Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada, bitki bazlı biyomalzemelerin hücre çözme, fiziksel karakterizasyon, görüntüleme ve in vivo implantasyon yöntemlerinin yanı sıra yapı iskelelerinde hücre tohumlama ve farklılaşma yöntemlerini detaylandırıyoruz. Açıklanan yöntemler, kemik dokusu mühendisliği uygulamaları için bitki bazlı biyomalzemelerin değerlendirilmesine izin verir.

Özet

Bitki kaynaklı selüloz biyomalzemeleri çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmıştır. İn vivo çalışmalar, doğal kaynaklardan elde edilen selülozdan yapılmış iskelelerin dikkate değer biyouyumluluğunu göstermiştir. Ek olarak, bu iskeleler, birden fazla doku için geçerli olan yapısal özelliklere sahiptir ve memeli hücrelerinin istilasını ve çoğalmasını teşvik eder. Hücreden arındırılmış elma hipantyum dokusu kullanılarak yapılan son araştırmalar, gözenek boyutunun trabeküler kemiğe benzerliğini ve osteojenik farklılaşmayı etkili bir şekilde destekleme yeteneğini göstermiştir. Bu çalışmada ayrıca kemik dokusu mühendisliği (BTE) uygulamaları için elma türevli selüloz iskelelerin potansiyeli incelenmiş ve bunların in vitro ve in vivo mekanik özellikleri değerlendirilmiştir. MC3T3-E1 preosteoblastları, daha sonra osteojenik potansiyelleri ve mekanik özellikleri açısından değerlendirilen elma türevli selüloz iskelelere ekildi. Alkalen fosfataz ve alizarin kırmızısı S boyaması, diferansiyasyon ortamında kültürlenen iskelelerde osteojenik farklılaşmayı doğruladı. Histolojik inceleme, iskeleler boyunca yaygın hücre invazyonu ve mineralizasyonu gösterdi. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), iskelelerin yüzeyinde mineral agregaları ortaya çıkardı ve enerji dağıtıcı spektroskopi (EDS), fosfat ve kalsiyum elementlerinin varlığını doğruladı. Bununla birlikte, hücre farklılaşmasını takiben Young modülünde önemli bir artışa rağmen, sağlıklı kemik dokusundan daha düşük kalmıştır. İn vivo çalışmalar, sıçan kalvarisinde 8 haftalık implantasyondan sonra hücre infiltrasyonu ve hücre dışı matriksin hücre dışı matriks birikimi gösterdi. Ek olarak, iskeleleri kemik defektinden çıkarmak için gereken kuvvet, daha önce bildirilen doğal kalvarial kemiğin kırık yüküne benzerdi. Genel olarak, bu çalışma, elma türevi selülozun BTE uygulamaları için umut verici bir aday olduğunu doğrulamaktadır. Bununla birlikte, mekanik özellikleri ile sağlıklı kemik dokusununkiler arasındaki farklılık, uygulanmasını düşük yük taşıma senaryolarıyla sınırlayabilir. Yük taşıma uygulamaları için elmadan elde edilen selüloz iskelelerin mekanik özelliklerini geliştirmek için ek yapısal yeniden mühendislik ve optimizasyon gerekebilir.

Giriş

Bir yaralanma veya hastalığın neden olduğu büyük kemik kusurları, tam rejenerasyon için genellikle biyomateryal greftleri gerektirir1. Kemik dokusu rejenerasyonunu iyileştirmek için tasarlanmış mevcut teknikler düzenli olarak otolog, allojeneik, ksenojenik veya sentetik greftler kullanır2. Büyük kemik kusurlarını onarmak için "altın standart" greftleme uygulaması olarak kabul edilen otolog kemik grefti için hastadan kemik çıkarılır. Bununla birlikte, bu aşılama prosedürünün boyut ve şekil sınırlamaları, doku mevcudiyeti ve örnekleme bölgesi morbiditesi dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları vardır3. Ayrıca, otolog greftleme prosedürleri cerrahi alan enfeksiyonlarına, müteakip kırıklara, örnekleme veya yeniden yapılandırma bölgesinde hematom oluşumuna ve ameliyat sonrası ağrıya duyarlıdır4. Kemik dokusu mühendisliği (BTE), geleneksel kemik grefti yöntemlerine potansiyel bir alternatif sunar5. Yeni fonksiyonel kemik dokusu oluşturmak için yapısal biyomalzemeleri ve hücreleri birleştirir. BTE için biyomalzemeler tasarlarken, makro gözenekli bir yapıyı, hücre bağlanmasını destekleyen yüzey kimyasını ve doğal kemiğe çok benzeyen mekanik özellikleri birleştirmek çok önemlidir6. Geçmiş araştırmalar, BTE'de kullanılan biyomalzemeler için ideal gözenek boyutunun ve elastik modülün, aşılama bölgesine bağlı olarak sırasıyla yaklaşık 100-200μm7 ve 0.1-20 GPa olduğunu göstermiştir8. Ayrıca, yapı iskelelerinin gözenekliliği ve gözeneklerin birbirine bağlanması, hücre göçünü, besin difüzyonunu ve anjiyogenezi etkileyen kritik faktörlerdir8.

BTE, kemik greftlerine alternatif seçenekler olarak geliştirilen ve değerlendirilen çeşitli biyomateryaller ile umut verici sonuçlar göstermiştir. Bu biyomalzemelerden bazıları osteoindüktif malzemeler, hibrit malzemeler ve gelişmiş hidrojellerdir8. Osteoindüktif materyaller yeni oluşan kemik yapılarının gelişimini uyarır. Hibrit malzemeler sentetik ve/veya doğal polimerlerden oluşur8. Gelişmiş hidrojeller, hücre dışı matrisi (ECM) taklit eder ve kemik dokusu entegrasyonunu desteklemek için gerekli biyoaktif faktörleri sağlayabilir8. Hidroksiapatit geleneksel bir malzemedir ve bileşimi ve biyouyumluluğu nedeniyle BTE için yaygın bir seçimdir9. Biyoaktif cam, osteogenez10,11 için gerekli genleri aktive etmek için spesifik hücre tepkilerini uyardığı gösterilen BTE için başka bir biyomateryal türüdür. Poli (glikolik asit) ve poli (laktik asit) dahil olmak üzere biyolojik olarak parçalanabilen polimerler de BTE uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır12. Son olarak, kitosan, kitin ve bakteriyel selüloz gibi doğal veya doğal olarak türetilmiş polimerler de BTE13 için cesaret verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, hem sentetik hem de doğal polimerler BTE için potansiyel gösterirken, istenen makro yapıya sahip fonksiyonel bir iskelenin geliştirilmesi tipik olarak kapsamlı protokoller gerektirir.

Tersine, doğal makroskopik selüloz yapıları, çeşitli bitkilerden kolayca elde edilebilir ve araştırma grubumuz daha önce bitkilerden türetilen selüloz bazlı iskelelerin farklı doku rekonstrüksiyonlarına uygulanabilirliğini göstermiştir. Gerçekten de, basit bir yüzey aktif madde işleminin ardından, bitki materyalinin doğal yapısından yararlandık ve çok yönlü bir biyomateryal olarak potansiyelini vurguladık14. Ayrıca, bu selüloz bazlı iskeleler, in vitro memeli hücre kültürü uygulamaları14 için kullanılabilir, biyouyumludur ve spontan deri altı vaskülarizasyonudestekler 14,15,16,17. Hem araştırma grubumuz hem de diğerleri, bu iskelelerin amaçlanan uygulamaya göre belirli bitkilerden elde edilebileceğinigöstermiştir 14,15,16,17,18,19,20. Örneğin, bitki sap ve yapraklarında gözlenen damar yapısı, hayvan dokularında bulunan yapı ile çarpıcı bir benzerlik göstermektedir19. Ek olarak, bitkilerden elde edilen selüloz iskeleler, istenen özellikleri elde etmek için kolayca şekillendirilebilir ve yüzey biyokimyasal modifikasyonlarına tabi tutulabilir16. Yakın tarihli bir çalışmada, hücreden arındırma işlemi sırasında bir tuz tamponu ekledik ve bu da hem in vitro hem de in vivo ortamlarda gözlemlenen gelişmiş hücre bağlanmasına yol açtı16. Aynı çalışmada, bitki kaynaklı selüloz iskelelerin, iskelelerin yüzeyine hidrojeller dökülerek kompozit biyomalzemelerde uygulanabilirliğini gösterdik. Son çalışmalarda, bitki kaynaklı iskelelerin işlevselleştirilmesinin etkinliklerini arttırdığı gösterilmiştir18. Örneğin, Fontana ve ark. (2017), insan dermal fibroblastlarının yapışmasının RGD kaplı hücrelerden arındırılmış gövdeler tarafından desteklendiğini, oysa kaplanmamış gövdelerin aynı yeteneği sergilemediğini ortaya koymuştur18. Ayrıca, yazarlar ayrıca, modifiye edilmiş simüle edilmiş vücut sıvısının, hücrelerden arındırılmış bitki gövdelerini yapay olarak mineralize etmek için kullanılabileceğini gösterdiler. Daha yakın tarihli çalışmalarda, bitki kaynaklı selüloz iskelelerde mekanosensitif osteogenez kavramını araştırdık ve BTE17,20 için potansiyellerini değerlendirdik. Ayrıca, Lee ve ark. (2019), in vitro ortamda kemik benzeri dokuları yetiştirmek için bitki kaynaklı iskeleler kullandı21. Yazarlar, farklı bitki kaynaklarının kapsamlı değerlendirmeleri yoluyla, elma kaynaklı yapı iskelelerini, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) kültürü ve farklılaşması için en uygun yapı iskelesi olarak tanımladılar. Ayrıca yazarlar, elmadan elde edilen iskelelerin yapısal ve mekanik özelliklerinin, amaçlanan amaca uygunluklarında çok önemli bir rol oynadığını öne sürdüler. Doku mühendisliği uygulamalarında uygulanan ilk bitki kaynaklı iskeleler olan elma türevi iskelelerin, özellikle çapı 100 ila 200 μm arasında değişen birbirine bağlı gözenekleri açısından insan kemiğine çarpıcı bir şekilde benzer bir mimariye sahip olduğu kapsamlı bir şekilde gösterilmiştir14,21.

Bu çalışmada, BTE için elma türevi selüloz iskelelerin potansiyelini daha fazla araştırdık ve hem in vitro hem de in vivo mekanik özelliklerinin bir analizini gerçekleştirdik. BTE 17,20,21 için elma türevi iskelelerin potansiyeli üzerine çalışmalar yapılmış olmasına rağmen, mekanik özellikleri yeterince araştırılmamıştır. Sonuçlar, 4 hafta boyunca farklılaşma ortamında kültürlenen iskelelerde tohumlanan MC3T3-E1 preosteoblastlarının vahşi yayılım invazyonunu ve osteojenik farklılaşmasını gösterdi. Bu iskelelerin Young modülü 192.0 ± 16.6 kPa idi, bu da boş iskelelerden (tohumlu hücreler olmadan iskeleler) (31.6 ± 4.8 kPa) ve farklılaşma olmayan ortamda kültürlenen hücre tohumlu iskelelerden (24.1 ± 8.8 kPa) önemli ölçüde daha yüksekti. Bununla birlikte, Young'ın sağlıklı insan kemik dokusu modülünün tipik olarak trabeküler kemik için 0.1-2 GPa ve kortikal kemik8 için yaklaşık 15-20 GPa aralığında olduğuna dikkat edilmelidir. Bununla birlikte, bir kemirgen kalvarial defektinde 8 haftalık bir implantasyonun ardından, hücre tohumlu iskelelerin, itme testlerinde ortalama 113.6 N ± 18.2 N'lik bir tepe kuvveti ile gösterildiği gibi, çevredeki kemiğe iyi bir şekilde entegre olduğu görülmüştür, bu da daha önce bildirilen doğal kalvarial kemik22'nin kırık yüküne benzer. Genel olarak, bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, özellikle yük taşımayan uygulamalar için önemli bir umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, elmadan elde edilen selüloz iskeleler, şu anda bir implant bölgesinde çevreleyen kemik dokusunu tam olarak eşleştirmek için gerekli mekanik özelliklere sahip değildir. Sonuç olarak, bu iskelelerin tüm potansiyelini ortaya çıkarmak için daha fazla geliştirme yapılması gerekmektedir.

Protokol

Deney protokolleri, Ottawa Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. İskele hazırlığı

  1. McIntosh elmalarını (Canada Fancy) 8 mm kalınlığında dilimler halinde kesmek için bir mandolin dilimleyici kullanın. Elma dilimlerinin hipantyum dokusunu 5 mm x 5 mm kareler halinde kesin.
  2. Kare numuneleri 2 gün boyunca %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içine yerleştirin.
  3. Hücreleri giderilmiş numuneleri deiyonize suyla yıkayın ve kalan yüzey aktif maddeyi çıkarmak için gece boyunca oda sıcaklığında (RT) 100 mM CaCl2'de inkübe edin.
  4. Numuneleri (yani iskeleleri) 30 dakika boyunca %70 etanol içinde sterilize edin, deiyonize suyla yıkayın ve hücre tohumlamadan önce 24 oyuklu bir kültür plakasına yerleştirin.

2. Hücre kültürü ve iskele tohumlama

  1. MC3T3-E1 Subclone 4 hücrelerini hücre kültürü koşullarında (%95 hava ve %5CO2 nemlendirilmiş atmosferde 37°C) 10 cm çapında hücre kültürü ile muamele edilmiş kaplarda saklayın.
  2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Eagle'ın minimum esansiyel ortamı olan alfa modifikasyonundan (α-MEM) yapılmış hücre kültürü ortamını hazırlayın.
  3. Hücreleri,% 80 birleşmeye ulaştıklarında tripsinizasyon (% 0.05 tripsin-EDTA) ile kültür kaplarından ayırın.
  4. Hücre süspansiyonunu 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri α-MEM'de mL başına 2.5 x 107 hücrede yeniden süspanse edin.
  5. İskelelerin yüzeyine 40 μL'lik bir hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücrelerin hücre kültürü koşullarında 1 saat yapışmasına izin verin. Daha sonra, kültür plakasının her kültür kuyucuğuna 2 mL kültür ortamı ekleyin.
  6. Kültür ortamını 14 gün boyunca her 2-3 günde bir yenileyin.
  7. Daha önce tarif edilen hücre kültürü ortamına 50 μg/mL askorbik asit ve 4 mM sodyum fosfat ekleyerek bir farklılaşma ortamı hazırlayın.
  8. İskeleleri farklılaşma ortamında 4 hafta inkübe ederek MC3T3-E1 hücrelerinin farklılaşmasını indükleyin. Ortamı her 3-4 günde bir yenileyin. Buna paralel olarak, iskeleleri farklılaşmayan kültür ortamında (yani, farklılaşmayı indükleyecek takviyeler içermeyen ortamda) aynı süre boyunca, negatif bir kontrol olarak hizmet etmek için aynı ortam değişim programı ile inkübe edin.

3. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gözenek boyutu ölçümleri

  1. Hücresi giderilmiş elma türevi iskeleleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  2. İskeleleri 1 mL %10 (h/h) kalkoflor beyaz lekede karanlıkta RT'de 25 dakika inkübe edin.
  3. İskeleleri (n = 3) PBS ile yıkayın ve bir DAPI kanalı kullanarak 10x büyütmede yüksek hızlı rezonans konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile iskele başına rastgele seçilen üç alanı aşağıdaki gibi görüntüleyin:
    1. Lazer emisyon filtresi konfigürasyonu: 405 nm (lazer); 425-475 nm (emisyon)
    2. Optimum görüntü elde edilmesini sağlamak için lazer gücünü ve dedektörü manuel olarak ayarlayın. 5 μm adım boyutuna sahip 20 görüntüden oluşan bir z yığını elde edin.
  4. ImageJ yazılımını kullanarak, konfokal görüntüleri aşağıdaki gibi işleyin ve analiz edin:
    1. Bir görüntü oluşturmak için Z-Project to Maximum Intensity işlevini kullanın ve gözeneklerin kenarını vurgulamak için Kenarları Bul işlevini uygulayın.
    2. Serbest El Seçimi aracını kullanarak gözenekleri manuel olarak izleyin.
    3. Her gözeneği bir elips olarak yerleştirin, ana eksenin uzunluğunu ölçün, tüm ölçümleri derleyin (bu çalışmada toplam 54 - her iskele için rastgele seçilen 3 alanda 6) ve ortalama uzunluğu hesaplayın.

4. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak hücre dağılımı analizi

  1. Farklılaşma olmayan veya farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskeleleri PBS ile üç kez yıkayın. İskeleleri %4 paraformaldehit ile 10 dakika sabitleyin.
  2. Her iskeleyi deiyonize su ile iyice yıkayın, hücreleri Triton-X 100 solüsyonu ile 5 dakika geçirgen hale getirin ve tekrar PBS ile yıkayın.
  3. İskeleleri 1 mL %1 periyodik asit içinde 40 dakika inkübe edin ve deiyonize su14,16 ile durulayın.
  4. İskeleleri, 100 μg/mL propidyum iyodür ile desteklenmiş 100 mM sodyum metabisülfit ve 0.15 M hidroklorik asit içeren 1 mL çözelti içinde inkübe edin. İskeleleri tamamen çözeltiye daldırın.
  5. İskeleleri PBS ile yıkayın ve iskeleleri karanlıkta 10 dakika boyunca 5 mg / mL DAPI çözeltisinde inkübe ederek hücre çekirdeklerini boyayın. Görüntülemeden önce tekrar iyice yıkayın ve iskeleleri PBS'de saklayın.
  6. DAPI ve TRITC kanallarını kullanarak, 10x büyütmede yüksek hızlı rezonans CLSM ile üç farklı hücre tohumlu iskelenin rastgele seçilmiş üç yüzeyini aşağıdaki gibi görüntüleyin:
    1. Lazer emisyon filtresi konfigürasyonu:
      DAPI: Lazer: 405 nm; Emisyon: 425-475 nm
      TRITC: Lazer: 561 nm; Emisyon: 570-620 nm
    2. Optimum görüntü elde edilmesini sağlamak için lazer gücünü ve dedektörü manuel olarak ayarlayın. 5 μm adım boyutuna sahip 20 görüntüden oluşan bir z yığını elde edin.
  7. ImageJ yazılımını kullanarak eş odaklı görüntüleri işleyin ve Z-Project to Maximum Intensity (Maksimum Yoğunluğa Yansıtma ) işlevini kullanarak görüntü analizi için z ekseninde maksimum projeksiyon oluşturun.

5. Alkalen fosfataz analizi

  1. Farklılaşma olmayan veya farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskeleleri PBS ile üç kez yıkayın. İskeleleri 30 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin ile sabitleyin. Negatif kontrol görevi görmesi için boş iskeleleri (tohumlu hücreleri olmayan iskeleler) sabitleyin.
  2. Bir BCIP/NBT tabletini 10 mL deiyonize suda çözerek 5-bromo-4-kloro-3'-indolifosfat ve nitro-mavi tetrazolyum (BCIP/NBT) boyama solüsyonu hazırlayın.
  3. Sabit iskeleleri %0,05 Tween solüsyonu ile yıkayın ve RT'de 20 dakika boyunca BCIP/NBT solüsyonu ile boyayın. Lekeli iskeleleri %0,05 Tween solüsyonu ile yıkayın ve görüntülemeden önce PBS'de saklayın.
  4. Lekeli iskeleleri 12 megapiksel dijital kamerayla görüntüleyin.

6. Kalsiyum birikimi analizi

  1. Farklılaşma olmayan veya farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskeleleri PBS ile üç kez yıkayın. İskeleleri 30 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin ile sabitleyin. Negatif kontrol görevi görmesi için boş iskeleleri (tohumlu hücreleri olmayan iskeleler) sabitleyin.
  2. % 2 (a / h) alizarin kırmızısı S (ARS) boyama çözeltisi hazırlayın.
  3. Sabit iskeleleri deiyonize su ile yıkayın ve RT'de 1 saat ARS solüsyonu ile boyayın. Lekeli iskeleleri deiyonize su ile yıkayın ve görüntülemeden önce PBS'de saklayın.
  4. Lekeli iskeleleri 12 megapiksel dijital kamerayla görüntüleyin.

7. Mineralizasyon analizi

  1. Farklılaşma olmayan veya farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskeleleri PBS ile üç kez yıkayın. İskeleleri 48 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Negatif kontrol görevi görmesi için boş iskeleleri (tohumlu hücreleri olmayan iskeleler) sabitleyin.
  2. Numuneleri, daha önce tarif edildiği gibi, %50'den %100'e yükselen etanol konsantrasyonları içeren çözeltilerde dehidre edin23.
  3. Mineral agregalarını aşağıdaki gibi analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve enerji dağılımlı spektroskopi (EDS) gerçekleştirin:
    1. Numuneleri, üreticinin24 protokolünü izleyerek kritik nokta kurutucu kullanarak kurutun.
    2. Üreticinin25 protokolünü izleyerek altın püskürtmeli bir kaplayıcı kullanarak iskelelere 5 nm'lik bir altın kaplama uygulayın.
    3. İskelelerin yüzeyini 3x büyütmede 85 kV'a ayarlanmış bir taramalı elektron mikroskobu ile görüntüleyin.
    4. Taramalı elektron mikroskobunu 15 kV'a ayarlayarak EDS gerçekleştirin. İskele başına rastgele seçilen üç alanda, mineral agrega bileşimi analizi için EDS spektrumları elde edin.

8. Young modülü ölçümleri

  1. Hücre tohumlu iskeleleri ilgili inkübasyon ortamlarından çıkarın ve numuneleri hemen test edin.
  2. 1,5 N'luk bir yük hücresi ile donatılmış özel yapım tek eksenli bir sıkıştırma aparatı kullanarak, iskeleleri (koşul başına n = 3) 3 mm·dak-1 sabit bir hızda, iskele yüksekliğinin maksimum %10'u kadar bir basınç gerilimine sıkıştırın.
  3. Gerilim-gerinim eğrilerinin doğrusal kısmının eğiminden Young modülünü belirleyin. Bu çalışmada modül %9 ile %10 gerinim arasında belirlenmiştir.

9. Histoloji ile hücre infiltrasyonu ve mineralizasyon analizi: İn vitro iskeleler

  1. Farklılaşma olmayan veya farklılaşma ortamında kültürlenen hücre tohumlu iskeleleri PBS ile üç kez yıkayın.
  2. Hücre tohumlu iskeleleri, depolama için% 70 etanol içinde yeniden süspansiyon haline getirmeden önce 48 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
  3. Histoloji:
    NOT: Bu çalışmada, sonraki adımlarda açıklanan tüm histolojik hazırlık (gömme, kesit alma ve boyama) Louise Pelletier Histoloji Çekirdek Tesisi (Ottawa Üniversitesi) tarafından gerçekleştirilmiştir.
    1. Dehidrasyon ve parafine gömüldükten sonra, numuneleri iskelelerin 1 mm içinden başlayarak 5 μm kalınlığında seri kesitler halinde kesin ve kesitleri mikroskop slaytlarına monte edin.
    2. Bölümleri hematoksilen ve eozin (H & E) veya von Kossa (VK) boyaları ile boyayın.
    3. Kesitleri slayt tarayıcı mikroskobu ile 40x büyütmede görüntüleyin (bu çalışmada farklılaşma olmayan ortamda n = 1 iskele ve farklılaşma ortamında n = 2 iskele).
    4. ImageJ yazılımını kullanarak hücre infiltrasyonunu (H&E boyama) ve mineralizasyonu (VK boyama) görsel olarak değerlendirin.

10. Sıçan kalvarial defekt modeli

  1. Deneysel protokollerin yerel hayvan bakım komitesi tarafından gözden geçirilmesini ve onaylanmasını sağlayın.
  2. Yukarıda açıklanan Bölüm 1'i izleyerek ve 5 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanarak dairesel (1 mm çapında ve 1 mm kalınlığında) hücrelerden arındırılmış iskeleler hazırlayın.
  3. Aşağıdaki gibi belirlenmiş bir protokol26'yı izleyerek bilateral kraniotomi gerçekleştirin:
    1. Erkek Sprague-Dawley sıçanlarını izofluran ile uyuşturun, önce bilinçsiz olana kadar% 3'te ve daha sonra prosedür boyunca% 2-3'te.
    2. Bir neşter bıçağı kullanarak üstteki cildi keserek periost ve kafatasını ortaya çıkarın. Periosteum'u çıkarın.
    3. % 0.9 NaCl'lik sürekli sulama altında 5 mm çapında bir trephine ile donatılmış bir diş matkabı kullanarak sagital sütürün her iki tarafındaki parietal kemikte bilateral defektler oluşturun.
    4. Kemik parçalarını çıkarmak için çevredeki kemiği% 0.9 NaCl ile temizleyin.
    5. Dairesel, hücreden arındırılmış iskeleleri kusurlara yerleştirin.
    6. Üstteki cildi 4-0 dikişlerle kapatın.
  4. Sıçanlara yiyecek ve suya sınırsız erişim sağlayın ve onları günlük olarak izleyin.
  5. İmplantasyondan 8 hafta sonra, ikincil bir ötenazi önlemi olarak sıçanları CO2 inhalasyonu ve torasik perforasyon ile ötenazi yapın.
  6. Kafatasını ortaya çıkarmak ve implantları almak için, bir neşter bıçağı kullanarak kafatasını kaplayan deriyi çıkarın.
  7. Kafatasının üst kısmını tamamen çıkarmak için bir diş matkabı kullanarak kafatasını frontal ve oksipital kemiklerden ve her iki parietal kemiğin yanından kesin.

11. İtme testi

  1. USB veri toplama modülüne tek eksenli bir sıkıştırma cihazı (445 N yük hücresi ile) bağlayın.
  2. Veri toplama modülünü, bir veri toplama yazılımı uygulamasıyla donatılmış bir bilgisayara bağlayın.
  3. Kraniyal ekstraksiyondan hemen sonra, her bir numuneyi (bu çalışmada 4 hayvandan n = 7 implant), kemiğin dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde tek eksenli kompresyon cihazının numune tutucusuna yerleştirin.
  4. Çıkarılan implanta hafifçe dokunana kadar pistonu 0,5 mm/dk'da indirin.
  5. Veri toplama yazılımını kullanarak 0,5 mm/dak sabit hızda kompresyon uygularken pistonu tamamen dışarı itilene kadar implantın içinden indirerek testi başlatın.
  6. Veri toplama yazılımını kullanarak kuvvet ve yer değiştirme eğrisi üzerindeki tepe kuvvetini kaydedin.

12. Histoloji ile hücre infiltrasyonu ve mineralizasyon analizi: İn vivo iskeleler

  1. Ekstrakte edilen kalvaria ve implantları, depolama için% 70 etanol içinde yeniden süspansiyondan önce 72 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
  2. Histoloji:
    NOT: Bu çalışmada, sonraki adımlarda açıklanan tüm histolojik hazırlıklar (gömme, kesit alma ve boyama) Accel Labs (Montreal, QC, Kanada) tarafından gerçekleştirilmiştir.
    1. Numuneleri (metil metakrilat içine gömülü) üç farklı seviyede (üst, alt ve merkeze doğru) 6 μm kalınlığında bölümler halinde kesin ve mikroskop slaytlarına monte edin.
    2. Bölümleri H & E veya Masson-Goldner'ın trikrom (MGT) ile boyayın.
  3. Kesitleri slayt tarayıcı mikroskobu ile 40x büyütmede görüntüleyin (bu çalışmada 2 hayvandan 4 eksplant).
  4. ImageJ yazılımını kullanarak hücre infiltrasyonunu (H&E boyama) ve kollajen birikimini (MGT boyama) görsel olarak değerlendirin.

Sonuçlar

Gözenek büyüklüğü ölçümü, hücre dağılımı ve in vitro mineralizasyon (Şekil 1 ve Şekil 2)
Elma dokusu iskelelerinin doğal hücresel bileşenlerinin tamamen uzaklaştırılması, iskelelerin SDS ve CaCl2 ile muamele edilmesinden sonra elde edildi (Şekil 1A). İskeleler, konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanan oldukça gözenekli bir yapı sergiledi. Görüntülerin nicel...

Tartışmalar

Birkaç in vitro ve in vivo çalışma, bitki kaynaklı selülozun biyouyumluluğunu ve doku mühendisliğindepotansiyel kullanımını göstermiştir 14,15,16,18,19,20, daha spesifik olarak osteojenik farklılaşmaya ev sahipliği yapmak için 20,21...

Açıklamalar

Çıkar çatışması beyanı: M.L.L, M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. ve A.P., Ottawa Üniversitesi ve Spiderwort Inc. tarafından BTE uygulamaları için bitki kaynaklı selüloz kullanımına ilişkin patent başvurularının mucitleridir. M.L.L., R.J.H., C.M.C. ve A.P.'nin Spiderwort Inc.'de finansal çıkarları vardır.

Teşekkürler

Bu projenin finansmanı Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) (Discovery Grant) ve Li Ka Shing Vakfı tarafından sağlanmıştır. MLL, Ontario Mükemmeliyet Merkezleri TalentEdge programından destek aldı ve RJH, NSERC lisansüstü bursu ve Ontario Yüksek Lisans Bursu (OGS) ile desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4′,6-diamidino-2-phenylindoleThermoFisherD1306DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazoliumSigma-AldrichB5655BCIP/NBT
Alizarin red SSigma-AldrichA5533ARS
Ascorbic acidSigma-AldrichA4403Cell Culture
Calcium ChlorideThermoFisherAA12316CaCl2
Calcofluor WhiteSigma-Aldrich18909
Dental drillSurgical tool
EthanolThermoFisher615095000
Fetal bovine serumHyclone LaboratoriesSH30396FBS
FormalinSigma-AldrichHT50112810% Formalin
Goldner's trichrome stainSigma-Aldrich1.00485GTC
Hematoxylin and eosin stainFisher ScientificNC1470670H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscopeNikonNikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Irrigation salineBaxterJF71230.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cellsATCCCRL-2593Pre-osteoblast cells
McIntosh applesCanada Fancy grade
Methyl methacrylateSigma-AldrichM55909Histological embedding
Minimum Essential MediumThermoFisherM0894α-MEM
ParaformaldehydeFisher ScientificO40424%; PFA
Penicillin/StreptomycinHyclone LaboratoriesSV30010Cell Culture
Periodic acidSigma-Aldrich375810
Phosphate buffered salineHyclone Laboratories2810305PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodideInvitrogenp3566
Scanning electron microscopeJEOLJSM-7500F FESEMSEM and EDS
Slide scanner microscopeZeissAXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166SDS
Sodium metabisulphiteSigma-Aldrich31448
Sodium phosphateThermoFisherBP329
Sprague-Dawley ratsCharles-River Laboratories400Male
SuturesEthiconJ494G4-0
TrephineACE Surgical Supply Co583-01825-mm diameter
Triton-X 100ThermoFisher807423
TrypsinHyclone LaboratoriesSH30236.02Cell Culture
TweenFisher ScientificBP337
Universal compression DeviceCellScaleUniVert
Von Kossa stainSigma-Aldrich1.00362Histology

Referanslar

  1. Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
  2. Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
  3. Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
  4. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  5. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
  7. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
  8. Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
  9. Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
  10. Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
  11. Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
  12. Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
  13. Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
  14. Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835 (2014).
  15. Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  16. Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
  17. Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415 (2023).
  18. Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225 (2017).
  19. Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  20. Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030 (2022).
  21. Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194 (2019).
  22. Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
  23. Murtey, M. D., Ramasamy, P. . Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
  24. . . tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , (2022).
  25. . . Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , (2023).
  26. Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
  27. Leblanc Latour, M. . Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , (2023).
  28. Kodama, H. -. A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
  29. Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
  30. Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
  31. Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
  32. Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır