Dezellularisierte aus Äpfeln gewonnene Gerüste für das Bone Tissue Engineering in vitro und in vivo

Zusammenfassung

In dieser Studie beschreiben wir Methoden der Dezellularisierung, der physikalischen Charakterisierung, der Bildgebung und der in vivo Implantation von pflanzlichen Biomaterialien sowie Methoden zur Zellaussaat und Differenzierung in den Scaffolds. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Evaluierung von pflanzlichen Biomaterialien für Anwendungen im Bone Tissue Engineering.

Zusammenfassung

Pflanzliche Zellulose-Biomaterialien werden in verschiedenen Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt. In-vivo-Studien haben die bemerkenswerte Biokompatibilität von Scaffolds aus Zellulose aus natürlichen Quellen gezeigt. Darüber hinaus besitzen diese Gerüste strukturelle Eigenschaften, die für mehrere Gewebe relevant sind, und sie fördern die Invasion und Proliferation von Säugetierzellen. Neuere Forschungen mit dezellularisiertem Apfelhypanthium-Gewebe haben die Ähnlichkeit seiner Porengröße mit der von trabekulärem Knochen sowie seine Fähigkeit, die osteogene Differenzierung effektiv zu unterstützen, gezeigt. In der vorliegenden Studie wurde das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für Anwendungen im Bereich Bone Tissue Engineering (HdO) untersucht und ihre mechanischen Eigenschaften in vitro und in vivo bewertet. MC3T3-E1-Präosteoblasten wurden in aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten ausgesät, die dann auf ihr osteogenes Potenzial und ihre mechanischen Eigenschaften untersucht wurden. Die alkalische Phosphatase und die Alizarinrot-S-Färbung bestätigten die osteogene Differenzierung in Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Die histologische Untersuchung zeigte eine weit verbreitete Zellinvasion und Mineralisierung über die Scaffolds hinweg. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte mineralische Aggregate auf der Oberfläche der Gerüste, und die energiedispersive Spektroskopie (EDS) bestätigte das Vorhandensein von Phosphat- und Kalziumelementen. Trotz eines signifikanten Anstiegs des Elastizitätsmoduls nach der Zelldifferenzierung blieb er jedoch niedriger als der von gesundem Knochengewebe. In-vivo-Studien zeigten die Zellinfiltration und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix innerhalb der dezellularisierten Apfelgerüste nach 8-wöchiger Implantation in die Schädelknochen der Ratte. Darüber hinaus war die Kraft, die erforderlich war, um die Gerüste aus dem Knochendefekt zu entfernen, vergleichbar mit der zuvor berichteten Frakturbelastung des nativen Schädelknochens. Insgesamt bestätigt diese Studie, dass aus Äpfeln gewonnene Zellulose ein vielversprechender Kandidat für HdO-Anwendungen ist. Die Unähnlichkeit zwischen seinen mechanischen Eigenschaften und denen von gesundem Knochengewebe kann seine Anwendung jedoch auf Szenarien mit geringer Belastung beschränken. Zusätzliche strukturelle Umgestaltungen und Optimierungen können erforderlich sein, um die mechanischen Eigenschaften von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für tragende Anwendungen zu verbessern.

Einleitung

Große Knochendefekte, die durch eine Verletzung oder Krankheit verursacht werden, erfordern oft Biomaterialtransplantate für eine vollständige Regeneration¹. Derzeitige Techniken zur Verbesserung der Regeneration von Knochengewebe verwenden regelmäßig autologe, allogene, xenogene oder synthetische Transplantate². Bei der autologen Knochentransplantation, die als "Goldstandard" zur Reparatur großer Knochendefekte gilt, wird dem Patienten Knochen entnommen. Dieses Transplantationsverfahren hat jedoch mehrere Nachteile, darunter Größen- und Formbeschränkungen, Gewebeverfügbarkeit und Morbidität an der Probenahmestelle

Protokoll

Die Versuchsprotokolle wurden vom Tierschutzausschuss der Universität Ottawa geprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung des Gerüsts

1. McIntosh-Äpfel (Canada Fancy) mit einem Mandolinenhobel in 8 mm dicke Scheiben schneiden. Das Hypanthiumgewebe der Apfelscheiben in 5 mm x 5 mm große Quadrate schneiden.
2. Die quadratischen Proben werden 2 Tage lang in 0,1%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) gelegt.
3. Waschen Sie die dezellularisierten Proben mit deionisiertem Wasser und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur (RT) in 100 mM CaCl₂, um das restliche Tensid zu entfernen.
4. Sterilisier....

Diskussion

Mehrere In-vitro- und In-vivo-Studien haben die Biokompatibilität von pflanzlicher Cellulose und ihre potenzielle Verwendung im Tissue Engineering^{nachgewiesen 14,15,16,18,19,20}, insbesondere für die osteogene Differenzierung^20,21. Ziel der vorliege.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology