Andamios descelularizados derivados de la manzana para la ingeniería de tejidos óseos in vitro e in vivo

Resumen

En este estudio, detallamos métodos de descelularización, caracterización física, imagen e implantación in vivo de biomateriales de origen vegetal, así como métodos para la siembra y diferenciación celular en los andamios. Los métodos descritos permiten la evaluación de biomateriales de origen vegetal para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos.

Resumen

Los biomateriales de celulosa de origen vegetal se han empleado en diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los estudios in vivo han demostrado la notable biocompatibilidad de los andamios hechos de celulosa derivada de fuentes naturales. Además, estos andamios poseen características estructurales que son relevantes para múltiples tejidos, y promueven la invasión y proliferación de células de mamíferos. Investigaciones recientes con tejido de hipantio de manzana descelularizado han demostrado la similitud de su tamaño de poro con el del hueso trabecular, así como su capacidad para apoyar eficazmente la diferenciación osteogénica. El presente estudio examinó más a fondo el potencial de los andamios de celulosa derivados de la manzana para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos (BTE) y evaluó sus propiedades mecánicas in vitro e in vivo . Los preosteoblastos MC3T3-E1 se sembraron en andamios de celulosa derivados de manzanas que luego se evaluaron por su potencial osteogénico y propiedades mecánicas. La tinción con fosfatasa alcalina y rojo de alizarina S confirmó la diferenciación osteogénica en andamios cultivados en medio de diferenciación. El examen histológico demostró una invasión celular generalizada y mineralización a través de los andamios. La microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló agregados minerales en la superficie de los andamios, y la espectroscopia de dispersión de energía (EDS) confirmó la presencia de elementos fosfato y calcio. Sin embargo, a pesar de un aumento significativo en el módulo de Young después de la diferenciación celular, se mantuvo más bajo que el del tejido óseo sano. Los estudios in vivo mostraron la infiltración celular y el depósito de matriz extracelular dentro de los andamios derivados de manzanas descelularizados después de 8 semanas de implantación en calvaria de rata. Además, la fuerza requerida para retirar los andamios del defecto óseo fue similar a la carga de fractura previamente reportada del hueso nativo de la pantorrilla. En general, este estudio confirma que la celulosa derivada de la manzana es una candidata prometedora para las aplicaciones de BTE. Sin embargo, la disimilitud entre sus propiedades mecánicas y las del tejido óseo sano puede restringir su aplicación a escenarios de baja carga. Es posible que sea necesaria una reingeniería y optimización estructural adicional para mejorar las propiedades mecánicas de los andamios de celulosa derivados de la manzana para aplicaciones de carga.

Introducción

Los defectos óseos grandes causados por una lesión o enfermedad a menudo requieren injertos de biomaterial para una^{regeneración completa}. Las técnicas actuales diseñadas para mejorar la regeneración del tejido óseo utilizan regularmente injertos autólogos, alogénicos, xenogénicos o sintéticos². Para el injerto óseo autólogo, considerado la práctica de injerto "estándar de oro" para reparar defectos óseos grandes, el hueso se extrae del paciente. Sin embargo, este procedimiento de injerto tiene varios inconvenientes, como las limitaciones de tamaño y forma, la disponibilidad de tejido y la morbilidad del sitio de muestreo....

Protocolo

Los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Ottawa.

1. Preparación del andamio

1. Utilice una cortadora de mandolina para cortar manzanas McIntosh (Canada Fancy) en rodajas de 8 mm de grosor. Corta el tejido de hipantio de las rodajas de manzana en cuadrados de 5 mm x 5 mm.
2. Coloque las muestras cuadradas en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% durante 2 días.
3. Lavar las muestras descelularizadas con agua desionizada e incubarlas durante la noche a temperatura ambiente (RT) en 100 mM de CaCl₂ para eliminar el surfactant....

Resultados

Medición del tamaño de los poros, distribución celular y mineralización in vitro (Figura 1 y Figura 2)
La eliminación completa de los componentes celulares nativos de los andamios de tejido de manzana se logró después de tratar los andamios con SDS y CaCl₂ (Figura 1A). Los andamios presentaban una estructura altamente porosa, lo que se confirmó mediante microscopía confocal. La cuanti.......

Discusión

Varios estudios in vitro e in vivo han demostrado la biocompatibilidad de la celulosa de origen vegetal y su potencial uso en ingeniería de tejidos 14,15,16,18,19,20, más específicamente para albergar la diferenciación osteogénica ^20,21. Los obj.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology