Децеллюляризованные каркасы, полученные из яблока, для инженерии костной ткани in vitro и in vivo

Резюме

В этом исследовании мы подробно описываем методы децеллюляризации, физической характеристики, визуализации и имплантации in vivo биоматериалов растительного происхождения, а также методы посева и дифференцировки клеток в скаффолдах. Описанные методы позволяют оценить биоматериалы растительного происхождения для применения в инженерии костной ткани.

Аннотация

Биоматериалы из целлюлозы растительного происхождения используются в различных приложениях тканевой инженерии. Исследования in vivo показали замечательную биосовместимость каркасов из целлюлозы, полученной из природных источников. Кроме того, эти каркасы обладают структурными характеристиками, которые имеют отношение к нескольким тканям, и они способствуют инвазии и пролиферации клеток млекопитающих. Недавние исследования с использованием децеллюляризованной ткани яблочного гипантия продемонстрировали сходство размера пор с размером пор трабекулярной кости, а также его способность эффективно поддерживать остеогенную дифференцировку. В настоящем исследовании также был изучен потенциал целлюлозных каркасов, полученных из яблок, для применения в инженерии костной ткани (BTE) и оценены их механические свойства in vitro и in vivo . Преостеобласты MC3T3-E1 были высеяны в целлюлозные каркасы, полученные из яблок, которые затем были оценены на предмет их остеогенного потенциала и механических свойств. Окрашивание щелочной фосфатазой и ализариновым красным S подтвердило остеогенную дифференцировку в скаффолдах, культивируемых в дифференцировочной среде. Гистологическое исследование показало обширную клеточную инвазию и минерализацию скаффолдов. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) выявила минеральные агрегаты на поверхности скаффолдов, а энергодисперсионная спектроскопия (ЭДС) подтвердила наличие фосфатных и кальциевых элементов. Однако, несмотря на значительное увеличение модуля Юнга после дифференцировки клеток, он оставался ниже, чем у здоровой костной ткани. Исследования in vivo показали клеточную инфильтрацию и отложение внеклеточного матрикса в децеллюляризованных каркасах, полученных из яблок, после 8 недель имплантации в кальварию крыс. Кроме того, сила, необходимая для удаления каркасов из костного дефекта, была аналогична ранее зарегистрированной нагрузке при переломе нативной пяточной кости. В целом, это исследование подтверждает, что целлюлоза, полученная из яблок, является многообещающим кандидатом для применения в заушных аппаратах. Тем не менее, несходство между его механическими свойствами и свойствами здоровой костной ткани может ограничить его применение сценариями с низкой нагрузкой. Для улучшения механических свойств целлюлозных лесов, полученных из яблок, может потребоваться дополнительная структурная реконструкция и оптимизация.

Введение

Большие костные дефекты, вызванные травмой или заболеванием, часто требуют трансплантатов биоматериала для полной регенерации¹. Современные методы, предназначенные для улучшения регенерации костной ткани, регулярно используют аутологичные, аллогенные, ксеногенные или синтетические трансплантаты². Для аутологичной костной пластики, которая считается «золотым стандартом» трансплантации для исправления больших костных дефектов, кость извлекается у пациента. Тем не менее, эта процедура трансплантации имеет ряд недостатков, включая ограничения по размеру и форме, доступность тканей и заболеваемость в месте забора материала³. Кроме того, процедуры аутологичной трансплантации подвержены инфекциям в области хирургического вмешательства, последующим переломам, образованию гематомы в месте забора или реконструкции, а также послеоперационным болям⁴. Инженерия костной ткани (BTE) является потенциальной альтернативой традиционным методам костной пластики⁵. Он сочетает в себе структурные биоматериалы и клетки для построения новой функциональной костной ткани. При разработке биоматериалов для заушных аппаратов крайне важно сочетать макропористую структуру, химический состав поверхности, способствующий прикреплению клеток, и механические свойства, близкие к свойствам нативной кости⁶. Прошлые исследования показали, что идеальный размер пор и модуль упругости для биоматериалов, используемых в заушных материалах, составляют примерно 100-200^мкм7 и 0,1-20 ГПа соответственно, в зависимости от места пересадки⁸. Кроме того, пористость и взаимосвязь пор каркасов являются критическими факторами, влияющими на миграцию клеток, диффузию питательных веществ и ангиогенез⁸.

BTE показала многообещающие результаты с различными биоматериалами, разработанными и оцененными в качестве альтернативы костным трансплантатам. Некоторые из этих биоматериалов являются остеоиндуктивными материалами, гибридными материалами и усовершенствованными гидрогелями⁸. Остеоиндуктивные материалы стимулируют развитие новообразованных костных структур. Гибридные материалы состоят из синтетических и/или природных полимеров⁸. Усовершенствованные гидрогели имитируют внеклеточный матрикс (ВКМ) и способны доставлять необходимые биологически активные факторы для содействия интеграции костной ткани⁸. Гидроксиапатит является традиционным материалом и распространенным выбором для заушных заушных аппаратов благодаря своему составу и биосовместимости⁹. Биоактивное стекло является еще одним типом биоматериала для БТЭ, который, как было показано, стимулирует специфические клеточные реакции для активации генов, необходимых для остеогенеза^10,11. Биоразлагаемые полимеры, в том числе полигликолевая кислота и полимолочная кислота, также широко используются в заушных материалах¹². Наконец, натуральные полимеры или полимеры природного происхождения, такие как хитозан, хитин и бактериальная целлюлоза, также продемонстрировали обнадеживающие результаты для BTE¹³. Однако, несмотря на то, что как синтетические, так и натуральные полимеры имеют потенциал для заушных слуховых аппаратов, разработка функционального каркаса с желаемой макроструктурой, как правило, требует обширных протоколов.

И наоборот, нативные макроскопические целлюлозные структуры могут быть легко получены из различных растений, и наша исследовательская группа ранее продемонстрировала применимость каркасов на основе целлюлозы, полученных из растений, для различных реконструкций тканей. Действительно, после простой обработки поверхностно-активным веществом мы использовали присущую растительному материалу структуру, подчеркнув его потенциал в качестве универсального биоматериала¹⁴. Кроме того, эти каркасы на основе целлюлозы могут быть использованы для применения в культуре клеток млекопитающих in vitro ¹⁴, являются биосовместимыми и поддерживают спонтанную подкожную васкуляризацию 14,15,16,17. Как наша исследовательская группа, так и другие продемонстрировали, что эти скаффолды могут быть получены из конкретных растений в зависимости от предполагаемого применения 14,15,16,17,18,19,20. Например, сосудистая структура, наблюдаемая в стеблях и листьях растений, обнаруживает поразительное сходство со структурой, обнаруженной в тканях животных¹⁹. Кроме того, целлюлозные каркасы, полученные из растений, могут быть легко сформированы и подвергнуты поверхностным биохимическим модификациям для достижения желаемых характеристик¹⁶. В недавнем исследовании мы включили солевой буфер во время процесса децеллюляризации, что привело к усилению прикрепления клеток, наблюдаемому как в условиях in vitro, так и in vivo ¹⁶. В этом же исследовании мы продемонстрировали применимость целлюлозных скаффолдов растительного происхождения в композитных биоматериалах путем отливки гидрогелей на поверхность скаффолдов. В недавних исследованиях было показано, что функционализация скаффолдов растительного происхождения повышает их эффективность¹⁸. Например, исследование, проведенное Fontana et al. (2017), показало, что адгезия дермальных фибробластов человека поддерживалась децеллюляризованными стеблями, покрытыми RGD, в то время как стебли без покрытия не проявляли такой способности¹⁸. Более того, авторы также продемонстрировали, что модифицированная смоделированная жидкость организма может быть использована для искусственной минерализации децеллюляризованных стеблей растений. В более поздних исследованиях мы изучили концепцию механочувствительного остеогенеза в целлюлозных скаффолдах растительного происхождения и оценили их потенциал для BTE^17,20. Кроме того, Lee et al. (2019) использовали скаффолды растительного происхождения для культивирования костноподобных тканей в условиях in vitro ²¹. Проведя всестороннюю оценку различных растительных источников, авторы определили, что скаффолды, полученные из яблок, являются наиболее оптимальными для культивирования и дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Кроме того, авторы предположили, что структурные и механические характеристики лесов, полученных из яблок, играют ключевую роль в их пригодности для использования по назначению. Будучи первыми каркасами растительного происхождения, реализованными в приложениях тканевой инженерии, яблочные каркасы, как было показано, обладают поразительно похожей архитектурой на человеческую кость, особенно с точки зрения их взаимосвязанных пор размером от 100 до 200 мкм и диаметром^14,21.

В настоящем исследовании мы дополнительно изучили потенциал целлюлозных скаффолдов из яблок для заушных ушей и провели анализ их механических свойств как in vitro, так и in vivo. Несмотря на то, что были проведены исследования потенциала яблочных скаффолдов для заушных ушных ушей 17,20,21, их механические свойства были недостаточно изучены. Результаты показали дикую инвазию и остеогенную дифференцировку преостеобластов MC3T3-E1, высеянных в каркасы, которые культивировали в дифференцировочной среде в течение 4 недель. Модуль Юнга этих скаффолдов составил 192,0 ± 16,6 кПа, что было значительно выше, чем у пустых скаффолдов (скаффолдов без засеянных клеток) (31,6 ± 4,8 кПа) и клеточных скаффолдов, культивируемых в недифференцированной среде (24,1 ± 8,8 кПа). Тем не менее, следует отметить, что модуль Юнга здоровой костной ткани человека обычно находится в диапазоне 0,1-2 ГПа для трабекулярной кости и примерно 15-20 ГПа для кортикальной кости⁸. Тем не менее, после 8-недельной имплантации в дефект головного мозга грызуна, засеянные клетками каркасы, по-видимому, были хорошо интегрированы в окружающую кость, о чем свидетельствует средняя пиковая сила 113,6 Н ± 18,2 Н в тестах на выталкивание, что аналогично ранее зарегистрированной нагрузке на перелом нативной пяточной кости²². В целом, результаты, полученные в ходе этого исследования, показывают значительные перспективы, особенно для приложений, не несущих нагрузки. Тем не менее, целлюлозные каркасы, полученные из яблок, в настоящее время не обладают необходимыми механическими свойствами для точного соответствия окружающей костной ткани в месте установки имплантата. Следовательно, требуется дальнейшая разработка, чтобы раскрыть весь потенциал этих лесов.

протокол

Протоколы экспериментов были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Оттавы.

1. Подготовка строительных лесов

1. С помощью мандолинного слайсера нарежьте яблоки McIntosh (Canada Fancy) ломтиками толщиной 8 мм. Нарежьте ткань гипантия яблочных долек на квадраты размером 5 мм х 5 мм.
2. Поместите квадратные образцы в 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) на 2 дня.
3. Промойте децеллюляризованные образцы деионизированной водой и инкубируйте их в течение ночи при комнатной температуре (RT) в 100 мМ CaCl₂ для удаления оставшегося поверхностно-активного вещества.
4. Стерилизуют образцы (т.е. скаффолды) в 70% этаноле в течение 30 минут, промывают их деионизированной водой и помещают в 24-луночный культуральный планшет перед посевом клеток.

2. Посев клеточных культур и каркасов

1. Храните клетки MC3T3-E1 Subclone 4 в чашках, обработанных клеточными культурами диаметром 10 см, в условиях клеточной культуры (37°C во влажной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5%_CO2).
2. Приготовьте питательную среду для клеток, изготовленную из минимально необходимой среды Eagle - альфа-модификации (α-MEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином.
3. Отделите клетки от культуральных чашек путем трипсинизации (0,05% трипсина-ЭДТА), как только они достигнут 80% слияния.
4. Центрифугируют клеточную суспензию при 200 x g в течение 3 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в α-MEM со скоростью 2,5 x^10,7 клеток на мл.
5. Пипетку 40 мкл аликвоты клеточной суспензии наносят на поверхность скаффолдов и дают клеткам прилипнуть в течение 1 ч в условиях клеточной культуры. Затем добавляют по 2 мл питательной среды в каждую культуральную лунку культуральной планшетки.
6. Пополняйте питательную среду каждые 2-3 дня в течение 14 дней.
7. Приготовьте среду для дифференцировки, добавив 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 4 мМ фосфата натрия к ранее описанной питательной среде клеток.
8. Индуцируют дифференцировку клеток MC3T3-E1 путем инкубации скаффолдов в дифференцировочной среде в течение 4 недель. Пополняйте средство каждые 3-4 дня. Параллельно инкубируют скаффолды в недифференцируемой питательной среде (т.е. среде без добавок для индуцирования дифференцировки) в течение того же времени, с тем же графиком смены среды, чтобы служить отрицательным контролем.

3. Измерение размера пор с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

1. Промойте децеллюляризованные яблочные каркасы фосфатно-солевым буфером (PBS).
2. Инкубируют скаффолды в 1 мл 10% (v/v) калькофторного белого пятна в течение 25 мин в темноте при RT.
3. Промойте скаффолды (n = 3) PBS и отобразите три случайно выбранные области на каркасе с помощью высокоскоростного резонансного конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) с 10-кратным увеличением с использованием канала DAPI следующим образом:
   1. Конфигурация лазерно-эмиссионного фильтра: 405 нм (лазер); 425-475 нм (излучение)
   2. Отрегулируйте мощность лазера и детектор вручную, чтобы обеспечить оптимальное получение изображения. Получите z-стек из 20 изображений с шагом 5 мкм.
4. С помощью программного обеспечения ImageJ обработайте и проанализируйте конфокальные изображения следующим образом:
   1. Используйте функцию Z-Проецировать на максимальную интенсивность для создания изображения и примените функцию Найти края , чтобы выделить край пор.
   2. Обведите поры вручную с помощью инструмента «Произвольное выделение ».
   3. Подгоните каждую пору в виде эллипса, измерьте длину большой оси, соберите все измерения (всего 54 в данном исследовании - 6 в 3 случайно выбранных областях для каждого каркаса) и вычислите среднюю длину.

4. Анализ распределения клеток с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

1. Промыть клеточные каркасы, культивируемые в недифференцированной или дифференцировочной среде, три раза PBS. Зафиксируйте каркасы 4% параформальдегидом на 10 мин.
2. Тщательно промыть каждый каркас деионизированной водой, промыть ячейки раствором Тритона-Х 100 в течение 5 мин и снова промыть ПБС.
3. Скаффолды инкубируют в 1 мл 1% периодической кислоты в течение 40 мин и промывают деионизированной водой^14,16.
4. Инкубируют скаффолды в 1 мл раствора, содержащего 100 мМ метабисульфита натрия и 0,15 М соляной кислоты, с добавлением 100 мкг/мл йодида пропидия. Полностью погрузите строительные леса в раствор.
5. Промойте скаффолды PBS и окрасьте клеточные ядра, инкубируя скаффолды в растворе DAPI 5 мг/мл в течение 10 мин в темноте. Тщательно промойте еще раз и поместите каркасы в PBS перед визуализацией.
6. Изображение трех случайно выбранных поверхностей трех различных ячеечных каркасов с высокоскоростным резонансным CLSM при 10-кратном увеличении с использованием каналов DAPI и TRITC следующим образом:
   1. Конфигурация лазерно-эмиссионного фильтра:
      DAPI: Лазер: 405 нм; Излучение: 425-475 нм
      TRITC: Лазер: 561 нм; Излучение: 570-620 нм
   2. Отрегулируйте мощность лазера и детектор вручную, чтобы обеспечить оптимальное получение изображения. Получите z-стек из 20 изображений с шагом 5 мкм.
7. Используйте программное обеспечение ImageJ для обработки конфокальных изображений и создания максимальной проекции по оси Z для анализа изображений с помощью функции Z-Project to Maximum Intensity .

5. Анализ щелочной фосфатазы

1. Промыть клеточные каркасы, культивируемые в недифференцированной или дифференцировочной среде, три раза PBS. Закрепите каркасы 10% нейтральным буферизованным формалином в течение 30 минут. Закрепите пустые скаффолды (скаффолды без засеянных ячеек), чтобы они служили отрицательным контролем.
2. Приготовьте раствор для окрашивания 5-бром-4-хлор-3'-индолифосфата и нитросинего тетразолия (BCIP/NBT), растворив одну таблетку BCIP/NBT в 10 мл деионизированной воды.
3. Неподвижные каркасы промыть 0,05% раствором Tween и окрасить раствором BCIP/NBT в течение 20 мин при RT. Вымойте окрашенные каркасы 0,05% раствором Tween и храните их в PBS перед визуализацией.
4. Изображение окрашенных лесов с помощью 12-мегапиксельной цифровой камеры.

6. Анализ отложения кальция

1. Промыть клеточные каркасы, культивируемые в недифференцированной или дифференцировочной среде, три раза PBS. Закрепите каркасы 10% нейтральным буферизованным формалином в течение 30 минут. Закрепите пустые скаффолды (скаффолды без засеянных ячеек), чтобы они служили отрицательным контролем.
2. Приготовьте 2% раствор для окрашивания ализарина красного S (ARS).
3. Неподвижные скаффолды промыть деионизированной водой и окрасить их раствором ARS в течение 1 ч при RT. Промойте окрашенные каркасы деионизированной водой и храните их в PBS перед визуализацией.
4. Изображение окрашенных лесов с помощью 12-мегапиксельной цифровой камеры.

7. Минерализационный анализ

1. Промыть клеточные каркасы, культивируемые в недифференцированной или дифференцировочной среде, три раза PBS. Закрепите каркасы 4% параформальдегидом в течение 48 ч. Закрепите пустые скаффолды (скаффолды без засеянных ячеек), чтобы они служили отрицательным контролем.
2. Обезвоживают образцы в растворах, содержащих концентрацию этанола, увеличивая с 50% до 100%, как описано ранее²³.
3. Выполняйте сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) и энергодисперсионную спектроскопию (ЭДС) для анализа минеральных агрегатов следующим образом:
   1. Высушите образцы с помощью сушилки в критической точке, следуя протоколу производителя²⁴.
   2. Нанесите 5-нм золотое покрытие на каркасы с помощью устройства для нанесения золотого напыления в соответствии с протоколом^{производителя 25}.
   3. Изображение поверхности скаффолдов с помощью сканирующего электронного микроскопа, установленного на 3 кВ, при 85-кратном увеличении.
   4. Выполните ЭЦП, настроив сканирующий электронный микроскоп на напряжение 15 кВ. На трех случайно выбранных участках для каждого каркаса получите спектры EDS для анализа состава минеральных агрегатов.

8. Измерения модуля Юнга

1. Извлеките засеянные клетками каркасы из соответствующей инкубационной среды и немедленно протестируйте образцы.
2. Используя изготовленный по индивидуальному заказу одноосный компрессионный аппарат, оснащенный тензодатчиком 1,5 Н, сжимайте каркасы (n = 3 на условие) с постоянной скоростью 3 мм·^мин-1 до максимальной деформации сжатия 10% от высоты леса.
3. Определите модуль Юнга по наклону линейной части кривых зависимости напряжения от деформации. В настоящем исследовании модуль упругости определялся между 9% и 10% деформацией.

9. Анализ клеточной инфильтрации и минерализации с помощью гистологии: скаффолды in vitro

1. Промывают клеточные каркасы, культивируемые в недифференцированной или дифференцировочной среде, три раза PBS.
2. Зафиксируйте засеянные клетками каркасы 4% параформальдегидом в течение 48 ч перед повторной суспензией в 70% этаноле для хранения.
3. Гистология:
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании вся гистологическая подготовка (встраивание, срезы и окрашивание), описанная на следующих этапах, была выполнена Центром гистологии Луизы Пеллетье (Университет Оттавы).
   1. После обезвоживания и погружения в парафин образцы разрезают на последовательные отрезки толщиной 5 мкм, начиная с 1 мм внутри каркасов, и устанавливают срезы на предметные стекла микроскопа.
   2. Окрасьте срезы гематоксилином и эозином (H&E) или красителями по Коссе (VK).
   3. Изображение срезов с помощью диагонального микроскопа при 40-кратном увеличении (n = 1 скаффолд в недифференцируемой среде и n = 2 скаффолда в дифференцированной среде в настоящем исследовании).
   4. С помощью программного обеспечения ImageJ можно визуально оценить инфильтрацию клеток (окрашивание H&E) и минерализацию (окрашивание VK).

10. Модель дефекта железа крысы

1. Получите экспериментальные протоколы, проверенные и одобренные местным комитетом по уходу за животными.
2. Подготовьте круглые (диаметром 5 мм и толщиной 1 мм) децеллюляризованные каркасы в соответствии с разделом 1, описанным выше, и с помощью 5-миллиметрового биопсийного пуансона.
3. Выполняйте двустороннюю трепанацию черепа в соответствии с установленным протоколом²⁶ следующим образом:
   1. Обезболивайте крыс-самцов Спрэга-Доули изофлураном, сначала на 3%, пока они не потеряют сознание, а затем на 2-3% на протяжении всей процедуры.
   2. Обнажите надкостницу и череп, разрезав вышележащую кожу лезвием скальпеля. Удалите надкостницу.
   3. Создать двусторонние дефекты в обеих теменных костях с каждой стороны сагиттального шва с помощью бормашины, оснащенной трепаном диаметром 5 мм, при постоянном орошении 0,9% NaCl.
   4. Очистите окружающую кость 0,9% NaCl, чтобы удалить любые костные фрагменты.
   5. Поместите круглые децеллюляризованные каркасы в дефекты.
   6. Закройте вышележащую кожу швами 4-0.
4. Обеспечьте крысам неограниченный доступ к еде и воде и ежедневно наблюдайте за ними.
5. Через 8 недель после имплантации усыпляют крыс ингаляцией_СО2 и перфорацией грудной клетки в качестве вторичной меры эвтаназии.
6. Чтобы обнажить череп и извлечь имплантаты, удалите кожу, покрывающую череп, с помощью лезвия скальпеля.
7. Разрежьте череп по лобной и затылочной костям, а также по бокам обеих теменных костей с помощью бормашины, чтобы полностью удалить верхнюю часть черепа.

11. Испытание на выталкивание

1. Подключите одноосное компрессионное устройство (с тензодатчиком 445 Н) к USB-модулю сбора данных.
2. Подключите модуль сбора данных к компьютеру, оснащенному программным обеспечением для сбора данных.
3. Сразу после извлечения черепа поместите каждый образец (n = 7 имплантатов от 4 животных в настоящем исследовании) на держатель образца одноосного компрессионного устройства так, чтобы дорсальная сторона кости была обращена вверх.
4. Опустите поршень со скоростью 0,5 мм/мин до легкого касания извлеченного имплантата.
5. Начните испытание, опустив поршень через имплантат до полного выталкивания при одновременном сжатии с постоянной скоростью 0,5 мм/мин с помощью программного обеспечения для сбора данных.
6. Запишите пиковое усилие на кривой зависимости силы от смещения с помощью программного обеспечения для сбора данных.

12. Анализ клеточной инфильтрации и минерализации с помощью гистологии: скаффолды in vivo

1. Извлеченную кальварию и имплантаты зафиксируют в 10% нейтральном буферном формалине в течение 72 ч перед повторной суспензией в 70% этаноле для хранения.
2. Гистология:
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании вся гистологическая подготовка (встраивание, секционирование и окрашивание), описанная на следующих этапах, была выполнена компанией Accel Labs (Монреаль, Квебек, Канада).
   1. Разрежьте образцы (погруженные в метилметакрилат) на секции толщиной 6 мкм на трех разных уровнях (сверху, снизу и ближе к центру) и закрепите их на предметных стеклах микроскопа.
   2. Окрасьте срезы трихромом H&E или трихромом Массона-Гольднера (MGT).
3. Изображение срезов с помощью микроскопа-сканера предметных стекол при 40-кратном увеличении (4 эксплантата от 2 животных в настоящем исследовании).
4. С помощью программного обеспечения ImageJ можно визуально оценить клеточную инфильтрацию (окрашивание H&E) и осаждение коллагена (окрашивание MGT).

Результаты

Измерение размера пор, распределение клеток и минерализация in vitro (Рисунок 1 и Рисунок 2)
Полное удаление нативных клеточных компонентов каркасов тканей яблони было достигнуто после обработки скаффолдов SDS и CaCl₂ (рис. 1А

Обсуждение

Несколько исследований in vitro и in vivo продемонстрировали биосовместимость целлюлозы растительного происхождения и ее потенциальное использование в тканевой инженерии 14,15,16,18,19,20, в частности, для проведения остеогенной дифференциации ^<...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology