Децеллюляризованные каркасы, полученные из яблока, для инженерии костной ткани in vitro и in vivo

Резюме

В этом исследовании мы подробно описываем методы децеллюляризации, физической характеристики, визуализации и имплантации in vivo биоматериалов растительного происхождения, а также методы посева и дифференцировки клеток в скаффолдах. Описанные методы позволяют оценить биоматериалы растительного происхождения для применения в инженерии костной ткани.

Аннотация

Биоматериалы из целлюлозы растительного происхождения используются в различных приложениях тканевой инженерии. Исследования in vivo показали замечательную биосовместимость каркасов из целлюлозы, полученной из природных источников. Кроме того, эти каркасы обладают структурными характеристиками, которые имеют отношение к нескольким тканям, и они способствуют инвазии и пролиферации клеток млекопитающих. Недавние исследования с использованием децеллюляризованной ткани яблочного гипантия продемонстрировали сходство размера пор с размером пор трабекулярной кости, а также его способность эффективно поддерживать остеогенную дифференцировку. В настоящем исследовании также был изучен потенциал целлюлозных каркасов, полученных из яблок, для применения в инженерии костной ткани (BTE) и оценены их механические свойства in vitro и in vivo . Преостеобласты MC3T3-E1 были высеяны в целлюлозные каркасы, полученные из яблок, которые затем были оценены на предмет их остеогенного потенциала и механических свойств. Окрашивание щелочной фосфатазой и ализариновым красным S подтвердило остеогенную дифференцировку в скаффолдах, культивируемых в дифференцировочной среде. Гистологическое исследование показало обширную клеточную инвазию и минерализацию скаффолдов. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) выявила минеральные агрегаты на поверхности скаффолдов, а энергодисперсионная спектроскопия (ЭДС) подтвердила наличие фосфатных и кальциевых элементов. Однако, несмотря на значительное увеличение модуля Юнга после дифференцировки клеток, он оставался ниже, чем у здоровой костной ткани. Исследования in vivo показали клеточную инфильтрацию и отложение внеклеточного матрикса в децеллюляризованных каркасах, полученных из яблок, после 8 недель имплантации в кальварию крыс. Кроме того, сила, необходимая для удаления каркасов из костного дефекта, была аналогична ранее зарегистрированной нагрузке при переломе нативной пяточной кости. В целом, это исследование подтверждает, что целлюлоза, полученная из яблок, является многообещающим кандидатом для применения в заушных аппаратах. Тем не менее, несходство между его механическими свойствами и свойствами здоровой костной ткани может ограничить его применение сценариями с низкой нагрузкой. Для улучшения механических свойств целлюлозных лесов, полученных из яблок, может потребоваться дополнительная структурная реконструкция и оптимизация.

Введение

Большие костные дефекты, вызванные травмой или заболеванием, часто требуют трансплантатов биоматериала для полной регенерации¹. Современные методы, предназначенные для улучшения регенерации костной ткани, регулярно используют аутологичные, аллогенные, ксеногенные или синтетические трансплантаты². Для аутологичной костной пластики, которая считается «золотым стандартом» трансплантации для исправления больших костных дефектов, кость извлекается у пациента. Тем не менее, эта процедура трансплантации имеет ряд недостатков, включая ограничения по размеру и форме, доступность тканей и заболеваемость в месте забора материала

протокол

Протоколы экспериментов были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Оттавы.

1. Подготовка строительных лесов

1. С помощью мандолинного слайсера нарежьте яблоки McIntosh (Canada Fancy) ломтиками толщиной 8 мм. Нарежьте ткань гипантия яблочных долек на квадраты размером 5 мм х 5 мм.
2. Поместите квадратные образцы в 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) на 2 дня.
3. Промойте децеллюляризованные образцы деионизированной водой и инкубируйте их в течение ночи при комнатной температуре (RT) в 100 мМ CaCl₂ для удаления оставшегося поверхностно-активного вещества.
4. Ст....

Результаты

Измерение размера пор, распределение клеток и минерализация in vitro (Рисунок 1 и Рисунок 2)
Полное удаление нативных клеточных компонентов каркасов тканей яблони было достигнуто после обработки скаффолдов SDS и CaCl₂ (рис. 1А

Обсуждение

Несколько исследований in vitro и in vivo продемонстрировали биосовместимость целлюлозы растительного происхождения и ее потенциальное использование в тканевой инженерии 14,15,16,18,19,20, в частности, для проведения остеогенной дифференциации ^<.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology