In Vitro ve In Vivo Kemik Doku Mühendisliği için Hücrelerden Arındırılmış Elma Türevi İskeleler

Özet

Bu çalışmada, bitki bazlı biyomalzemelerin hücre çözme, fiziksel karakterizasyon, görüntüleme ve in vivo implantasyon yöntemlerinin yanı sıra yapı iskelelerinde hücre tohumlama ve farklılaşma yöntemlerini detaylandırıyoruz. Açıklanan yöntemler, kemik dokusu mühendisliği uygulamaları için bitki bazlı biyomalzemelerin değerlendirilmesine izin verir.

Özet

Bitki kaynaklı selüloz biyomalzemeleri çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmıştır. İn vivo çalışmalar, doğal kaynaklardan elde edilen selülozdan yapılmış iskelelerin dikkate değer biyouyumluluğunu göstermiştir. Ek olarak, bu iskeleler, birden fazla doku için geçerli olan yapısal özelliklere sahiptir ve memeli hücrelerinin istilasını ve çoğalmasını teşvik eder. Hücreden arındırılmış elma hipantyum dokusu kullanılarak yapılan son araştırmalar, gözenek boyutunun trabeküler kemiğe benzerliğini ve osteojenik farklılaşmayı etkili bir şekilde destekleme yeteneğini göstermiştir. Bu çalışmada ayrıca kemik dokusu mühendisliği (BTE) uygulamaları için elma türevli selüloz iskelelerin potansiyeli incelenmiş ve bunların in vitro ve in vivo mekanik özellikleri değerlendirilmiştir. MC3T3-E1 preosteoblastları, daha sonra osteojenik potansiyelleri ve mekanik özellikleri açısından değerlendirilen elma türevli selüloz iskelelere ekildi. Alkalen fosfataz ve alizarin kırmızısı S boyaması, diferansiyasyon ortamında kültürlenen iskelelerde osteojenik farklılaşmayı doğruladı. Histolojik inceleme, iskeleler boyunca yaygın hücre invazyonu ve mineralizasyonu gösterdi. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), iskelelerin yüzeyinde mineral agregaları ortaya çıkardı ve enerji dağıtıcı spektroskopi (EDS), fosfat ve kalsiyum elementlerinin varlığını doğruladı. Bununla birlikte, hücre farklılaşmasını takiben Young modülünde önemli bir artışa rağmen, sağlıklı kemik dokusundan daha düşük kalmıştır. İn vivo çalışmalar, sıçan kalvarisinde 8 haftalık implantasyondan sonra hücre infiltrasyonu ve hücre dışı matriksin hücre dışı matriks birikimi gösterdi. Ek olarak, iskeleleri kemik defektinden çıkarmak için gereken kuvvet, daha önce bildirilen doğal kalvarial kemiğin kırık yüküne benzerdi. Genel olarak, bu çalışma, elma türevi selülozun BTE uygulamaları için umut verici bir aday olduğunu doğrulamaktadır. Bununla birlikte, mekanik özellikleri ile sağlıklı kemik dokusununkiler arasındaki farklılık, uygulanmasını düşük yük taşıma senaryolarıyla sınırlayabilir. Yük taşıma uygulamaları için elmadan elde edilen selüloz iskelelerin mekanik özelliklerini geliştirmek için ek yapısal yeniden mühendislik ve optimizasyon gerekebilir.

Giriş

Bir yaralanma veya hastalığın neden olduğu büyük kemik kusurları, tam rejenerasyon için genellikle biyomateryal greftleri gerektirir¹. Kemik dokusu rejenerasyonunu iyileştirmek için tasarlanmış mevcut teknikler düzenli olarak otolog, allojeneik, ksenojenik veya sentetik greftler kullanır². Büyük kemik kusurlarını onarmak için "altın standart" greftleme uygulaması olarak kabul edilen otolog kemik grefti için hastadan kemik çıkarılır. Bununla birlikte, bu aşılama prosedürünün boyut ve şekil sınırlamaları, doku mevcudiyeti ve örnekleme bölgesi morbiditesi dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları vardır³

Protokol

Deney protokolleri, Ottawa Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. İskele hazırlığı

1. McIntosh elmalarını (Canada Fancy) 8 mm kalınlığında dilimler halinde kesmek için bir mandolin dilimleyici kullanın. Elma dilimlerinin hipantyum dokusunu 5 mm x 5 mm kareler halinde kesin.
2. Kare numuneleri 2 gün boyunca %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içine yerleştirin.
3. Hücreleri giderilmiş numuneleri deiyonize suyla yıkayın ve kalan yüzey aktif maddeyi çıkarmak için gece boyunca oda sıcaklığında (RT) 100 mM CaCl_2'de inkübe edin.
4. Numuneleri (yani iskel....

Tartışmalar

Birkaç in vitro ve in vivo çalışma, bitki kaynaklı selülozun biyouyumluluğunu ve doku mühendisliğinde^{potansiyel kullanımını göstermiştir 14,15,16,18,19,20}, daha spesifik olarak osteojenik farklılaşmaya ev sahipliği yapmak için ^20,21.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology