Scaffolds Decelularizados Derivados de Maçã para Engenharia de Tecido Ósseo In Vitro e In Vivo

Resumo

Neste estudo, detalhamos métodos de decelularização, caracterização física, imageamento e implantação in vivo de biomateriais de base vegetal, bem como métodos de semeadura e diferenciação celular nos scaffolds. Os métodos descritos permitem a avaliação de biomateriais de origem vegetal para aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Resumo

Biomateriais de celulose derivados de plantas têm sido empregados em diversas aplicações de engenharia de tecidos. Estudos in vivo têm demonstrado a notável biocompatibilidade de arcabouços feitos de celulose derivada de fontes naturais. Além disso, esses arcabouços possuem características estruturais relevantes para múltiplos tecidos e promovem a invasão e proliferação de células de mamíferos. Pesquisas recentes utilizando tecido hipântio de maçã decelularizado demonstraram a semelhança de seu tamanho de poro com o do osso trabecular, bem como sua capacidade de apoiar efetivamente a diferenciação osteogênica. O presente estudo examinou ainda o potencial de scaffolds de celulose derivados de maçã para aplicações em engenharia de tecido ósseo (BTE) e avaliou suas propriedades mecânicas in vitro e in vivo . Pré-osteoblastos MC3T3-E1 foram semeados em scaffolds de celulose derivados de maçã que foram então avaliados quanto ao seu potencial osteogênico e propriedades mecânicas. A coloração de fosfatase alcalina e S vermelho de alizarina confirmou a diferenciação osteogênica em scaffolds cultivados em meio de diferenciação. O exame histológico demonstrou invasão celular generalizada e mineralização através dos scaffolds. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou agregados minerais na superfície dos scaffolds, e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS) confirmou a presença de elementos fosfato e cálcio. No entanto, apesar de um aumento significativo no módulo de Young após a diferenciação celular, ele permaneceu menor do que o do tecido ósseo normal. Estudos in vivo mostraram infiltração celular e deposição de matriz extracelular dentro dos arcabouços derivados de maçãs decelularizadas após 8 semanas de implantação na calvária de ratos. Além disso, a força necessária para remover os scaffolds do defeito ósseo foi semelhante à carga de fratura relatada anteriormente do osso nativo da calota. No geral, este estudo confirma que a celulose derivada da maçã é uma candidata promissora para aplicações em BTE. Entretanto, a dissimilaridade entre suas propriedades mecânicas e as do tecido ósseo normal pode restringir sua aplicação a cenários de baixa carga de carga. Reengenharia estrutural adicional e otimização podem ser necessárias para melhorar as propriedades mecânicas de andaimes de celulose derivados de maçã para aplicações de suporte de carga.

Introdução

Grandes defeitos ósseos causados por uma lesão ou doença frequentemente requerem enxertos de biomateriais para regeneração completa¹. As técnicas atuais destinadas a melhorar a regeneração do tecido ósseo utilizam regularmente enxertos autólogos, alogênicos, xenogênicos ou sintéticos². Para o enxerto ósseo autólogo, considerado a prática de enxerto "padrão ouro" para reparar grandes defeitos ósseos, o osso é extraído do paciente. No entanto, esse procedimento de enxertia tem várias desvantagens, incluindo limitações de tamanho e forma, disponibilidade de tecido e morbidade do local de amostragem³. Além disso, os procedimentos de enxertia autóloga são suscetíveis a infecções do sítio cirúrgico, fraturas subsequentes, formação de hematoma no local da amostragem ou reconstruído e dor pós-operatória⁴. A engenharia do tecido ósseo (BTE) oferece uma alternativa potencial aos métodos convencionais de enxerto ósseo⁵. Ele combina biomateriais estruturais e células para construir novo tecido ósseo funcional. Ao projetar biomateriais para BTE, é fundamental combinar uma estrutura macroporosa, química de superfície que promova a fixação celular e propriedades mecânicas que se assemelham muito às do osso nativo⁶. Pesquisas anteriores indicaram que o tamanho ideal dos poros e o módulo de elasticidade para os biomateriais utilizados em BTE são de aproximadamente 100-200 μm⁷ e 0,1-20 GPa, respectivamente, dependendo do local de enxertia⁸. Além disso, a porosidade e a interconectividade dos poros dos scaffolds são fatores críticos que afetam a migração celular, a difusão de nutrientes e a angiogênese⁸.

O BTE tem mostrado resultados promissores com diversos biomateriais desenvolvidos e avaliados como opções alternativas aos enxertos ósseos. Alguns desses biomateriais são osteoindutores, híbridos e hidrogéis avançados⁸. Os materiais osteoindutores estimulam o desenvolvimento de estruturas ósseas neoformadas. Os materiais híbridos são compostos por polímeros sintéticos e/ou naturais⁸. Os hidrogéis avançados mimetizam a matriz extracelular (MEC) e são capazes de fornecer os fatores bioativos necessários para promover a integração do tecido ósseo⁸. A hidroxiapatita é um material tradicional e de escolha comum para BTE devido à sua composição e biocompatibilidade⁹. O vidro bioativo é outro tipo de biomaterial para BTE, que demonstrou estimular respostas celulares específicas para ativar genes necessários para a osteogênese10,11. Polímeros biodegradáveis, incluindo poli(ácido glicólico) e poli(ácido lático), também têm sido extensivamente utilizados em aplicações de BTE¹². Finalmente, polímeros naturais ou de origem natural como quitosana, quitina e celulose bacteriana também demonstraram resultados encorajadores para o BTE¹³. No entanto, enquanto polímeros sintéticos e naturais mostram potencial para BTE, o desenvolvimento de um arcabouço funcional com a macroestrutura desejada normalmente requer protocolos extensos.

Por outro lado, estruturas macroscópicas nativas de celulose podem ser facilmente derivadas de diversas plantas e nosso grupo de pesquisa demonstrou anteriormente a aplicabilidade de scaffolds à base de celulose derivados de plantas para diferentes reconstruções teciduais. De fato, após um simples tratamento com surfactante, aproveitamos a estrutura inerente do material vegetal, destacando seu potencial como biomaterial versátil¹⁴. Além disso, esses scaffolds à base de celulose podem ser utilizados para aplicações em cultura de células de mamíferos in vitro ¹⁴, são biocompatíveis e suportam vascularização subcutânea espontânea 14,15,16,17. Tanto nosso grupo de pesquisa quanto outros demonstraram que esses scaffolds podem ser obtidos a partir de plantas específicas com base na aplicação pretendida 14,15,16,17,18,19,20. Por exemplo, a estrutura vascular observada em caules e folhas de plantas apresenta uma semelhança marcante com a estrutura encontrada em tecidos animais¹⁹. Além disso, suportes de celulose derivados de plantas podem ser facilmente moldados e submetidos a modificações bioquímicas superficiais para atingir as características desejadas¹⁶. Em um estudo recente, incorporamos um tampão salino durante o processo de decelularização, levando a uma maior adesão celular observada tanto in vitro quanto in vivo ¹⁶. No mesmo estudo, demonstramos a aplicabilidade de scaffolds de celulose de origem vegetal em biomateriais compósitos por meio da fundição de hidrogéis na superfície dos scaffolds. Em estudos recentes, a funcionalização de arcabouços derivados de plantas tem demonstrado aumentar sua eficácia¹⁸. Por exemplo, um estudo realizado por Fontana e colaboradores (2017) revelou que a adesão de fibroblastos dérmicos humanos era suportada por hastes decelularizadas revestidas com RGD, enquanto hastes não revestidas não exibiam a mesma capacidade¹⁸. Além disso, os autores também demonstraram que fluidos corporais simulados modificados podem ser utilizados para mineralizar artificialmente caules de plantas descelularizadas. Em estudos mais recentes, exploramos o conceito de osteogênese mecanossensível em scaffolds de celulose de origem vegetal e avaliamos seu potencial para^BTE17,20. (2019) utilizaram arcabouços derivados de plantas para cultivar tecidos semelhantes a ossos em um ambiente in vitro ²¹. Por meio de avaliações abrangentes de diferentes fontes vegetais, os autores identificaram os scaffolds derivados da maçã como os mais ideais para o cultivo e diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Além disso, os autores propuseram que os atributos estruturais e mecânicos dos andaimes derivados de maçãs desempenham um papel fundamental na sua adequação à finalidade pretendida. Sendo os arcabouços iniciais derivados de plantas implementados em aplicações de engenharia de tecidos, os scaffolds derivados de maçãs têm demonstrado extensivamente possuir uma arquitetura surpreendentemente semelhante à do osso humano, notadamente em termos de seus poros interconectados variando de 100 a 200 μm de diâmetro^14,21.

No presente estudo, investigamos o potencial de scaffolds de celulose derivados de maçã para BTE e realizamos uma análise de suas propriedades mecânicas tanto in vitro quanto in vivo. Embora existam estudos sobre o potencial de scaffolds derivados de maçãs para BTE 17,20,21, suas propriedades mecânicas têm sido pouco investigadas. Os resultados mostraram invasão selvagem e diferenciação osteogênica de pré-osteoblastos MC3T3-E1 semeados em scaffolds que foram cultivados em meio de diferenciação por 4 semanas. O módulo de Young desses scaffolds foi de 192,0 ± 16,6 kPa, significativamente maior do que os scaffolds blank (scaffolds sem células semeadas) (31,6 ± 4,8 kPa) e os scaffolds cell-seed cultivados em meio de não diferenciação (24,1 ± 8,8 kPa). No entanto, deve-se notar que o módulo de Young do tecido ósseo humano saudável tipicamente está dentro da faixa de 0,1-2 GPa para o osso trabecular e aproximadamente 15-20 GPa para o osso cortical⁸. No entanto, após um implante de 8 semanas em um defeito na calvária de roedores, os arcabouços com sementes de células pareciam estar bem integrados ao osso circundante, como demonstrado por um pico de força médio de 113,6 N ± 18,2 N em testes de push-out, que é semelhante à carga de fratura relatada anteriormente do osso nativo da calota^craniana22. Em geral, os resultados obtidos a partir deste estudo mostram uma promessa significativa, particularmente para aplicações sem suporte de carga. No entanto, os suportes de celulose derivados da maçã não possuem atualmente as propriedades mecânicas necessárias para combinar precisamente com o tecido ósseo circundante em um local de implante. Consequentemente, é necessário um maior desenvolvimento para desbloquear todo o potencial destes andaimes.

Protocolo

Os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Ottawa.

1. Preparação do andaime

1. Use uma fatia de bandolim para cortar maçãs McIntosh (Canada Fancy) em fatias de 8 mm de espessura. Corte o tecido do hipântio das fatias de maçã em quadrados de 5 mm x 5 mm.
2. Colocar as amostras quadradas em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% durante 2 dias.
3. Lavar as amostras decelularizadas com água deionizada e incubá-las durante a noite à temperatura ambiente (TR) em CaCl₂ 100 mM para remover o tensoativo restante.
4. Esterilizar as amostras (isto é, arcabouços) em etanol 70% por 30 min, lavá-las com água deionizada e colocá-las em uma placa de cultura de 24 poços antes da semeadura celular.

2. Cultura celular e semeadura de andaimes

1. Manter as células MC3T3-E1 Subclone 4 em placas tratadas com cultura celular de 10 cm de diâmetro em condições de cultura celular (37°C em atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO₂).
2. Preparar meio de cultura celular à base de meio essencial mínimo de Eagle - modificação alfa (α-MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina.
3. Separar as células das placas de cultura por tripsinização (0,05% tripsina-EDTA) quando atingirem 80% de confluência.
4. Centrifugar a suspensão celular a c.a. 200 x g por 3 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em α-MEM a 2,5 x 10⁷ células por mL.
5. Pipetar uma alíquota de 40 μL da suspensão celular na superfície dos scaffolds e deixar as células aderirem por 1 h em condições de cultura celular. Em seguida, adicionar 2 mL de meio de cultura a cada poço de cultura da placa de cultura.
6. Reabastecer o meio de cultura a cada 2-3 dias por 14 dias.
7. Preparar um meio de diferenciação adicionando 50 μg/mL de ácido ascórbico e 4 mM de fosfato de sódio ao meio de cultura celular descrito anteriormente.
8. Induzir a diferenciação de células MC3T3-E1 incubando os scaffolds em meio de diferenciação por 4 semanas. Reabasteça o meio a cada 3-4 dias. Paralelamente, incubar scaffolds em meio de cultura sem diferenciação (ou seja, meio sem os suplementos para induzir diferenciação) pela mesma duração, com o mesmo esquema de troca de meio para servir como controle negativo.

3. Medidas do tamanho dos poros usando microscopia confocal de varredura a laser

1. Lave os andaimes derivados de maçãs decelularizadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Incubar os scaffolds em 1 mL de coloração branca de calcofluor a 10% (v/v) por 25 min no escuro em TR.
3. Lavar os scaffolds (n = 3) com PBS e obter três áreas selecionadas aleatoriamente por andaime com um microscópio de varredura a laser confocal ressonante de alta velocidade (CLSM) em aumento de 10x, usando um canal DAPI, da seguinte forma:
   1. Configuração do filtro de emissão a laser: 405 nm (laser); 425-475 nm (emissão)
   2. Ajuste a potência do laser e o detector manualmente para garantir a aquisição ideal da imagem. Adquira uma pilha z de 20 imagens com um tamanho de passo de 5 μm.
4. Usando o software ImageJ, processe e analise as imagens confocais da seguinte forma:
   1. Use a função Z-Project to Maximum Intensity para criar uma imagem e aplique a função Find Edges para realçar a borda dos poros.
   2. Trace os poros manualmente usando a ferramenta Seleção à mão livre .
   3. Ajustar cada poro como uma elipse, medir o comprimento do eixo maior, compilar todas as medidas (um total de 54 no presente estudo - 6 em 3 áreas selecionadas aleatoriamente para cada scaffold) e calcular o comprimento médio.

4. Análise da distribuição celular utilizando microscopia confocal de varredura a laser

1. Lavar três vezes os scaffolds de sementes celulares cultivados em meio de não diferenciação ou diferenciação com PBS. Fixar os andaimes com paraformaldeído a 4% por 10 min.
2. Lave bem cada andaime com água deionizada, permeabilize as células com uma solução de Triton-X 100 por 5 minutos e lave novamente com PBS.
3. Incubar os scaffolds em 1 mL de ácido periódico a 1% por 40 min e enxaguar com água deionizada^14,16.
4. Incubar os scaffolds em 1 mL de solução contendo 100 mM de metabissulfito de sódio e ácido clorídrico 0,15 M, suplementada com 100 μg/mL de iodeto de propídio. Mergulhe completamente os andaimes na solução.
5. Lavar os scaffolds com PBS e manchar os núcleos celulares incubando-os numa solução DAPI de 5 mg/ml durante 10 minutos no escuro. Lave bem novamente e armazene os andaimes em PBS antes da aquisição de imagens.
6. Imagem de três superfícies selecionadas aleatoriamente de três diferentes scaffolds com sementes de células diferentes com um CLSM ressonante de alta velocidade em aumento de 10x, usando canais DAPI e TRITC, da seguinte forma:
   1. Configuração do filtro de emissão a laser:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emissão: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emissão: 570-620 nm
   2. Ajuste a potência do laser e o detector manualmente para garantir a aquisição ideal da imagem. Adquira uma pilha z de 20 imagens com um tamanho de passo de 5 μm.
7. Use o software ImageJ para processar as imagens confocais e criar uma projeção máxima no eixo z para análise de imagens usando a função Z-Project to Maximum Intensity (Projeto Z para Intensidade Máxima ).

5. Análise de fosfatase alcalina

1. Lavar três vezes os scaffolds de sementes celulares cultivados em meio de não diferenciação ou diferenciação com PBS. Fixar os andaimes com formalina tamponada neutra a 10% durante 30 minutos. Fixe andaimes em branco (andaimes sem células semeadas) para servir como controle negativo.
2. Preparar uma solução corante de 5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato e nitro-azul tetrazólio (BCIP/NBT) dissolvendo um comprimido de BCIP/NBT em 10 ml de água deionizada.
3. Lave os andaimes fixos com uma solução de Tween a 0,05% e core com a solução BCIP/NBT durante 20 minutos em RT. Lave os andaimes corados com uma solução de Tween a 0,05% e armazene-os em PBS antes da obtenção de imagens.
4. Imagine os andaimes manchados com uma câmera digital de 12 megapixels.

6. Análise da deposição de cálcio

1. Lavar três vezes os scaffolds de sementes celulares cultivados em meio de não diferenciação ou diferenciação com PBS. Fixar os andaimes com formalina tamponada neutra a 10% durante 30 minutos. Fixe andaimes em branco (andaimes sem células semeadas) para servir como controle negativo.
2. Preparar uma solução corante a 2% (p/v) de alizarina vermelha S (ARS).
3. Lave os andaimes fixos com água deionizada e manche-os com a solução ARS por 1 h no RT. Lave os andaimes corados com água deionizada e armazene-os em PBS antes da obtenção de imagens.
4. Imagine os andaimes manchados com uma câmera digital de 12 megapixels.

7. Análise de mineralização

1. Lavar três vezes os scaffolds de sementes celulares cultivados em meio de não diferenciação ou diferenciação com PBS. Fixar os andaimes com paraformaldeído a 4% por 48 h. Fixe andaimes em branco (andaimes sem células semeadas) para servir como controle negativo.
2. Desidratar as amostras em soluções contendo concentrações de etanol aumentando de 50% a 100%, conforme descrito anteriormente²³.
3. Realizar microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) para analisar agregados minerais da seguinte forma:
   1. Secar as amostras com secador de ponto crítico, seguindo o protocolo do fabricante²⁴.
   2. Aplicar uma camada de ouro de 5 nm sobre os andaimes usando um revestidor de pulverização de ouro, seguindo o protocolo do fabricante²⁵.
   3. Obtenha imagens da superfície dos scaffolds com um microscópio eletrônico de varredura regulado em 3 kV, com aumento de 85x.
   4. Realizar EDS ajustando o microscópio eletrônico de varredura em 15 kV. Em três áreas selecionadas aleatoriamente por scaffold, adquira espectros EDS para análise da composição de agregados minerais.

8. Medidas do módulo de elasticidade

1. Retirar os suportes de sementes celulares do respectivo meio de incubação e testar imediatamente as amostras.
2. Usando um aparelho de compressão uniaxial personalizado equipado com uma célula de carga de 1,5 N, comprima os andaimes (n = 3 por condição) a uma taxa constante de 3 mm·^min-1 até uma deformação compressiva máxima de 10% da altura do andaime.
3. Determinar o módulo de Young a partir da inclinação da porção linear das curvas tensão-deformação. No presente estudo, o módulo de elasticidade foi determinado entre 9% e 10% de deformação.

9. Infiltração celular e análise da mineralização por histologia: scaffolds in vitro

1. Lavar três vezes os scaffolds com sementes de células cultivadas em meio de não diferenciação ou diferenciação com PBS.
2. Fixar os arcabouços com paraformaldeído a 4% por 48 h antes da ressuspensão em etanol 70% para armazenamento.
3. Histologia:
   NOTA: No presente estudo, todo o preparo histológico (incorporação, secção e coloração) descrito nas próximas etapas foi realizado pelo Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).
   1. Após a desidratação e inclusão em parafina, cortar as amostras em cortes seriados de 5 μm de espessura, iniciando 1 mm dentro dos scaffolds, e montar os cortes em lâminas de microscópio.
   2. Corar os cortes com hematoxilina e eosina (H&E) ou von Kossa (VK).
   3. Imagem dos cortes com microscópio scanner de lâminas em aumento de 40x (n = 1 scaffold em meio de diferenciação e n = 2 scaffolds em meio de diferenciação no presente estudo).
   4. Utilizando o software ImageJ, avalie visualmente a infiltração celular (coloração H&E) e a mineralização (coloração VK).

10. Modelo de defeito de calota craniana em rato

1. Obtenha protocolos experimentais revisados e aprovados pelo comitê local de cuidados com animais.
2. Preparar andaimes decelularizados circulares (5 mm de diâmetro e 1 mm de espessura) de acordo com a secção 1 descrita acima e utilizando um punch de biópsia de 5 mm.
3. Realizar craniotomia bilateral seguindo protocolo^{estabelecido26}, conforme segue:
   1. Anestesiar ratos machos Sprague-Dawley com isoflurano, primeiro a 3% até ficarem inconscientes, e depois a 2-3% durante todo o procedimento.
   2. Expor o periósteo e o crânio cortando a pele sobrejacente usando uma lâmina de bisturi. Remova o periósteo.
   3. Criar defeitos bilaterais em ambos os ossos parietais de cada lado da sutura sagital usando uma broca dental equipada com uma trefina de 5 mm de diâmetro sob irrigação constante de NaCl a 0,9%.
   4. Limpar o osso circundante com NaCl a 0,9% para remover quaisquer fragmentos ósseos.
   5. Coloque os andaimes circulares e decelularizados nos defeitos.
   6. Fechar a pele sobrejacente com pontos 4-0.
4. Dê aos ratos acesso ilimitado a comida e água e monitore-os diariamente.
5. Após 8 semanas pós-implantação, eutanásia dos ratos por inalação de CO₂ e perfuração torácica como medida secundária de eutanásia.
6. Para expor o crânio e recuperar os implantes, remova a pele que cobre o crânio usando uma lâmina de bisturi.
7. Corte o crânio nos ossos frontal e occipital e no lado de ambos os ossos parietais usando uma broca dentária para remover a seção superior do crânio completamente.

11. Teste de push-out

1. Conecte um dispositivo de compressão uniaxial (com uma célula de carga de 445 N) ao módulo de aquisição de dados USB.
2. Conecte o módulo de aquisição de dados a um computador equipado com um aplicativo de software de aquisição de dados.
3. Imediatamente após a extração craniana, colocar cada amostra (n = 7 implantes de 4 animais do presente estudo) no porta-amostras do dispositivo de compressão uniaxial de modo que a face dorsal do osso esteja voltada para cima.
4. Abaixe o êmbolo a 0,5 mm/min até tocar levemente o implante extraído.
5. Iniciar o teste abaixando o êmbolo através do implante até completar o push-out enquanto aplica compressão a uma velocidade constante de 0,5 mm/min usando o software de aquisição de dados.
6. Registre o pico de força na curva força vs. deslocamento usando o software de aquisição de dados.

12. Infiltração celular e análise de mineralização por histologia: scaffolds in vivo

1. Fixar a calvária extraída e os implantes em formalina tamponada a 10% neutra por 72 h antes da ressuspensão em etanol 70% para armazenamento.
2. Histologia:
   NOTA: No presente estudo, todo o preparo histológico (incorporação, secção e coloração) descrito nas próximas etapas foi realizado pelo Accel Labs (Montreal, QC, Canadá).
   1. Corte as amostras (embutidas em metacrilato de metila) em seções de 6 μm de espessura em três níveis diferentes (superior, inferior e em direção ao centro) e monte-as em lâminas de microscópio.
   2. Manchar as seções com H&E ou tricrômico de Masson-Goldner (MGT).
3. Imagem dos cortes com microscópio scanner de lâmina em aumento de 40x (4 explantes de 2 animais neste estudo).
4. Usando o software ImageJ, avalie visualmente a infiltração celular (coloração H&E) e a deposição de colágeno (coloração MGT).

Resultados

Medida do tamanho dos poros, distribuição celular e mineralização in vitro (Figura 1 e Figura 2)
A remoção completa dos componentes celulares nativos dos scaffolds de tecido macieira foi obtida após o tratamento dos scaffolds com SDS e CaCl₂ (Figura 1A). Os scaffolds exibiam uma estrutura altamente porosa, o que foi confirmado por microscopia confocal. A quantificação das imagens demo...

Discussão

Vários estudos in vitro e in vivo têm demonstrado a biocompatibilidade da celulose vegetal e seu potencial uso na engenharia tecidual 14,15,16,18,19,20, mais especificamente para hospedar a diferenciação osteogênica ^20,21. Os objetivos do prese...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology