il poli(acido lattico), sono stati ampiamente utilizzati nelle applicazioni BTE¹². Infine, anche i polimeri naturali o di derivazione naturale come il chitosano, la chitina e la cellulosa batterica hanno dimostrato risultati incoraggianti per la BTE¹³. Tuttavia, mentre sia i polimeri sintetici che quelli naturali mostrano un potenziale per la BTE, lo sviluppo di un'impalcatura funzionale con la macrostruttura desiderata richiede in genere protocolli estesi.

Al contrario, le strutture macroscopiche native della cellulosa possono essere facilmente derivate da diverse piante e il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato l'applicabilità di scaffold a base di cellulosa derivati da piante a diverse ricostruzioni tissutali. Infatti, a seguito di un semplice trattamento con tensioattivi, abbiamo sfruttato la struttura intrinseca del materiale vegetale, evidenziandone il potenziale come biomateriale versatile¹⁴. Inoltre, questi scaffold a base di cellulosa possono essere utilizzati per applicazioni di coltura cellulare di mammifero in vitro ¹⁴, sono biocompatibili e supportano la vascolarizzazione sottocutanea spontanea 14,15,16,17. Sia il nostro gruppo di ricerca che altri hanno dimostrato che questi scaffold possono essere ottenuti da piante specifiche in base all'applicazione prevista 14,15,16,17,18,19,20. Ad esempio, la struttura vascolare osservata negli steli e nelle foglie delle piante mostra una sorprendente somiglianza con la struttura che si trova nei tessuti animali¹⁹. Inoltre, gli scaffold di cellulosa derivati dalle piante possono essere facilmente modellati e sottoposti a modifiche biochimiche superficiali per ottenere le caratteristiche desiderate¹⁶. In uno studio recente, abbiamo incorporato un tampone salino durante il processo di decellularizzazione, portando a un maggiore attaccamento cellulare osservato sia in vitro che in vivo ¹⁶. Nello stesso studio, abbiamo dimostrato l'applicabilità degli scaffold di cellulosa di origine vegetale nei biomateriali compositi mediante colata di idrogel sulla superficie degli scaffold. In studi recenti, la funzionalizzazione di scaffold di origine vegetale ha dimostrato di migliorarne l'efficacia¹⁸. Ad esempio, uno studio condotto da Fontana et al. (2017) ha rivelato che l'adesione dei fibroblasti dermici umani era supportata da steli decellularizzati rivestiti di RGD, mentre gli steli non rivestiti non mostravano la stessa capacità¹⁸. Inoltre, gli autori hanno anche dimostrato che il fluido corporeo simulato modificato potrebbe essere utilizzato per mineralizzare artificialmente gli steli delle piante decellularizzate. In studi più recenti, abbiamo esplorato il concetto di osteogenesi meccanosensibile negli scaffold di cellulosa di origine vegetale e valutato il loro potenziale per BTE^17,20. Inoltre, Lee et al. (2019) hanno utilizzato scaffold di origine vegetale per coltivare tessuti simili alle ossa in un ambiente in vitro ²¹. Attraverso valutazioni complete di diverse fonti vegetali, gli autori hanno identificato gli scaffold derivati dalla mela come i più ottimali per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Inoltre, gli autori hanno proposto che gli attributi strutturali e meccanici degli scaffold derivati dalle mele svolgano un ruolo fondamentale nella loro idoneità allo scopo previsto. Essendo i primi scaffold di origine vegetale implementati nelle applicazioni di ingegneria tissutale, gli scaffold derivati dal melo hanno ampiamente dimostrato di possedere un'architettura sorprendentemente simile a quella dell'osso umano, in particolare in termini di pori interconnessi che vanno da 100 a 200 μm di diametro^14,21.

Nel presente studio, abbiamo ulteriormente studiato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per la BTE e condotto un'analisi delle loro proprietà meccaniche sia in vitro che in vivo. Sebbene ci siano stati studi sul potenziale degli scaffold derivati dalla mela per BTE 17,20,21, le loro proprietà meccaniche sono state poco studiate. I risultati hanno mostrato un'invasione selvaggia e una differenziazione osteogenica dei preosteoblasti MC3T3-E1 seminati in scaffold che sono stati coltivati in terreno di differenziazione per 4 settimane. Il modulo di Young di questi scaffold era di 192,0 ± 16,6 kPa, che era significativamente superiore a quelli degli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) (31,6 ± 4,8 kPa) e degli scaffold seminati in cellula coltivati in terreno di non-differenziazione (24,1 ± 8,8 kPa). Tuttavia, va notato che il modulo di Young del tessuto osseo umano sano rientra tipicamente nell'intervallo di 0,1-2 GPa per l'osso trabecolare e di circa 15-20 GPa per l'osso corticale⁸. Tuttavia, a seguito di un impianto di 8 settimane in un difetto calvario del roditore, gli scaffold seminati dalle cellule sembravano essere ben integrati nell'osso circostante, come dimostrato da una forza di picco media di 113,6 N ± 18,2 N nei test di push-out, che è simile al carico di frattura precedentemente riportato dell'osso calvario nativo²². Nel complesso, i risultati ottenuti da questo studio sono molto promettenti, in particolare per le applicazioni non portanti. Tuttavia, gli scaffold di cellulosa derivati dalla mela non possiedono attualmente le proprietà meccaniche necessarie per abbinare con precisione il tessuto osseo circostante in un sito implantare. Di conseguenza, è necessario un ulteriore sviluppo per sbloccare il pieno potenziale di questi scaffold.

Protocollo

I protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Ottawa.

1. Preparazione dell'impalcatura

1. Usa un'affettatrice a mandolina per tagliare le mele McIntosh (Canada Fancy) a fette spesse 8 mm. Tagliare il tessuto di ipanzio delle fette di mela in quadrati di 5 mm x 5 mm.
2. Mettere i campioni quadrati in sodio dodecilsolfato (SDS) allo 0,1% per 2 giorni.
3. Lavare i campioni decellularizzati con acqua deionizzata e incubarli per una notte a temperatura ambiente (RT) in 100 mM CaCl₂ per rimuovere il tensioattivo rimanente.
4. Sterilizzare i campioni (cioè gli scaffold) in etanolo al 70% per 30 minuti, lavarli con acqua deionizzata e metterli in una piastra di coltura a 24 pozzetti prima della semina cellulare.

2. Coltura cellulare e semina di scaffold

1. Mantenere le cellule MC3T3-E1 Subclone 4 in piastre trattate con colture cellulari di 10 cm di diametro in condizioni di coltura cellulare (37°C in un'atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO₂ ).
2. Preparare il terreno di coltura cellulare costituito dal mezzo minimo essenziale di Eagle - modifica alfa (α-MEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina.
3. Staccare le cellule dalle piastre di coltura mediante tripsinizzazione (0,05% tripsina-EDTA) una volta raggiunta l'80% di confluenza.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a circa 200 x g per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in α-MEM a 2,5 x 10⁷ cellule per mL.
5. Pipettare un'aliquota di 40 μL della sospensione cellulare sulla superficie degli scaffold e lasciare che le cellule aderiscano per 1 ora in condizioni di coltura cellulare. Successivamente, aggiungere 2 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto di coltura della piastra di coltura.
6. Rifornire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni per 14 giorni.
7. Preparare un terreno di differenziazione aggiungendo 50 μg/mL di acido ascorbico e 4 mM di fosfato di sodio al terreno di coltura cellulare descritto in precedenza.
8. Indurre la differenziazione delle cellule MC3T3-E1 incubando gli scaffold nel mezzo di differenziazione per 4 settimane. Reintegrare il terreno ogni 3-4 giorni. Parallelamente, incubare gli scaffold in un terreno di coltura non differenziato (cioè un terreno senza gli integratori per indurre la differenziazione) per la stessa durata, con lo stesso programma di cambio del terreno per fungere da controllo negativo.

3. Misurazioni delle dimensioni dei pori mediante microscopia a scansione laser confocale

1. Lavare gli scaffold derivati da mele decellularizzate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Incubare gli scaffold in 1 mL di colorante bianco calcofluor al 10% (v/v) per 25 minuti al buio a RT.
3. Lavare gli scaffold (n = 3) con PBS e visualizzare tre aree selezionate in modo casuale per scaffold con un microscopio a scansione laser confocale risonante (CLSM) ad alta velocità con ingrandimento 10x, utilizzando un canale DAPI, come segue:
   1. Configurazione filtro ad emissione laser: 405 nm (laser); 425-475 nm (emissione)
   2. Regolare manualmente la potenza del laser e il rilevatore per garantire un'acquisizione ottimale dell'immagine. Acquisisci uno z-stack di 20 immagini con una dimensione del passo di 5 μm.
4. Utilizzando il software ImageJ, elaborare e analizzare le immagini confocali come segue:
   1. Utilizzate la funzione Z-Project to Maximum Intensity per creare un'immagine e applicate la funzione Trova bordi per evidenziare il bordo dei pori.
   2. Tracciate manualmente i pori con lo strumento Selezione a mano libera .
   3. Adatta ogni poro come un'ellisse, misura la lunghezza dell'asse maggiore, compila tutte le misurazioni (un totale di 54 nel presente studio - 6 in 3 aree selezionate casualmente per ogni scaffold) e calcola la lunghezza media.

4. Analisi della distribuzione cellulare mediante microscopia confocale a scansione laser

1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con paraformaldeide al 4% per 10 min.
2. Lavare accuratamente ogni scaffold con acqua deionizzata, permeabilizzare le cellule con una soluzione Triton-X 100 per 5 minuti e lavare nuovamente con PBS.
3. Incubare gli scaffold in 1 mL di acido periodico all'1% per 40 min e risciacquare con acqua deionizzata ^14,16.
4. Incubare gli scaffold in 1 mL di una soluzione contenente 100 mM di metabisolfito di sodio e 0,15 M di acido cloridrico, integrata con 100 μg/mL di ioduro di propidio. Immergere completamente gli scaffold nella soluzione.
5. Lavare gli scaffold con PBS e colorare i nuclei cellulari incubando gli scaffold in una soluzione DAPI da 5 mg/mL per 10 minuti al buio. Lavare di nuovo accuratamente e conservare le impalcature in PBS prima dell'imaging.
6. Immagine di tre superfici selezionate in modo casuale di tre diversi scaffold seminati di cellule con un CLSM risonante ad alta velocità con ingrandimento 10x, utilizzando i canali DAPI e TRITC, come segue:
   1. Configurazione del filtro di emissione laser:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emissione: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emissione: 570-620 nm
   2. Regolare manualmente la potenza del laser e il rilevatore per garantire un'acquisizione ottimale dell'immagine. Acquisisci uno z-stack di 20 immagini con una dimensione del passo di 5 μm.
7. Utilizzare il software ImageJ per elaborare le immagini confocali e creare una proiezione massima sull'asse z per l'analisi dell'immagine utilizzando la funzione Z-Project to Maximum Intensity (Proietta Z alla massima intensità ).

5. Analisi della fosfatasi alcalina

1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con formalina tamponata neutra al 10% per 30 min. Fissare gli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) che fungano da controllo negativo.
2. Preparare una soluzione colorante a base di 5-bromo-4-cloro-3'-indolificato e tetrazolio nitro-blu (BCIP/NBT) sciogliendo una compressa di BCIP/NBT in 10 mL di acqua deionizzata.
3. Lavare gli scaffold fissi con una soluzione di Tween allo 0,05% e colorarli con la soluzione BCIP/NBT per 20 minuti a RT. Lavare gli scaffold colorati con una soluzione di Tween allo 0,05% e conservarli in PBS prima dell'imaging.
4. Fotografa le impalcature macchiate con una fotocamera digitale da 12 megapixel.

6. Analisi della deposizione di calcio

1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con formalina tamponata neutra al 10% per 30 min. Fissare gli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) che fungano da controllo negativo.
2. Preparare una soluzione colorante al 2% (p/v) di rosso alizarina S (ARS).
3. Lavare gli scaffold fissi con acqua deionizzata e colorarli con la soluzione ARS per 1 ora a RT. Lavare gli scaffold colorati con acqua deionizzata e conservarli in PBS prima dell'imaging.
4. Fotografa le impalcature macchiate con una fotocamera digitale da 12 megapixel.

7. Analisi della mineralizzazione

1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati nel terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS. Fissare gli scaffold con paraformaldeide al 4% per 48 h. Fissare gli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) che fungano da controllo negativo.
2. Disidratare i campioni in soluzioni contenenti concentrazioni di etanolo crescenti dal 50% al 100%, come descritto in precedenza²³.
3. Eseguire la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) per analizzare gli aggregati minerali come segue:
   1. Essiccare i campioni utilizzando un essiccatore per punti critici, seguendo il protocollo del produttore²⁴.
   2. Applicare uno strato d'oro a 5 nm sulle impalcature utilizzando un rivestimento per polverizzazione d'oro, seguendo il protocollo^{del produttore 25}.
   3. Fotografare la superficie degli scaffold con un microscopio elettronico a scansione impostato a 3 kV, con un ingrandimento di 85x.
   4. Eseguire l'EDS impostando il microscopio elettronico a scansione a 15 kV. Su tre aree selezionate in modo casuale per scaffold, acquisire spettri EDS per l'analisi della composizione degli aggregati minerali.

8. Misure del modulo di Young

1. Rimuovere gli scaffold con semi cellulari dal rispettivo mezzo di incubazione e testare immediatamente i campioni.
2. Utilizzando un apparato di compressione uniassiale costruito su misura dotato di una cella di carico da 1,5 N, comprimere le impalcature (n = 3 per condizione) a una velocità costante di 3 mm·^min-1 a una deformazione di compressione massima del 10% dell'altezza dell'impalcatura.
3. Determinare il modulo di Young dalla pendenza della porzione lineare delle curve sforzo-deformazione. Nel presente studio, il modulo è stato determinato tra il 9% e il 10% di deformazione.

9. Analisi dell'infiltrazione cellulare e della mineralizzazione mediante istologia: scaffold in vitro

1. Lavare tre volte gli scaffold con semi cellulari coltivati in terreno di non differenziazione o differenziazione con PBS.
2. Fissare gli scaffold con semi cellulari con paraformaldeide al 4% per 48 ore prima della risospensione in etanolo al 70% per la conservazione.
3. Istologia:
   NOTA: Nel presente studio, l'intera preparazione istologica (inclusione, sezionamento e colorazione) descritta nei passaggi successivi è stata eseguita dalla Louise Pelletier Istology Core Facility (Università di Ottawa).
   1. Dopo la disidratazione e l'inclusione in paraffina, tagliare i campioni in sezioni seriali spesse 5 μm, a partire da 1 mm all'interno degli scaffold, e montare le sezioni su vetrini da microscopio.
   2. Colorare le sezioni con coloranti di ematossilina ed eosina (H&E) o von Kossa (VK).
   3. Visualizzare le sezioni con un microscopio scanner a vetrini con un ingrandimento di 40x (n = 1 scaffold in mezzo di non differenziazione e n = 2 scaffold in mezzo di differenziazione nel presente studio).
   4. Utilizzando il software ImageJ, è possibile valutare visivamente l'infiltrazione cellulare (colorazione H&E) e la mineralizzazione (colorazione VK).

10. Modello di difetto calvario di ratto

1. Ottenere la revisione e l'approvazione dei protocolli sperimentali da parte del comitato locale per la cura degli animali.
2. Preparare scaffold decellularizzati circolari (5 mm di diametro e 1 mm di spessore) seguendo la Sezione 1 sopra descritta e utilizzando un punzone per biopsia da 5 mm.
3. Eseguire la craniotomia bilaterale seguendo un protocollo stabilito²⁶, come segue:
   1. Anestetizzare i ratti maschi di Sprague-Dawley con isoflurano, prima al 3% fino a quando non sono incoscienti, e poi al 2-3% durante la procedura.
   2. Esporre il periostio e il cranio tagliando la pelle sovrastante con una lama di bisturi. Rimuovere il periostio.
   3. Creare difetti bilaterali in entrambe le ossa parietali su ciascun lato della sutura sagittale utilizzando un trapano dentale dotato di una trefina di 5 mm di diametro sotto irrigazione costante di NaCl allo 0,9%.
   4. Pulisci l'osso circostante con NaCl allo 0,9% per rimuovere eventuali frammenti ossei.
   5. Posizionare gli scaffold circolari decellularizzati nei difetti.
   6. Chiudere la pelle sovrastante con punti di sutura 4-0.
4. Dai ai ratti un accesso illimitato a cibo e acqua e monitorali quotidianamente.
5. Dopo 8 settimane dall'impianto, sopprimere i ratti mediante inalazione di CO₂ e perforazione toracica come misura secondaria di eutanasia.
6. Per esporre il cranio e recuperare gli impianti, rimuovere la pelle che copre il cranio utilizzando una lama di bisturi.
7. Tagliare il cranio in corrispondenza delle ossa frontali e occipitali e sul lato di entrambe le ossa parietali utilizzando un trapano dentale per rimuovere completamente la sezione superiore del cranio.

11. Prova di espulsione

1. Collegare un dispositivo di compressione uniassiale (con una cella di carico da 445 N) al modulo di acquisizione dati USB.
2. Collegare il modulo di acquisizione dati a un computer dotato di un'applicazione software di acquisizione dati.
3. Immediatamente dopo l'estrazione cranica, posizionare ciascun campione (n = 7 impianti di 4 animali nel presente studio) sul portacampioni del dispositivo di compressione uniassiale in modo che il lato dorsale dell'osso sia rivolto verso l'alto.
4. Abbassare lo stantuffo a 0,5 mm/min fino a toccare leggermente l'impianto estratto.
5. Iniziare il test abbassando lo stantuffo attraverso l'impianto fino alla completa spinta mentre si applica la compressione a una velocità costante di 0,5 mm/min utilizzando il software di acquisizione dati.
6. Registrare la forza di picco sulla curva forza/spostamento utilizzando il software di acquisizione dati.

12. Analisi dell'infiltrazione cellulare e della mineralizzazione mediante istologia: scaffold in vivo

1. Fissare la calvaria estratta e gli impianti in formalina tamponata neutra al 10% per 72 ore prima di risospendere in etanolo al 70% per la conservazione.
2. Istologia:
   NOTA: Nel presente studio, tutta la preparazione istologica (inclusione, sezionamento e colorazione) descritta nei passaggi successivi è stata eseguita da Accel Labs (Montreal, QC, Canada).
   1. Tagliare i campioni (incorporati nel metacrilato di metile) in sezioni spesse 6 μm a tre diversi livelli (in alto, in basso e verso il centro) e montarli su vetrini da microscopio.
   2. Colorare le sezioni con H&E o tricromico di Masson-Goldner (MGT).
3. Fotografare le sezioni con un microscopio scanner a vetrini con ingrandimento 40x (4 espianti da 2 animali nel presente studio).
4. Utilizzando il software ImageJ, è possibile valutare visivamente l'infiltrazione cellulare (colorazione H&E) e la deposizione di collagene (colorazione MGT).

Risultati

Misurazione delle dimensioni dei pori, distribuzione cellulare e mineralizzazione in vitro (Figura 1 e Figura 2)
La rimozione completa dei componenti cellulari nativi degli scaffold tissutali della mela è stata ottenuta dopo aver trattato gli scaffold con SDS e CaCl₂ (Figura 1A). Le impalcature mostravano una struttura altamente porosa, che è stata confermata utilizzando la microscopia confo...

Discussione

Diversi studi in vitro e in vivo hanno dimostrato la biocompatibilità della cellulosa di origine vegetale e il suo potenziale utilizzo nell'ingegneria tissutale 14,15,16,18,19,20, più specificamente per ospitare la differenziazione osteogenica^20,21

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology