뼈 조직 엔지니어링을 위한 탈세포화된 사과 유래 스캐폴드 , In Vitro 및 In Vivo

요약

이 연구에서는 식물 기반 생체 재료의 탈세포화, 물리적 특성화, 이미징 및 생체 내 이식 방법과 스캐폴드의 세포 파종 및 분화 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 방법을 통해 뼈 조직 공학 응용 분야를 위한 식물 기반 생체 재료를 평가할 수 있습니다.

초록

식물 유래 셀룰로오스 생체 재료는 다양한 조직 공학 응용 분야에 사용되어 왔습니다. 생체 내 연구는 천연 공급원에서 추출한 셀룰로오스로 만든 스캐폴드의 놀라운 생체 적합성을 보여주었습니다. 또한 이러한 지지체는 여러 조직과 관련된 구조적 특성을 가지고 있으며 포유류 세포의 침입 및 증식을 촉진합니다. 탈세포화된 사과 히판티움 조직을 사용한 최근 연구는 공극 크기가 섬유주 뼈의 기공 크기와 유사할 뿐만 아니라 골형성 분화를 효과적으로 지원하는 능력을 입증했습니다. 본 연구는 뼈 조직 공학(BTE) 응용 분야를 위한 사과 유래 셀룰로오스 지지체의 잠재력을 추가로 조사하고 시험관 내 및 생체 내 기계적 특성을 평가했습니다. MC3T3-E1 전골아세포를 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드에 파종한 후 골형성 잠재력과 기계적 특성을 평가했습니다. 알칼리성 포스파타제 및 alizarin red S 염색은 분화 배지에서 배양된 스캐폴드에서 골형성 분화를 확인했습니다. 조직학적 검사는 골격 전체에 걸쳐 광범위한 세포 침입과 광물화를 보여주었습니다. 주사전자현미경(SEM)을 통해 스캐폴드 표면에 광물 응집체가 발견되었고, 에너지 분산 분광법(EDS)을 통해 인산염과 칼슘 원소의 존재가 확인되었습니다. 그러나 세포 분화에 따른 영률(Young's modulus)이 크게 증가했음에도 불구하고 건강한 뼈 조직보다 낮게 유지되었습니다. 생체 내 연구에서는 쥐 calvaria에 8주 동안 이식한 후 탈세포화된 사과 유래 지지체 내에서 세포 침투 및 세포외 기질의 침착을 보여주었습니다. 또한, 뼈 결손에서 지지체를 제거하는 데 필요한 힘은 이전에 보고된 본래 종골골의 골절 하중과 유사했습니다. 전반적으로, 이 연구는 사과에서 추출한 셀룰로오스가 BTE 응용 분야에 유망한 후보임을 확인합니다. 그러나 기계적 특성과 건강한 뼈 조직의 기계적 특성 사이의 비유사성으로 인해 하중이 적은 시나리오에 대한 적용이 제한될 수 있습니다. 하중 지지 응용 분야를 위한 사과 유래 셀룰로오스 스캐폴드의 기계적 특성을 향상시키기 위해 추가적인 구조적 재설계 및 최적화가 필요할 수 있습니다.

서문

부상이나 질병으로 인한 큰 뼈 결손은 완전한 재생을 위해 생체재료 이식이 필요한 경우가 많습니다¹. 뼈 조직 재생을 개선하기 위해 고안된 현재의 기술은 정기적으로 자가 이식편, 동종 이식편, 이종 이식편 또는 합성 이식편을 사용합니다². 큰 뼈 결함을 복구하기 위한 "황금 표준" 이식 관행으로 간주되는 자가 뼈 이식의 경우 환자로부터 뼈를 추출합니다. 그러나 이 이식 절차에는 크기 및 모양 제한, 조직 가용성, 샘플링 부위 이환율 등 몇 가지 단점이 있습니다³. 또한, 자가 이식술은 수술 부위 감염, 후속 골절, 검체 채취 또는 재건 부위에서의 혈종 형성 및 수술 후 통증에 취약하다⁴. 뼈 조직 공학(BTE)은 기존의 뼈 이식 방법에 대한 잠재적인 대안을 제공합니다⁵. 구조적 생체 재료와 세포를 결합하여 새로운 기능적 뼈 조직을 만듭니다. BTE용 생체 재료를 설계할 때 거대 다공성 구조, 세포 부착을 촉진하는 표면 화학 및 천연 뼈와 매우 유사한 기계적 특성을 결합하는 것이 중요합니다⁶. 과거 연구에 따르면 BTE에 사용되는 생체 재료에....

프로토콜

실험 프로토콜은 오타와 대학교 동물 보호 위원회(University of Ottawa Animal Care Committee)에서 검토하고 승인했습니다.

1. 비계 준비

1. 만돌린 슬라이서를 사용하여 매킨토시 사과(Canada Fancy)를 8mm 두께로 자릅니다. 사과 조각의 히판티움 조직을 5mm x 5mm 정사각형으로 자릅니다.
2. 정사각형 샘플을 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 2일 동안 넣습니다.
3. 탈셀룰라화된 샘플을 탈이온수로 세척하고 실온(RT)에서 100mM_CaCl2의 밤새 배양하여 나머지 계면활성제를 제거합니다.
4. 샘플(즉, 스캐폴드)을 70% 에탄올로 30분 동안 멸균하고 탈이온수로 세척한 다음 세포 파종 전에 24웰 배양 플레이트에 넣습니다.

2. 세포 배양 및 스캐폴드 파종

1. 세포 배양 조건(95% 공기 및 5%_CO2의 가습 분위기에서 37°C)에서 10cm 직경의 세포 배양 처리 접시에 MC3T3-E1 Subclone 4 세포를 유지합니다.
2. 10% 소 태아 혈....

토론

여러 시험관 내 및 생체 내 연구에서 식물 유래 셀룰로오스의 생체 적합성과 조직 공학에서의 잠재적 사용 14,15,16,18,19,20, 특히 골형성 분화 ^20,21. 본 연구의 목적은 BTE에 대한 사과 유래 셀룰.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology