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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie beschreiben wir Methoden der Dezellularisierung, der physikalischen Charakterisierung, der Bildgebung und der in vivo Implantation von pflanzlichen Biomaterialien sowie Methoden zur Zellaussaat und Differenzierung in den Scaffolds. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Evaluierung von pflanzlichen Biomaterialien für Anwendungen im Bone Tissue Engineering.

Zusammenfassung

Pflanzliche Zellulose-Biomaterialien werden in verschiedenen Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt. In-vivo-Studien haben die bemerkenswerte Biokompatibilität von Scaffolds aus Zellulose aus natürlichen Quellen gezeigt. Darüber hinaus besitzen diese Gerüste strukturelle Eigenschaften, die für mehrere Gewebe relevant sind, und sie fördern die Invasion und Proliferation von Säugetierzellen. Neuere Forschungen mit dezellularisiertem Apfelhypanthium-Gewebe haben die Ähnlichkeit seiner Porengröße mit der von trabekulärem Knochen sowie seine Fähigkeit, die osteogene Differenzierung effektiv zu unterstützen, gezeigt. In der vorliegenden Studie wurde das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für Anwendungen im Bereich Bone Tissue Engineering (HdO) untersucht und ihre mechanischen Eigenschaften in vitro und in vivo bewertet. MC3T3-E1-Präosteoblasten wurden in aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten ausgesät, die dann auf ihr osteogenes Potenzial und ihre mechanischen Eigenschaften untersucht wurden. Die alkalische Phosphatase und die Alizarinrot-S-Färbung bestätigten die osteogene Differenzierung in Scaffolds, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Die histologische Untersuchung zeigte eine weit verbreitete Zellinvasion und Mineralisierung über die Scaffolds hinweg. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte mineralische Aggregate auf der Oberfläche der Gerüste, und die energiedispersive Spektroskopie (EDS) bestätigte das Vorhandensein von Phosphat- und Kalziumelementen. Trotz eines signifikanten Anstiegs des Elastizitätsmoduls nach der Zelldifferenzierung blieb er jedoch niedriger als der von gesundem Knochengewebe. In-vivo-Studien zeigten die Zellinfiltration und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix innerhalb der dezellularisierten Apfelgerüste nach 8-wöchiger Implantation in die Schädelknochen der Ratte. Darüber hinaus war die Kraft, die erforderlich war, um die Gerüste aus dem Knochendefekt zu entfernen, vergleichbar mit der zuvor berichteten Frakturbelastung des nativen Schädelknochens. Insgesamt bestätigt diese Studie, dass aus Äpfeln gewonnene Zellulose ein vielversprechender Kandidat für HdO-Anwendungen ist. Die Unähnlichkeit zwischen seinen mechanischen Eigenschaften und denen von gesundem Knochengewebe kann seine Anwendung jedoch auf Szenarien mit geringer Belastung beschränken. Zusätzliche strukturelle Umgestaltungen und Optimierungen können erforderlich sein, um die mechanischen Eigenschaften von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für tragende Anwendungen zu verbessern.

Einleitung

Große Knochendefekte, die durch eine Verletzung oder Krankheit verursacht werden, erfordern oft Biomaterialtransplantate für eine vollständige Regeneration1. Derzeitige Techniken zur Verbesserung der Regeneration von Knochengewebe verwenden regelmäßig autologe, allogene, xenogene oder synthetische Transplantate2. Bei der autologen Knochentransplantation, die als "Goldstandard" zur Reparatur großer Knochendefekte gilt, wird dem Patienten Knochen entnommen. Dieses Transplantationsverfahren hat jedoch mehrere Nachteile, darunter Größen- und Formbeschränkungen, Gewebeverfügbarkeit und Morbidität an der Probenahmestelle3. Darüber hinaus sind autologe Transplantationsverfahren anfällig für Infektionen an der Operationsstelle, nachfolgende Frakturen, Hämatombildung an der Probenentnahme oder rekonstruierten Stelle und postoperative Schmerzen4. Das Bone Tissue Engineering (HdO) bietet eine potenzielle Alternative zu herkömmlichen Knochentransplantationsmethoden5. Es kombiniert strukturelle Biomaterialien und Zellen, um neues funktionelles Knochengewebe aufzubauen. Bei der Entwicklung von Biomaterialien für HdO ist es entscheidend, eine makroporöse Struktur, eine Oberflächenchemie, die die Zellanhaftung fördert, und mechanische Eigenschaften, die denen von nativem Knochen sehr ähnlich sind, zu kombinieren6. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die ideale Porengröße und der ideale Elastizitätsmodul für Biomaterialien, die in HdO verwendet werden, etwa 100-200 μm7 bzw. 0,1-20 GPa betragen, abhängig von der Transplantationsstelle8. Darüber hinaus sind die Porosität und die Poreninterkonnektivität der Gerüste entscheidende Faktoren, die die Zellmigration, die Nährstoffdiffusion und die Angiogenese beeinflussen8.

HdO hat vielversprechende Ergebnisse mit verschiedenen Biomaterialien gezeigt, die als Alternative zu Knochentransplantaten entwickelt und bewertet wurden. Einige dieser Biomaterialien sind osteoinduktive Materialien, Hybridmaterialien und fortschrittliche Hydrogele8. Osteoinduktive Materialien stimulieren die Entwicklung neu gebildeter Knochenstrukturen. Hybridmaterialien bestehen aus synthetischen und/oder natürlichen Polymeren8. Fortschrittliche Hydrogele ahmen die extrazelluläre Matrix (EZM) nach und sind in der Lage, die notwendigen bioaktiven Faktoren zur Förderung der Integration von Knochengewebe zu liefern8. Hydroxylapatit ist ein traditionelles Material und aufgrund seiner Zusammensetzung und Biokompatibilität eine gängige Wahl für HdO9. Bioaktives Glas ist eine weitere Art von Biomaterial für HdO, von dem gezeigt wurde, dass es spezifische Zellantworten stimuliert, um Gene zu aktivieren, die für die Osteogenese notwendig sind10,11. Biologisch abbaubare Polymere, einschließlich Polyglykolsäure und Polymilchsäure, werden ebenfalls in großem Umfang in HdO-Anwendungen eingesetzt12. Schließlich haben auch natürliche oder natürlich gewonnene Polymere wie Chitosan, Chitin und bakterielle Zellulose ermutigende Ergebnisse für HdO13 gezeigt. Während jedoch sowohl synthetische als auch natürliche Polymere Potenzial für HdO aufweisen, erfordert die Entwicklung eines funktionellen Gerüsts mit der gewünschten Makrostruktur in der Regel umfangreiche Protokolle.

Umgekehrt können native makroskopische Zellulosestrukturen leicht aus verschiedenen Pflanzen abgeleitet werden, und unsere Forschungsgruppe hat bereits die Anwendbarkeit von zellulosebasierten Scaffolds aus Pflanzen auf verschiedene Geweberekonstruktionen gezeigt. In der Tat haben wir uns nach einer einfachen Tensidbehandlung die inhärente Struktur des Pflanzenmaterials zunutze gemacht und sein Potenzial als vielseitiges Biomaterial hervorgehoben14. Darüber hinaus können diese Scaffolds auf Zellulosebasis für In-vitro-Anwendungen in Säugetierzellkulturenverwendet werden 14, sind biokompatibel und unterstützen die spontane subkutane Vaskularisierung 14,15,16,17. Sowohl unsere Forschungsgruppe als auch andere haben gezeigt, dass diese Gerüste aus bestimmten Pflanzen gewonnen werden können, je nach beabsichtigter Anwendung 14,15,16,17,18,19,20. Zum Beispiel weist die in Pflanzenstängeln und -blättern beobachtete Gefäßstruktur eine auffallende Ähnlichkeit mit der Struktur auf, die in tierischen Geweben gefunden wurde19. Darüber hinaus können aus Pflanzen gewonnene Zellulosegerüste leicht geformt und biochemischen Oberflächenmodifikationen unterzogen werden, um die gewünschten Eigenschaften zu erreichen16. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir während des Dezellularisierungsprozesses einen Salzpuffer eingebaut, was zu einer verstärkten Zelladhäsion führte, die sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet wurde16. In der gleichen Studie haben wir die Anwendbarkeit von pflanzlichen Zellulosegerüsten in Verbundbiomaterialien nachgewiesen, indem wir Hydrogele auf die Oberfläche der Gerüste gegossen haben. In neueren Studien wurde gezeigt, dass die Funktionalisierung von pflanzlichen Scaffolds deren Wirksamkeit erhöht18. Eine Studie von Fontana et al. (2017) ergab beispielsweise, dass die Adhäsion menschlicher dermaler Fibroblasten durch RGD-beschichtete dezellularisierte Stängel unterstützt wurde, während unbeschichtete Stängel nicht die gleiche Fähigkeit aufwiesen18. Darüber hinaus zeigten die Autoren, dass modifizierte simulierte Körperflüssigkeit verwendet werden kann, um dezellularisierte Pflanzenstängel künstlich zu mineralisieren. In neueren Studien untersuchten wir das Konzept der mechanosensitiven Osteogenese in pflanzlichen Zellulosegerüsten und bewerteten ihr Potenzial für HdO 17,20. Darüber hinaus verwendeten Lee et al. (2019) pflanzliche Gerüste, um knochenähnliches Gewebe in einer In-vitro-Umgebung zu kultivieren21. Durch umfassende Auswertungen verschiedener pflanzlicher Quellen identifizierten die Autoren aus Äpfeln gewonnene Gerüste als die optimalsten für die Kultivierung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs). Darüber hinaus schlugen die Autoren vor, dass die strukturellen und mechanischen Eigenschaften der aus Äpfeln gewonnenen Gerüste eine entscheidende Rolle für ihre Eignung für den beabsichtigten Zweck spielen. Als erste pflanzliche Gerüste, die in Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt wurden, wurde ausführlich gezeigt, dass aus Äpfeln gewonnene Scaffolds eine auffallend ähnliche Architektur wie menschliche Knochen besitzen, insbesondere in Bezug auf ihre miteinander verbundenen Poren mit einem Durchmesser von 100 bis 200 μm14,21.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Zellulosegerüsten für HdO und führten eine Analyse ihrer mechanischen Eigenschaften sowohl in vitro als auch in vivo durch. Obwohl es Studien über das Potenzial von aus Äpfeln gewonnenen Gerüsten für HdO 17,20,21 gibt, wurden ihre mechanischen Eigenschaften nur unzureichend untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Wildspread-Invasion und osteogene Differenzierung von MC3T3-E1-Präosteoblasten, die in Gerüsten ausgesät wurden, die 4 Wochen lang in Differenzierungsmedium kultiviert wurden. Der Elastizitätsmodul dieser Scaffolds betrug 192,0 ± 16,6 kPa und war damit signifikant höher als der der Blank-Scaffolds (Scaffolds ohne ausgesäte Zellen) (31,6 ± 4,8 kPa) und der zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungsmedium kultiviert wurden (24,1 ± 8,8 kPa). Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Elastizitätsmodul von gesundem menschlichem Knochengewebe typischerweise im Bereich von 0,1-2 GPa für trabekulären Knochen und etwa 15-20 GPa für kortikalen Knochen8 liegt. Nichtsdestotrotz schienen nach einer 8-wöchigen Implantation in einen Schädelkrebsdefekt bei Nagetieren die zellbesiedelten Gerüste gut in den umgebenden Knochen integriert zu sein, wie eine durchschnittliche Spitzenkraft von 113,6 N ± 18,2 N in Push-out-Tests zeigte, was der zuvor berichteten Frakturlast des nativen Schädelknochens ähnelt22. Insgesamt sind die Ergebnisse dieser Studie vielversprechend, insbesondere für nicht-tragende Anwendungen. Aus Äpfeln gewonnene Zellulosegerüste verfügen jedoch derzeit nicht über die notwendigen mechanischen Eigenschaften, um das umgebende Knochengewebe an einer Implantatstelle genau anzupassen. Folglich ist eine weitere Entwicklung erforderlich, um das volle Potenzial dieser Gerüste auszuschöpfen.

Protokoll

Die Versuchsprotokolle wurden vom Tierschutzausschuss der Universität Ottawa geprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung des Gerüsts

  1. McIntosh-Äpfel (Canada Fancy) mit einem Mandolinenhobel in 8 mm dicke Scheiben schneiden. Das Hypanthiumgewebe der Apfelscheiben in 5 mm x 5 mm große Quadrate schneiden.
  2. Die quadratischen Proben werden 2 Tage lang in 0,1%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) gelegt.
  3. Waschen Sie die dezellularisierten Proben mit deionisiertem Wasser und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur (RT) in 100 mM CaCl2, um das restliche Tensid zu entfernen.
  4. Sterilisieren Sie die Proben (d. h. Gerüste) 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol, waschen Sie sie mit deionisiertem Wasser und legen Sie sie vor der Zellaussaat in eine 24-Well-Kulturplatte.

2. Zellkultur und Gerüstaussaat

  1. Halten Sie MC3T3-E1 Subclone 4 Zellen in mit Zellkulturen behandelten Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm unter Zellkulturbedingungen (37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2) auf.
  2. Bereiten Sie ein Zellkulturmedium aus dem minimalen essentiellen Medium von Eagle vor - Alpha-Modifikation (α-MEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin.
  3. Lösen Sie die Zellen durch Trypsinisierung (0,05 % Trypsin-EDTA) von den Kulturschalen, sobald sie 80 % Konfluenz erreicht haben.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei ca. 200 x g für 3 min. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in α-MEM bei 2,5 x 107 Zellen pro ml.
  5. Pipettieren Sie ein 40-μl-Aliquot der Zellsuspension auf die Oberfläche der Gerüste und lassen Sie die Zellen 1 h lang unter Zellkulturbedingungen haften. Anschließend werden 2 ml Nährmedium in jede Vertiefung der Kulturplatte gegeben.
  6. Füllen Sie das Nährmedium 14 Tage lang alle 2-3 Tage auf.
  7. Bereiten Sie ein Differenzierungsmedium vor, indem Sie 50 μg/ml Ascorbinsäure und 4 mM Natriumphosphat zu dem zuvor beschriebenen Zellkulturmedium hinzufügen.
  8. Induzieren Sie die Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen, indem Sie die Gerüste 4 Wochen lang in Differenzierungsmedium inkubieren. Füllen Sie das Medium alle 3-4 Tage auf. Parallel dazu werden Gerüste in Nicht-Differenzierungskulturmedium (d. h. Medium ohne die Zusätze zur Induktion der Differenzierung) für die gleiche Dauer mit dem gleichen Mediumwechselplan inkubiert, um als Negativkontrolle zu dienen.

3. Porengrößenmessung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie

  1. Waschen Sie die dezellularisierten Gerüste aus Äpfeln mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Inkubieren Sie die Scaffolds in 1 ml 10%iger (v/v) Calcofluor-Weißfärbung für 25 Minuten im Dunkeln bei RT.
  3. Waschen Sie die Gerüste (n = 3) mit PBS und bilden Sie drei zufällig ausgewählte Bereiche pro Gerüst mit einem resonanten konfokalen Hochgeschwindigkeits-Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) mit 10-facher Vergrößerung unter Verwendung eines DAPI-Kanals wie folgt ab:
    1. Konfiguration des Laseremissionsfilters: 405 nm (Laser); 425-475 nm (Emission)
    2. Stellen Sie die Laserleistung und den Detektor manuell ein, um eine optimale Bildaufnahme zu gewährleisten. Erfassen Sie einen Z-Stack mit 20 Bildern mit einer Schrittweite von 5 μm.
  4. Verarbeiten und analysieren Sie die konfokalen Bilder mit der ImageJ-Software wie folgt:
    1. Verwenden Sie die Funktion "Z-Projektion auf maximale Intensität ", um ein Bild zu erstellen, und wenden Sie die Funktion "Kanten suchen " an, um den Rand der Poren hervorzuheben.
    2. Zeichnen Sie die Poren manuell mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug nach.
    3. Passen Sie jede Pore als Ellipse an, messen Sie die Länge der Hauptachse, stellen Sie alle Messungen zusammen (insgesamt 54 in der vorliegenden Studie - 6 in 3 zufällig ausgewählten Bereichen für jedes Gerüst) und berechnen Sie die durchschnittliche Länge.

4. Zellverteilungsanalyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie

  1. Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 4% Paraformaldehyd für 10 min.
  2. Waschen Sie jedes Gerüst gründlich mit deionisiertem Wasser, permeabilisieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einer Triton-X 100-Lösung und waschen Sie sie erneut mit PBS.
  3. Die Scaffolds werden 40 Minuten lang in 1 ml 1%iger Periodsäure inkubiert und mit deionisiertem Wasser14,16 gespült.
  4. Die Gerüste werden in 1 ml einer Lösung mit 100 mM Natriummetabisulfit und 0,15 M Salzsäure, ergänzt mit 100 μg/ml Propidiumiodid, inkubiert. Tauchen Sie die Gerüste vollständig in die Lösung ein.
  5. Waschen Sie die Scaffolds mit PBS und färben Sie die Zellkerne, indem Sie die Scaffolds 10 Minuten lang im Dunkeln in einer 5 mg/ml DAPI-Lösung inkubieren. Waschen Sie die Gerüste vor der Bildgebung noch einmal gründlich und lagern Sie sie in PBS.
  6. Bilden Sie drei zufällig ausgewählte Oberflächen von drei verschiedenen zellbesiedelten Gerüsten mit einem resonanten Hochgeschwindigkeits-CLSM bei 10-facher Vergrößerung unter Verwendung von DAPI- und TRITC-Kanälen wie folgt ab:
    1. Konfiguration des Laseremissionsfilters:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emission: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emission: 570-620 nm
    2. Stellen Sie die Laserleistung und den Detektor manuell ein, um eine optimale Bildaufnahme zu gewährleisten. Erfassen Sie einen Z-Stack mit 20 Bildern mit einer Schrittweite von 5 μm.
  7. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die konfokalen Bilder zu verarbeiten und eine maximale Projektion in der Z-Achse für die Bildanalyse mit der Funktion Z-Projekt auf maximale Intensität zu erstellen.

5. Analyse der alkalischen Phosphatase

  1. Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 10% neutralem gepuffertem Formalin für 30 min. Fixieren Sie leere Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen), die als Negativkontrolle dienen.
  2. Bereiten Sie eine Färbelösung für 5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat und Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT) vor, indem Sie eine BCIP/NBT-Tablette in 10 ml entionisiertem Wasser auflösen.
  3. Waschen Sie die festen Gerüste mit einer 0,05%igen Tween-Lösung und färben Sie sie 20 Minuten lang bei RT mit der BCIP/NBT-Lösung. Waschen Sie die gefärbten Gerüste mit einer 0,05%igen Tween-Lösung und lagern Sie sie vor der Bildgebung in PBS.
  4. Stellen Sie sich die fleckigen Gerüste mit einer 12-Megapixel-Digitalkamera vor.

6. Analyse der Kalziumablagerungen

  1. Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 10% neutralem gepuffertem Formalin für 30 min. Fixieren Sie leere Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen), die als Negativkontrolle dienen.
  2. Bereiten Sie eine 2%ige (w/v) Alizarinrot S (ARS)-Färbelösung vor.
  3. Waschen Sie die festen Gerüste mit deionisiertem Wasser und färben Sie sie mit der ARS-Lösung für 1 h bei RT. Waschen Sie die gefärbten Gerüste mit deionisiertem Wasser und lagern Sie sie vor der Bildgebung in PBS.
  4. Stellen Sie sich die fleckigen Gerüste mit einer 12-Megapixel-Digitalkamera vor.

7. Analyse der Mineralisierung

  1. Die zellbesiedelten Scaffolds, die im Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Fixieren Sie die Gerüste mit 4% Paraformaldehyd für 48 h. Fixieren Sie leere Gerüste (Gerüste ohne ausgekeimte Zellen), die als Negativkontrolle dienen.
  2. Die Proben werden in Lösungen dehydriert, die Ethanolkonzentrationen enthalten, die von 50 % auf 100 % ansteigen, wie zuvor beschrieben23.
  3. Führen Sie Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersive Spektroskopie (EDS) durch, um Mineralaggregate wie folgt zu analysieren:
    1. Trocknen Sie die Proben mit einem kritischen Punkttrockner gemäß dem Protokoll des Herstellers24.
    2. Tragen Sie eine 5-nm-Goldschicht mit einem Goldsputter-Coater gemäß dem Protokoll des Herstellers25 auf die Gerüste auf.
    3. Bilden Sie die Oberfläche der Gerüste mit einem Rasterelektronenmikroskop ab, das auf 3 kV eingestellt ist, mit 85-facher Vergrößerung.
    4. Führen Sie EDS durch, indem Sie das Rasterelektronenmikroskop auf 15 kV einstellen. Erfassen Sie auf drei zufällig ausgewählten Bereichen pro Gerüst EDS-Spektren für die Analyse der Zusammensetzung von Mineralaggregaten.

8. Messungen des Elastizitätsmoduls

  1. Entfernen Sie die zellbesiedelten Gerüste aus ihrem jeweiligen Inkubationsmedium und testen Sie die Proben sofort.
  2. Mit einer speziell angefertigten einachsigen Druckvorrichtung, die mit einer 1,5-N-Wägezelle ausgestattet ist, werden die Gerüste (n = 3 pro Bedingung) mit einer konstanten Geschwindigkeit von 3 mm·min-1 auf eine maximale Druckdehnung von 10 % der Gerüsthöhe zusammengedrückt.
  3. Bestimmen Sie den Elastizitätsmodul aus der Steigung des linearen Teils der Spannungs-Dehnungs-Kurven. In der vorliegenden Studie wurde der Modul zwischen 9% und 10% Dehnung bestimmt.

9. Analyse der Zellinfiltration und Mineralisierung durch Histologie: In-vitro-Scaffolds

  1. Die zellbesiedelten Scaffolds, die in Nicht-Differenzierungs- oder Differenzierungsmedium kultiviert wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen.
  2. Fixieren Sie die zellbesiedelten Gerüste 48 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd, bevor sie zur Lagerung in 70 % Ethanol resuspendiert werden.
  3. Histologie:
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde die gesamte histologische Präparation (Einbettung, Schnitt und Färbung), die in den nächsten Schritten beschrieben wird, von der Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa) durchgeführt.
    1. Nach der Dehydratisierung und dem Einbetten in Paraffin schneiden Sie die Proben in 5 μm dicke Serienschnitte, beginnend 1 mm innerhalb der Gerüste, und montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern.
    2. Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) oder von-Kossa- (VK) Färben.
    3. Abbildung der Schnitte mit einem Objektträger-Scanner-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung (n = 1 Gerüst im Nicht-Differenzierungsmedium und n = 2 Gerüste im Differenzierungsmedium in der vorliegenden Studie).
    4. Mit der ImageJ-Software können Sie die Zellinfiltration (H&E-Färbung) und die Mineralisierung (VK-Färbung) visuell auswerten.

10. Modell des Schädeldachdefekts der Ratte

  1. Lassen Sie die Versuchsprotokolle vom örtlichen Tierschutzausschuss überprüfen und genehmigen.
  2. Bereiten Sie kreisförmige (5 mm Durchmesser und 1 mm Dicke) dezellularisierte Gerüste gemäß Abschnitt 1 oben beschrieben und verwenden Sie eine 5-mm-Biopsiestanze.
  3. Führen Sie eine bilaterale Kraniotomie nach einem festgelegten Protokoll26 wie folgt durch:
    1. Betäuben Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit Isofluran, zuerst bei 3 % bis zur Bewusstlosigkeit und dann bei 2-3 % während des gesamten Eingriffs.
    2. Legen Sie die Knochenhaut und den Schädel frei, indem Sie die darüber liegende Haut mit einer Skalpellklinge abschneiden. Entferne die Knochenhaut.
    3. Erzeugen Sie bilaterale Defekte in beiden Scheitelknochen auf jeder Seite der sagittalen Naht mit einem Dentalbohrer, der mit einem Trepan mit einem Durchmesser von 5 mm unter konstanter Spülung von 0,9 % NaCl ausgestattet ist.
    4. Reinigen Sie den umgebenden Knochen mit 0,9 % NaCl, um alle Knochenfragmente zu entfernen.
    5. Platzieren Sie die kreisförmigen, dezellularisierten Gerüste in den Defekten.
    6. Die darüber liegende Haut mit 4-0 Nähten verschließen.
  4. Geben Sie den Ratten unbegrenzten Zugang zu Futter und Wasser und überwachen Sie sie täglich.
  5. Nach 8 Wochen nach der Implantation werden die Ratten durch CO2 - Inhalation und Thoraxperforation als sekundäre Euthanasiemaßnahme euthanasiert.
  6. Um den Schädel freizulegen und die Implantate zu entnehmen, entfernen Sie die Haut, die den Schädel bedeckt, mit einer Skalpellklinge.
  7. Schneiden Sie den Schädel am Stirn- und Hinterhauptbein sowie an der Seite beider Scheitelknochen mit einem Zahnbohrer ab, um den oberen Teil des Schädels vollständig zu entfernen.

11. Push-Out-Test

  1. Schließen Sie ein einachsiges Kompressionsgerät (mit einer 445-N-Wägezelle) an das USB-Datenerfassungsmodul an.
  2. Schließen Sie das Datenerfassungsmodul an einen Computer an, der mit einer Datenerfassungssoftware ausgestattet ist.
  3. Unmittelbar nach der Schädelextraktion wird jede Probe (n = 7 Implantate von 4 Tieren in der vorliegenden Studie) so auf den Probenhalter der uniaxialen Kompressionsvorrichtung gelegt, dass die dorsale Seite des Knochens nach oben zeigt.
  4. Senken Sie den Kolben mit 0,5 mm/min ab, bis er das extrahierte Implantat leicht berührt.
  5. Starten Sie den Test, indem Sie den Kolben durch das Implantat absenken, bis er vollständig herausgedrückt ist, während Sie die Kompression mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,5 mm/min mit der Datenerfassungssoftware anwenden.
  6. Zeichnen Sie die Spitzenkraft auf der Kraft-Weg-Kurve mit der Datenerfassungssoftware auf.

12. Analyse der Zellinfiltration und Mineralisierung durch Histologie: In-vivo-Gerüste

  1. Fixieren Sie die extrahierte Schädeldecke und die Implantate 72 Stunden lang in 10% neutralem gepuffertem Formalin, bevor sie zur Lagerung in 70% Ethanol resuspendiert werden.
  2. Histologie:
    HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde die gesamte histologische Vorbereitung (Einbettung, Schnitt und Färbung), die in den nächsten Schritten beschrieben wird, von Accel Labs (Montreal, QC, Kanada) durchgeführt.
    1. Schneiden Sie die Proben (eingebettet in Methylmethacrylat) in 6 μm dicke Abschnitte auf drei verschiedenen Ebenen (oben, unten und zur Mitte hin) und montieren Sie sie auf Objektträger.
    2. Färben Sie die Abschnitte entweder mit H&E oder Masson-Goldner-Trichrom (MGT) ein.
  3. Die Schnitte wurden mit einem Objektträger-Scanner-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung abgebildet (4 Explanate von 2 Tieren in der vorliegenden Studie).
  4. Mit der ImageJ-Software können Sie die Zellinfiltration (H&E-Färbung) und die Kollagenablagerung (MGT-Färbung) visuell bewerten.

Ergebnisse

Porengrößenmessung, Zellverteilung und In-vitro-Mineralisierung (Abbildung 1 und Abbildung 2)
Die vollständige Entfernung der nativen zellulären Bestandteile der Apfelgewebegerüste wurde nach der Behandlung der Gerüste mit SDS und CaCl2 erreicht (Abbildung 1A). Die Scaffolds wiesen eine hochporöse Struktur auf, die mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt wurde. Die Quantifizierung der...

Diskussion

Mehrere In-vitro- und In-vivo-Studien haben die Biokompatibilität von pflanzlicher Cellulose und ihre potenzielle Verwendung im Tissue Engineeringnachgewiesen 14,15,16,18,19,20, insbesondere für die osteogene Differenzierung20,21. Ziel der vorliege...

Offenlegungen

Erklärung zu Interessenkonflikten: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. und A.P. sind Erfinder von Patentanmeldungen, die von der University of Ottawa und Spiderwort Inc. eingereicht wurden und die Verwendung von pflanzlicher Zellulose für HdO-Anwendungen betreffen. M.L.L., R.J.H., C.M.C. und A.P. haben finanzielle Beteiligungen an Spiderwort Inc.

Danksagungen

Finanziert wurde das Projekt vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) und von der Li Ka Shing Foundation. M.L.L. wurde vom TalentEdge-Programm der Ontario Centers of Excellence unterstützt, und R.J.H. wurde durch ein NSERC-Postgraduiertenstipendium und ein Ontario Graduate Scholarship (OGS) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4′,6-diamidino-2-phenylindoleThermoFisherD1306DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazoliumSigma-AldrichB5655BCIP/NBT
Alizarin red SSigma-AldrichA5533ARS
Ascorbic acidSigma-AldrichA4403Cell Culture
Calcium ChlorideThermoFisherAA12316CaCl2
Calcofluor WhiteSigma-Aldrich18909
Dental drillSurgical tool
EthanolThermoFisher615095000
Fetal bovine serumHyclone LaboratoriesSH30396FBS
FormalinSigma-AldrichHT50112810% Formalin
Goldner's trichrome stainSigma-Aldrich1.00485GTC
Hematoxylin and eosin stainFisher ScientificNC1470670H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscopeNikonNikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Irrigation salineBaxterJF71230.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cellsATCCCRL-2593Pre-osteoblast cells
McIntosh applesCanada Fancy grade
Methyl methacrylateSigma-AldrichM55909Histological embedding
Minimum Essential MediumThermoFisherM0894α-MEM
ParaformaldehydeFisher ScientificO40424%; PFA
Penicillin/StreptomycinHyclone LaboratoriesSV30010Cell Culture
Periodic acidSigma-Aldrich375810
Phosphate buffered salineHyclone Laboratories2810305PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodideInvitrogenp3566
Scanning electron microscopeJEOLJSM-7500F FESEMSEM and EDS
Slide scanner microscopeZeissAXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166SDS
Sodium metabisulphiteSigma-Aldrich31448
Sodium phosphateThermoFisherBP329
Sprague-Dawley ratsCharles-River Laboratories400Male
SuturesEthiconJ494G4-0
TrephineACE Surgical Supply Co583-01825-mm diameter
Triton-X 100ThermoFisher807423
TrypsinHyclone LaboratoriesSH30236.02Cell Culture
TweenFisher ScientificBP337
Universal compression DeviceCellScaleUniVert
Von Kossa stainSigma-Aldrich1.00362Histology

Referenzen

  1. Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
  2. Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
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