פיגומים תפוחים שמקורם בתאים להנדסת רקמות עצם במבחנה וב-Vivo

Summary

במחקר זה אנו מפרטים שיטות של דה-צלולריזציה, אפיון פיזיקלי, הדמיה והשתלת in vivo של ביו-חומרים צמחיים, כמו גם שיטות לזריעה והתמיינות של תאים בפיגומים. השיטות המתוארות מאפשרות הערכה של ביו-חומרים מבוססי צמחים עבור יישומי הנדסת רקמת עצם.

Abstract

ביו-חומרים של תאית שמקורם בצמחים שימשו ביישומים שונים של הנדסת רקמות. מחקרי In vivo הראו תאימות ביולוגית יוצאת דופן של פיגומים העשויים מתאית שמקורה במקורות טבעיים. בנוסף, פיגומים אלה הם בעלי מאפיינים מבניים הרלוונטיים לרקמות מרובות, והם מקדמים פלישה והתרבות של תאי יונקים. מחקר שנערך לאחרונה באמצעות רקמת hypanthium תפוח decellularized הוכיח את הדמיון של גודל הנקבוביות שלה לזה של עצם trabecular, כמו גם את היכולת שלה לתמוך ביעילות התמיינות אוסטאוגנית. המחקר הנוכחי המשיך ובחן את הפוטנציאל של פיגומי תאית שמקורם בתפוח עבור יישומי הנדסת רקמת עצם (BTE) והעריך את התכונות המכניות שלהם in vitro ו - in vivo . פראוסטאובלסטים MC3T3-E1 נזרעו בפיגומי תאית שמקורם בתפוח, ולאחר מכן הוערכו על הפוטנציאל האוסטאוגני והתכונות המכניות שלהם. פוספטאז אלקליין וצביעת S אדומה אליזרין אישרו התמיינות אוסטאוגנית בפיגומים שגודלו בתרבית בתווך התמיינות. בדיקה היסטולוגית הדגימה פלישה נרחבת של תאים ומינרליזציה על פני הפיגומים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) חשף אגרגטים מינרליים על פני הפיגומים, וספקטרוסקופיה מפזרת אנרגיה (EDS) אישרה את נוכחותם של יסודות פוספט וסידן. עם זאת, למרות עלייה משמעותית במודולוס של יאנג בעקבות התמיינות תאים, הוא נשאר נמוך מזה של רקמת עצם בריאה. מחקרי In vivo הראו חדירה ושקיעה של מטריצה חוץ-תאית בתוך פיגומים תפוחים שעברו דה-צלולריזציה לאחר 8 שבועות של השתלה בקלבריה של חולדה. בנוסף, הכוח שנדרש כדי להסיר את הפיגומים מפגם העצם היה דומה לעומס השבר שדווח בעבר של עצם קלווריאלית טבעית. בסך הכל, מחקר זה מאשר כי תאית שמקורה בתפוחים היא מועמדת מבטיחה ליישומי BTE. עם זאת, ההבדל בין התכונות המכניות שלו לבין אלה של רקמת עצם בריאה עשוי להגביל את היישום שלו לתרחישים נושאי עומס נמוך. ייתכן שיהיה צורך בהנדסה מחדש מבנית נוספת ואופטימיזציה כדי לשפר את התכונות המכניות של פיגומי תאית שמקורם בתפוח עבור יישומים נושאי עומס.

Introduction

פגמים גדולים בעצמות הנגרמים על ידי פציעה או מחלה דורשים לעתים קרובות שתלים ביו-חומריים להתחדשות מלאה¹. טכניקות עכשוויות שנועדו לשפר את התחדשות רקמת העצם משתמשות באופן קבוע בשתלים אוטולוגיים, אלוגניים, קסנוגניים או סינתטיים². עבור השתלת עצם אוטולוגית, הנחשבת לשיטת ההשתלה "תקן הזהב" לתיקון פגמים גדולים בעצם, מופקת העצם מהמטופל. עם זאת, להליך השתלה זה מספר חסרונות, ביניהם מגבלות גודל וצורה, זמינות רקמות ותחלואה באתר הדגימה³. יתר על כן, הליכי השתלה אוטולוגיים רגישים לזיהומים באתר הניתוח, שברים עוקבים, היווצרות המטומה באתר הדגימה או המשוחזר, וכאב לאחר הניתוח⁴. הנדסת רקמת עצם (BTE) מציעה חלופה פוטנציאלית לשיטות השתלת עצם קונבנציונליות⁵. הוא משלב ביו-חומרים מבניים ותאים כדי לבנות רקמת עצם פונקציונלית חדשה. בעת תכנון ביו-חומרים עבור BTE, חיוני לשלב מבנה מקרו-נקבובי, כימיה של פני השטח המקדמת התקשרות של תאים, ותכונות מכניות הדומות מאוד לאלה של עצם טבעית⁶. מחקרים קודמים הצביעו על כך שגודל הנקבוביות האידיאלי והמודולוס האלסטי עבור ביו-חומרים המשמשים ב-BTE הם בערך 100-200 מיקרומטר⁷ ו-0.1-20 GPa, בהתאמה, בהתאם לאתר ההשתלה⁸. חוץ מזה, הנקבוביות והקישוריות הנקבובית של הפיגומים הם גורמים קריטיים המשפיעים על נדידת תאים, דיפוזיה של חומרי מזון ואנגיוגנזה⁸.

BTE הראה תוצאות מבטיחות עם ביו-חומרים שונים שפותחו והוערכו כאפשרויות חלופיות להשתלות עצם. חלק מהביו-חומרים הללו הם חומרים אוסטאואינדוקטיביים, חומרים היברידיים והידרוג'לים מתקדמים⁸. חומרים אוסטאואינדוקטיביים מעוררים את התפתחותם של מבני עצם שזה עתה נוצרו. חומרים היברידיים מורכבים מפולימרים סינתטיים ו/או טבעיים⁸. הידרוג'לים מתקדמים מחקים את המטריצה החוץ תאית (ECM) ומסוגלים לספק את הגורמים הביו-אקטיביים הדרושים לקידום אינטגרציה של רקמת עצם⁸. הידרוקסיאפטיט הוא חומר מסורתי ובחירה נפוצה עבור BTE בשל הרכבו ותאימות ביולוגית⁹. זכוכית ביו-אקטיבית היא סוג נוסף של חומר ביולוגי עבור BTE, אשר הוכח כמעורר תגובות תאים ספציפיות להפעלת גנים הדרושים לאוסטאוגנזה^10,11. פולימרים מתכלים, כולל פולי (חומצה גליקולית) ופולי(חומצה לקטית), נמצאים גם הם בשימוש נרחב ביישומי BTE¹². לבסוף, פולימרים טבעיים או טבעיים כמו צ'יטוזן, כיטין ותאית חיידקית הדגימו גם הם תוצאות מעודדות עבור BTE¹³. עם זאת, בעוד פולימרים סינתטיים וטבעיים כאחד מראים פוטנציאל עבור BTE, פיתוח פיגום פונקציונלי עם מבנה המאקרו הרצוי בדרך כלל דורש פרוטוקולים נרחבים.

לעומת זאת, מבני תאית מקרוסקופיים מקומיים יכולים להיגזר בקלות מצמחים מגוונים וקבוצת המחקר שלנו הדגימה בעבר את הישימות של פיגומים מבוססי תאית שמקורם בצמחים לשחזורי רקמות שונים. ואכן, לאחר טיפול פשוט של חומרים פעילי שטח, רתמנו את המבנה האינהרנטי של החומר הצמחי, תוך הדגשת הפוטנציאל שלו כחומר ביולוגי רב-תכליתי¹⁴. יתר על כן, פיגומים מבוססי תאית אלה יכולים לשמש ליישומי תרבית תאי יונקים במבחנה ¹⁴, הם תואמים ביולוגית, ותומכים בכלי דם תת-עוריים ספונטניים 14,15,16,17. הן קבוצת המחקר שלנו והן אחרות הוכיחו כי ניתן להשיג פיגומים אלה מצמחים ספציפיים בהתבסס על היישום המיועד 14,15,16,17,18,19,20. לדוגמה, מבנה כלי הדם שנצפה בגבעולים ובעלים של צמחים מציג דמיון בולט למבנה שנמצא ברקמות בעלי חיים¹⁹. בנוסף, פיגומי תאית שמקורם בצמחים יכולים להיות מעוצבים בקלות ונתונים לשינויים ביוכימיים על פני השטח כדי להשיג את המאפיינים הרצויים¹⁶. במחקר שנערך לאחרונה, שילבנו חיץ מלח במהלך תהליך הדה-צלולריזציה, מה שהוביל לחיבור תאים משופר שנצפה הן במבחנה והן ב-vivo ¹⁶. באותו מחקר הדגמנו את הישימות של פיגומי תאית ממקור צמחי בביו-חומרים מרוכבים על ידי יציקת הידרוג'לים על פני השטח של הפיגומים. במחקרים שנערכו לאחרונה, הפונקציונליות של פיגומים שמקורם בצמחים הוכחה כמשפרת את יעילותם¹⁸. לדוגמה, מחקר שנערך על ידי Fontana et al. (2017) גילה כי הידבקות של פיברובלסטים עוריים אנושיים נתמכה על ידי גבעולים decellularized מצופים RGD, בעוד גבעולים שאינם מצופים לא הציגו את אותה יכולת¹⁸. יתר על כן, המחברים גם הראו כי נוזל גוף מדומה שונה יכול לשמש מינרליזציה מלאכותית של גבעולי צמחים decellularized. במחקרים עדכניים יותר, בחנו את הרעיון של אוסטאוגנזה רגישה למכנוב בפיגומי תאית ממקור צמחי והערכנו את הפוטנציאל שלהם עבור BTE^17,20. יתר על כן, Lee et al. (2019) השתמשו בפיגומים שמקורם בצמחים כדי לטפח רקמות דמויות עצם בסביבה חוץ גופית ²¹. באמצעות הערכות מקיפות של מקורות צמחיים שונים, המחברים זיהו פיגומים שמקורם בתפוחים כאופטימליים ביותר לתרבית ולהתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). יתר על כן, המחברים הציעו כי התכונות המבניות והמכאניות של הפיגומים שמקורם בתפוח ממלאות תפקיד מרכזי בהתאמתם למטרה המיועדת. בהיותם הפיגומים הראשונים שמקורם בצמחים שיושמו ביישומי הנדסת רקמות, פיגומים שמקורם בתפוחים הוכחו בהרחבה כבעלי ארכיטקטורה דומה להפליא לזו של עצם אנושית, בעיקר במונחים של הנקבוביות המחוברות ביניהן בקוטר^{של 100} עד 200 מיקרומטר בקוטר ^14,21.

במחקר הנוכחי, חקרנו עוד יותר את הפוטנציאל של פיגומי תאית שמקורם בתפוח עבור BTE וערכנו ניתוח של התכונות המכניות שלהם הן במבחנה והן in vivo. למרות שהיו מחקרים על הפוטנציאל של פיגומים שמקורם בתפוח עבור BTE ^17,20,21, התכונות המכניות שלהם לא נחקרו מספיק. התוצאות הראו פלישה של התפשטות בר והתמיינות אוסטאוגנית של פראוסטאובלסטים MC3T3-E1 שנזרעו בפיגומים שגודלו בתרבית בתווך התמיינות במשך 4 שבועות. המודולוס של פיגומים אלה היה 192.0 ±-16.6 kPa, שהיה גבוה משמעותית מאלה של הפיגומים הריקים (פיגומים ללא תאי זרע) (31.6 ±-4.8 kPa) והפיגומים מזרעי תאים שגודלו בתרבית בתווך אי-התמיינות (24.1 ±-8.8 kPa). עם זאת, יש לציין כי מודולוס יאנג של רקמת עצם אנושית בריאה בדרך כלל נופל בטווח של 0.1-2 GPa עבור עצם trabecular וכ 15-20 GPa עבור עצם קליפת המוח⁸. עם זאת, לאחר השתלה של 8 שבועות בפגם קלווריאלי של מכרסמים, נראה כי פיגומים מזרעי תאים השתלבו היטב בעצם שמסביב, כפי שהודגם על ידי כוח שיא ממוצע של 113.6 N ± 18.2 N בבדיקות דחיפה החוצה, הדומה לעומס השבר שדווח בעבר של עצם קלווריאלית מקומית²². בסך הכל, התוצאות שהתקבלו ממחקר זה מראות הבטחה משמעותית, במיוחד עבור יישומים שאינם נושאים עומס. עם זאת, לפיגומי תאית שמקורם בתפוח אין כיום את התכונות המכניות הדרושות כדי להתאים במדויק לרקמת העצם שמסביב באתר השתל. כתוצאה מכך, נדרש פיתוח נוסף כדי למצות את מלוא הפוטנציאל של פיגומים אלה.

Protocol

פרוטוקולי הניסוי נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת אוטווה.

1. הכנת פיגומים

1. השתמשו בפרוסת מנדולינה כדי לחתוך תפוחי מקינטוש (Canada Fancy) לפרוסות בעובי 8 מ"מ. חותכים את רקמת ההיפנתיום של פרוסות התפוחים לריבועים בגודל 5 מ"מ x 5 מ"מ.
2. מניחים את הדגימות המרובעות ב-0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS) למשך יומיים.
3. שטפו את הדגימות שעברו דה-צלולר במים שעברו דה-יוניזציה ודגרו עליהן למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT) ב-100 mM CaCl₂ כדי להסיר את שאריות פעילי השטח.
4. מעקרים את הדגימות (כלומר פיגומים) באתנול 70% למשך 30 דקות, שוטפים אותן במים נטולי יונים, ומניחים אותן בצלחת תרבית של 24 בארות לפני זריעת התא.

2. תרבית תאים וזריעת פיגומים

1. יש לשמור על תת-שיבוט MC3T3-E1 של 4 תאים בצלחות שטופלו בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ בתנאי תרבית תאים (37°C באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO₂).
2. הכינו מדיום תרבית תאים העשוי מהמדיום החיוני המינימלי של Eagle's - שינוי אלפא (α-MEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
3. נתקו את התאים מצלחות התרבית על ידי טריפסיניזציה (0.05% טריפסין-EDTA) ברגע שהם מגיעים למפגש של 80%.
4. צנטריפוגה את מתלה התא ב c.a. 200 x g במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-α-MEM ב-2.5 x 10⁷ תאים למ"ל.
5. פיפטה 40 μL aliquot של תרחיף התא על פני הפיגומים, ולתת לתאים להיצמד במשך 1 שעה בתנאי תרבית תאים. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות לכל באר תרבות של צלחת התרבות.
6. לחדש את מדיום התרבות כל 2-3 ימים במשך 14 ימים.
7. הכינו מדיום התמיינות על ידי הוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ו-4 מ"מ נתרן פוספט למדיום תרבית התאים שתואר קודם לכן.
8. השראת התמיינות של תאי MC3T3-E1 על ידי דגירה על הפיגומים בתווך התמיינות למשך 4 שבועות. לחדש את המדיום כל 3-4 ימים. במקביל, יש לדגור על פיגומים בתווך תרבית אי-דיפרנציאציה (כלומר, מדיום ללא התוספים ליצירת בידול) למשך אותו משך זמן, כאשר אותו לוח שינויים בינוני ישמש כבקרה שלילית.

3. מדידות גודל נקבוביות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי

1. שטפו את הפיגומים שמקורם בתפוח עם מלח חוצץ פוספט (PBS).
2. דגרו על הפיגומים ב-1 מ"ל של 10% (v/v) כתם לבן קלקופלור למשך 25 דקות בחושך ב-RT.
3. שטפו את הפיגומים (n = 3) עם PBS ודמו שלושה אזורים שנבחרו באופן אקראי לכל פיגום עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) בהגדלה של פי 10, באמצעות ערוץ DAPI, באופן הבא:
   1. תצורת מסנן פליטת לייזר: 405 ננומטר (לייזר); 425-475 ננומטר (פליטה)
   2. כוונן את עוצמת הלייזר ואת הגלאי באופן ידני כדי להבטיח קבלת תמונה מיטבית. קבל ערימת z של 20 תמונות עם גודל צעד של 5 מיקרומטר.
4. באמצעות תוכנת ImageJ, לעבד ולנתח את התמונות confocal כדלקמן:
   1. השתמשו בפונקציה Z-Project to Maximum Intensity ליצירת תמונה, והחילו את הפונקציה Find Edges כדי להדגיש את קצות הנקבוביות.
   2. עקוב אחר הנקבוביות באופן ידני באמצעות הכלי בחירה חופשית .
   3. התאימו כל נקבובית כאליפסה, מדדו את אורך הציר הראשי, אספו את כל המדידות (סה"כ 54 במחקר הנוכחי - 6 מתוך 3 אזורים שנבחרו באופן אקראי לכל פיגום), וחשבו את האורך הממוצע.

4. ניתוח פיזור תאים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי

1. שטפו את הפיגומים מזרעי התאים שגודלו בתרבית במדיום אי-התמיינות או התמיינות שלוש פעמים עם PBS. תקן את הפיגומים עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות.
2. שטפו היטב כל פיגום במים שעברו דה-יוניזציה, חדרו את התאים בתמיסת Triton-X 100 למשך 5 דקות, ושטפו שוב עם PBS.
3. יש לדגור על הפיגומים ב-1 מ"ל של 1% חומצה מחזורית למשך 40 דקות ולשטוף במים נטולי יונים,^14,16.
4. לדגור על הפיגומים ב 1 מ"ל של תמיסה המכילה 100 mM נתרן metabisulphite ו 0.15 M חומצה הידרוכלורית, בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל יודיום יודיד. לטבול לחלוטין את הפיגומים בתמיסה.
5. שטפו את הפיגומים עם PBS והכתימו את גרעיני התא על ידי דגירה על הפיגומים בתמיסת DAPI של 5 מ"ג/מ"ל למשך 10 דקות בחושך. יש לשטוף שוב ביסודיות ולאחסן את הפיגומים ב-PBS לפני ההדמיה.
6. תמונה של שלושה משטחים שנבחרו באופן אקראי של שלושה פיגומים שונים מזרעי תאים עם CLSM תהודה במהירות גבוהה בהגדלה של פי 10, באמצעות ערוצי DAPI ו-TRITC, באופן הבא:
   1. תצורת מסנן פליטת לייזר:
      DAPI: לייזר: 405 ננומטר; פליטה: 425-475 ננומטר
      TRITC: לייזר: 561 ננומטר; פליטה: 570-620 ננומטר
   2. כוונן את עוצמת הלייזר ואת הגלאי באופן ידני כדי להבטיח קבלת תמונה מיטבית. קבל ערימת z של 20 תמונות עם גודל צעד של 5 מיקרומטר.
7. השתמש בתוכנת ImageJ כדי לעבד את התמונות הקונפוקליות וליצור הקרנה מקסימלית בציר z לניתוח תמונות באמצעות הפונקציה Z-Project to Maximum Intensity .

5. ניתוח phosphatase אלקליין

1. שטפו את הפיגומים מזרעי התאים שגודלו בתרבית במדיום אי-התמיינות או התמיינות שלוש פעמים עם PBS. תקנו את הפיגומים עם 10% פורמלין חוצץ נייטרלי למשך 30 דקות. תקן פיגומים ריקים (פיגומים ללא תאי זרע) כדי שישמשו כבקרה שלילית.
2. הכינו תמיסת צביעה 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate ו-nitro-blue tetrazolium (BCIP/NBT) על ידי המסת טבלית BCIP/NBT אחת ב-10 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
3. שטפו את הפיגומים הקבועים בתמיסת רצף 0.05% והכתימו עם תמיסת BCIP/NBT למשך 20 דקות ב-RT. שטפו את הפיגומים המוכתמים בתמיסת רצף 0.05% ואחסנו אותם ב-PBS לפני ההדמיה.
4. דמיינו את הפיגומים המוכתמים במצלמה דיגיטלית של 12 מגה-פיקסל.

6. ניתוח תצהיר סידן

1. שטפו את הפיגומים מזרעי התאים שגודלו בתרבית במדיום אי-התמיינות או התמיינות שלוש פעמים עם PBS. תקנו את הפיגומים עם 10% פורמלין חוצץ נייטרלי למשך 30 דקות. תקן פיגומים ריקים (פיגומים ללא תאי זרע) כדי שישמשו כבקרה שלילית.
2. הכינו תמיסת צביעה 2% (w/v) בצבע אדום אליזרין S (ARS).
3. שטפו את הפיגומים הקבועים במים שעברו דה-יוניזציה והכתימו אותם בתמיסת ARS למשך שעה אחת ב-RT. שטפו את הפיגומים המוכתמים במים נטולי יונים, ואחסנו אותם ב-PBS לפני ההדמיה.
4. דמיינו את הפיגומים המוכתמים במצלמה דיגיטלית של 12 מגה-פיקסל.

7. ניתוח מינרליזציה

1. שטפו את הפיגומים מזרעי התאים שגודלו בתרבית במדיום אי-התמיינות או התמיינות שלוש פעמים עם PBS. תקן את הפיגומים עם 4% paraformaldehyde במשך 48 שעות. תקן פיגומים ריקים (פיגומים ללא תאי זרע) כדי שישמשו כבקרה שלילית.
2. יש לייבש את הדגימות בתמיסות המכילות ריכוזי אתנול העולים מ-50% ל-100%, כפי שתואר לעיל²³.
3. בצע מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) וספקטרוסקופיה מפזרת אנרגיה (EDS) כדי לנתח אגרגטים מינרליים כדלקמן:
   1. יבשו את הדגימות באמצעות מייבש נקודה קריטית, בהתאם לפרוטוקול^{היצרן 24}.
   2. יש למרוח ציפוי זהב 5 ננומטר על הפיגומים באמצעות ציפוי זהב, בהתאם לפרוטוקול^{היצרן 25}.
   3. דמיינו את פני השטח של הפיגומים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהגדלה של 3 קילו-וולט, בהגדלה של פי 85.
   4. בצע EDS על ידי הגדרת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק על 15 kV. בשלושה אזורים שנבחרו באופן אקראי לכל פיגום, רכשו ספקטרום EDS לניתוח הרכב אגרגטים מינרליים.

8. מדידות המודולוס של יאנג

1. הסר את הפיגומים מזרע התא ממדיום הדגירה המתאים שלהם ובדוק מיד את הדגימות.
2. באמצעות מנגנון דחיסה חד-צירי שנבנה בהתאמה אישית ומצויד בתא עומס של 1.5 N, דחסו את הפיגומים (n = 3 לכל תנאי) בקצב קבוע של 3 מ"מ·^min-1 למאמץ דחיסה מרבי של 10% מגובה הפיגומים.
3. לקבוע את המודולוס של יאנג מהשיפוע של החלק הליניארי של עקומות המתח. במחקר הנוכחי, המודולוס נקבע בין 9% ל -10% מתח.

9. חדירת תאים וניתוח מינרליזציה על ידי היסטולוגיה: פיגומים חוץ גופיים

1. שטפו את הפיגומים מזרעי תאים שגודלו בתרבית במדיום אי-התמיינות או התמיינות שלוש פעמים עם PBS.
2. תקן את הפיגומים זרע התא עם 4% paraformaldehyde במשך 48 שעות לפני ההשעיה ב 70% אתנול לאחסון.
3. היסטולוגיה:
   הערה: במחקר הנוכחי, כל ההכנה ההיסטולוגית (הטבעה, חתך וצביעה) המתוארת בשלבים הבאים בוצעה על ידי מתקן הליבה להיסטולוגיה ע"ש לואיז פלטייה (אוניברסיטת אוטווה).
   1. לאחר התייבשות והטמעה בפרפין, חותכים את הדגימות למקטעים טוריים בעובי 5 מיקרומטר, החל מ-1 מ"מ בתוך הפיגומים, ומרכיבים את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ.
   2. הכתימו את החלקים בכתמי המטוקסילין ואאוזין (H&E) או פון קוסה (VK).
   3. דמיינו את המקטעים במיקרוסקופ סורק שקופיות בהגדלה של 40x (n = פיגום אחד בתווך אי-התמיינות ו-n = 2 פיגומים במדיום התמיינות במחקר הנוכחי).
   4. באמצעות תוכנת ImageJ, בצע הערכה חזותית של חדירת תאים (צביעת H&E) ומינרליזציה (צביעת VK).

10. מודל פגם קלווריאלי של חולדה

1. קבל פרוטוקולים ניסיוניים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים.
2. הכינו פיגומים עגולים (קוטר 5 מ"מ ועובי 1 מ"מ) דה-צלולריים בהתאם לסעיף 1 המתואר לעיל ובאמצעות ניקוב ביופסיה 5 מ"מ.
3. ביצוע קרניוטומיה דו צדדית בעקבות פרוטוקול²⁶ שנקבע, כדלקמן:
   1. הרדימו חולדות Sprague-Dawley זכרים עם איזופלורן, תחילה ב-3% עד שהן מאבדות את הכרתן, ולאחר מכן ב-2-3% לאורך כל ההליך.
   2. חשוף את periosteum ואת הגולגולת על ידי חיתוך העור מעל באמצעות להב אזמל. הסר את periosteum.
   3. יצירת פגמים דו צדדיים בשתי עצמות הקודקוד בכל צד של תפר הקשת באמצעות מקדחה דנטלית המצוידת בטרפין בקוטר 5 מ"מ תחת השקיה קבועה של 0.9% NaCl.
   4. נקו את העצם שמסביב עם 0.9% NaCl כדי להסיר שברי עצם.
   5. מניחים את הפיגומים העגולים, נטולי התא, בתוך הפגמים.
   6. סגור את העור שמעל עם 4-0 תפרים.
4. תנו לחולדות גישה בלתי מוגבלת למזון ומים ועקבו אחריהן מדי יום.
5. לאחר 8 שבועות לאחר ההשתלה, יש להרדים את החולדות על ידי שאיפת_CO2 וניקוב בית החזה כאמצעי המתת חסד משני.
6. כדי לחשוף את הגולגולת ולשלוף את השתלים, הסר את העור המכסה את הגולגולת באמצעות להב אזמל.
7. חתכו את הגולגולת בעצמות הקדמיות והעורפיות ובצד שתי העצמות הקודקודיות באמצעות מקדחה דנטלית כדי להסיר את החלק העליון של הגולגולת לחלוטין.

11. מבחן דחיפה החוצה

1. חבר התקן דחיסה חד-צירי (עם תא טעינה של 445 N) למודול רכישת הנתונים מסוג USB.
2. חבר את מודול רכישת הנתונים למחשב המצויד ביישום תוכנה לרכישת נתונים.
3. מיד לאחר מיצוי הגולגולת, הניחו כל דגימה (n = 7 שתלים מ-4 בעלי חיים במחקר הנוכחי) על מחזיק הדגימה של מכשיר הדחיסה החד-צירית, כך שהצד הגבי של העצם פונה כלפי מעלה.
4. מנמיכים את הבוכנה ב-0.5 מ"מ/דקה עד למגע קל בשתל שחולץ.
5. התחל את הבדיקה על ידי הורדת הבוכנה דרך השתל עד לדחיפה מלאה החוצה תוך הפעלת דחיסה במהירות קבועה של 0.5 מ"מ/דקה באמצעות תוכנת איסוף הנתונים.
6. רשום את כוח השיא בעקומת הכוח לעומת התזוזה באמצעות תוכנת רכישת הנתונים.

12. חדירת תאים וניתוח מינרליזציה על ידי היסטולוגיה: פיגומים In vivo

1. תקן את הקלבריה המופקת ואת השתלים בפורמלין חוצץ 10% ניטרלי למשך 72 שעות לפני השעיה באתנול 70% לאחסון.
2. היסטולוגיה:
   הערה: במחקר הנוכחי, כל ההכנה ההיסטולוגית (הטבעה, חתך וצביעה) המתוארת בשלבים הבאים בוצעה על ידי Accel Labs (מונטריאול, QC, קנדה).
   1. חתכו את הדגימות (המוטבעות במתיל מתקרילט) למקטעים בעובי 6 מיקרומטר בשלוש רמות שונות (למעלה, למטה ולכיוון המרכז) והרכיבו אותן על שקופיות מיקרוסקופ.
   2. הכתימו את הקטעים ב-H&E או בטריכרום של מאסון-גולדנר (MGT).
3. דמיינו את המקטעים במיקרוסקופ סורק שקופיות בהגדלה של פי 40 (במחקר הנוכחי 4 צמחים מ-2 בעלי חיים).
4. באמצעות תוכנת ImageJ, יש להעריך ויזואלית חדירת תאים (צביעת H&E) ושקיעת קולגן (צביעת MGT).

תוצאות

מדידת גודל נקבוביות, פיזור תאים ומינרליזציה במבחנה (איור 1 ואיור 2)
הסרה מלאה של רכיבים תאיים מקוריים של פיגומי רקמת התפוחים הושגה לאחר טיפול בפיגומים עם SDS ו-CaCl₂ (איור 1A). הפיגומים הציגו מבנה נקבובי מאוד, שאושר באמצעות מי?...

Discussion

מספר מחקרי in vitro ו-in vivo הדגימו את התאימות הביולוגית של תאית ממקור צמחי ואת השימוש הפוטנציאלי שלה בהנדסת רקמות 14,15,16,18,19,20, באופן ספציפי יותר לאירוח התמיינות אוסטאוגנית ^20,21

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology