Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أحدثت عضويات الورم ثورة في أبحاث السرطان ونهج الطب الشخصي. إنها تمثل نموذجا للورم ذا صلة سريريا يسمح للباحثين بالبقاء متقدما بخطوة على الورم في العيادة. يحدد هذا البروتوكول عضويات الورم من عينات أنسجة ورم البنكرياس الطازجة والطعوم الخارجية المشتقة من المريض من أصل سرطان البنكرياس الغدي.

Abstract

عضويات الورم هي نماذج ورم ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي تلخص السمات البيولوجية الرئيسية لأنسجة الورم الأولية الأصلية. تم استخدام عضويات الورم المشتقة من المريض في أبحاث السرطان الانتقالية ويمكن تطبيقها لتقييم حساسية العلاج ومقاومته ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ، وتفاعلات الخلايا السرطانية مع البيئة المكروية للورم. عضويات الورم هي أنظمة زراعة معقدة تتطلب تقنيات زراعة الخلايا المتقدمة ووسائط الاستزراع مع كوكتيلات عامل نمو محددة وغشاء قاعدي بيولوجي يحاكي البيئة خارج الخلية. تعتمد القدرة على إنشاء ثقافات الورم الأولية بشكل كبير على نسيج المنشأ والخلوية والسمات السريرية للورم ، مثل درجة الورم. علاوة على ذلك ، فإن جمع عينات الأنسجة ، وجودة المواد وكميتها ، بالإضافة إلى البنوك الحيوية الصحيحة والتخزين هي عناصر حاسمة في هذا الإجراء. كما أن القدرات التقنية للمختبر هي أيضا عوامل حاسمة يجب مراعاتها. هنا ، نبلغ عن إجراء تشغيلي موحد / بروتوكول تم التحقق من صحته وهو مجدي تقنيا واقتصاديا لثقافة عضويات الورم خارج الجسم الحي من عينات الأنسجة الطازجة من أصل غدية البنكرياس ، إما من أنسجة المتبرعين بالمرضى الأولية الجديدة أو الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX). يمكن إجراء التقنية الموصوفة هنا في المختبرات ذات زراعة الأنسجة الأساسية ومرافق الفئران وهي مصممة للتطبيق على نطاق واسع في مجال الأورام الانتقالي.

Introduction

عضويات الورم هي ثقافات منظمة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي مشتقة من أنسجة الورم الطازجة وتوفر نماذج سرطانية. تلخص عضويات الورم السمات البيولوجية الرئيسية للورم الأولي الأصلي1،2،3،4 ويمكن توسيعها لمدة تصل إلى عدة أشهر وحفظها بالتبريد ، على غرار خطوط الخلايا الخالدة التقليدية. توفر عضويات الورم بنكا حيويا لنماذج الورم المشتقة من المريض للطب الانتقالي / الشخصي5 وتمثل تقدما مهما في أنظمة / نماذج بيولوجيا الخلايا السرطانية. يمكن استخدام عضويات الورم المشتقة من المريض كنماذج خارج الجسم الحي للتنبؤ بفعالية علاجات الأورام / الأدوية المساعدة (الجديدة) ، والتي يتم إنشاء ثقافات لها من أنسجة الورم الطازجة ويتم إجراء فحوصات حساسية الدواء أو التنميط الدوائي على أساس خاص بالمريض لتحديد العوامل الفعالة لخطوط العلاج اللاحقة 1,4. علاوة على ذلك ، تتغلب الكائنات العضوية السرطانية على محدودية توافر أنسجة الورم الأولية ، والأهم من ذلك ، أنها توفر بديلا ممتازا أو نظاما تكميليا لنماذج الفئران في الجسم الحي ، مثل الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) 2. يزداد تعقيد عضويات الورم إذا تم دمج الخلايا السرطانية الأولية مع الخلايا اللحمية الموجودة في البيئة الدقيقة للورم (TME) ، مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) ، والخلايا البطانية ، والخلايا المناعية ، والتي تحاكي عمل الورم الرئيسي وخلويته المعقدة. تم إنشاء عضويات الورم للعديد من أنواع الأورام باستخدام بروتوكولات موحدة6،7،8،9،10. الانتشار العضوي من الأورام الصلبة المختلفة ، بما في ذلك أنسجة سرطان القولون والمستقيم والثدي ، راسخ وبأسعار معقولة تقنيا11،12،13،14،15.

توفر عمليات استئصال الورم الجراحية أو خزعات الورم عينات أنسجة الورم الأولية. من الناحية المثالية ، يجب أن تأتي عينات أنسجة الورم من مركز كتلة الورم أو الحافة الغازية للورم ، وكذلك الأنسجة ذات المظهر الطبيعي المجاورة للورم. بالمقارنة مع الثقافات التقليدية 2D ، تتطلب عضويات الورم العديد من "الإضافات" ، بما في ذلك الغشاء القاعدي البيولوجي (مثل Matrigel أو hydrogel أو سقالة قائمة على الكولاجين) ، والتي تحاكي TME خارج الخلية ، ووسط نمو سائل يوفر مغذيات محددة وعوامل نمو ويدعم تكاثر الخلايا وصلاحيتها في الثقافة16.

تتمثل الخطوات الأساسية في زراعة الخلايا الأولية في غسل الأنسجة في محلول ملحي لمنع التلوث ، وقطع / هضم الورم ميكانيكيا إلى قطع صغيرة من 1-3 مم3 ، والعلاج بالكولاجيناز للهضم الأنزيمي للأنسجة. ثم يتم ترشيح المزيج المهضوم لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة ، وإعادة تعليقه في غشاء قاعدي بيولوجي مثل Matrigel ، ومطلي كقباب في ألواح ثقافة منخفضة التعلق لتعزيز نمو عدم التعلق. يتم تغطية قباب مصفوفة الغشاء القاعدي بوسط ثقافة سائلة وتستكمل بالجلوتامين والمضادات الحيوية لتجنب التلوث ، وكذلك بعوامل نمو محددة اعتمادا على نوع الأنسجة7،8،9،16،17. يمكن أيضا عزل الخلايا الأخرى ذات الصلة الموجودة داخل الورم السائب و TME ، مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) والخلايا المناعية. تسمح هذه التقنية ، التي تمت مراجعتها مؤخرا18 ، بإنشاء ثقافات مشتركة مع أنواع مختلفة من الخلايا لدراسة الاستجابة للعلاج في بيئة ورم أكثر "واقعية". علاوة على ذلك ، يمكن دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والتفاعل بين الخلايا السرطانية ومكونات المصفوفة البيولوجية المحيطة.

يبلغ معدل النجاح المبلغ عنه لإنشاء الورم العضوي باستخدام أنسجة جديدة من الخزعات أو أنسجة ورم الجهاز الهضمي المقطوعة حوالي 50٪ 11 ، ويعتمد معدل النجاح من الأخير إلى حد كبير على نوع الأنسجة وأصلها4 ، لا سيما درجة الورم وخلوية الورم بشكل عام. تتميز نماذج الأورام ثلاثية الأبعاد بتعقيد متفاوت ، من المجاميع أحادية الخلية البسيطة إلى النماذج الهندسية المعقدة للغاية التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا. المصطلحات المستخدمة لوصف الثقافات ثلاثية الأبعاد في الأدبيات غير متسقة إلى حد كبير19،20،21 ، حيث يتم استخدام مصطلحات مختلفة مثل الأجسام الكروية وكرات الأورام والكائنات العضوية ، على الرغم من أن الفرق بينهما غير واضح. نظرا لأنه لم يتم التوصل بعد إلى إجماع واضح على التعريف ، في هذه المقالة ، يوصف العضو العضوي الورمي بأنه ثقافة خلية ورمية منظمة مضمنة في غشاء قاعدي بيولوجي.

هنا ، تم الإبلاغ عن بروتوكول تم التحقق من صحته لإنشاء عضويات الورم من عينات الأنسجة الطازجة الناشئة من سرطان البنكرياس الغدي القنوي الأولي أو المشتق من PDX (PDAC) ، ويمكن إجراء هذا البروتوكول في معظم المختبرات مع مرافق زراعة الأنسجة الأساسية. تم تكييف هذا البروتوكول من العديد من البروتوكولات الحديثة المبلغ عنها والتي تستخدم حاليا لإنشاء عضويات الورم أو الأورام من أنسجة الورم الهضمي من مجموعات David Tuveson9 و Hans Clevers8 و Aurel Perren7.

لا يناقش هذا البروتوكول كيفية حصاد الأنسجة الطازجة. للحصول على أنسجة أورام بشرية طازجة عالية الجودة ، من المهم أن يكون هناك تنسيق فعال بين الجراحين الذين يحصدون الأنسجة وقسم علم الأمراض الذي يستخرج عينة الأنسجة للثقافة العضوية. وبالمثل ، عند استخدام PDX كمصدر جديد للأنسجة ، فإن التنسيق الفعال مع الشخص الذي يحصد عينة الأنسجة مهم أيضا. من الأهمية بمكان الحصول على عينة الأنسجة في أسرع وقت ممكن (في غضون 30-60 دقيقة من وقت الحصاد) من أجل الحفاظ على جودة عالية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية التجارب التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة مدريد المستقلة (CEI 103-1958-A337) و La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) ووفقا للمبادئ التوجيهية للسلوك الأخلاقي في رعاية واستخدام على النحو المنصوص عليه في المبادئ التوجيهية الدولية للبحوث الطبية الحيوية التي تشمل ، تم تطويره من قبل مجلس المنظمات الدولية للعلوم الطبية (CIOMS). اتبع البروتوكول المبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية الحيوية بموافقة خطية مستنيرة. تم الحصول على موافقة أخلاقية مسبقة لاستخدام الأنسجة الطازجة لإنشاء مزارع الورم العضوية. تم تقديم العينات من قبل مستشفى البنك الحيوي Ramón y Cajal-IRYCIS (السجل الوطني للبنوك الحيوية B.0000678) ، وتم دمجها في منصة البنوك الحيوية والنماذج الحيوية الخاصة ب ISCIII (PT20 / 00045) ، ومعالجتها وفقا لإجراءات التشغيل القياسية مع الموافقة الأخلاقية المناسبة. تم زرع الأورام تحت الجلد ، كما هو موضح سابقا22 ، في إناث الفئران العارية NU-Foxn1nu البالغة من العمر 6 أسابيع (انظر جدول المواد) وتم تمريرها في الجسم الحي لإنشاء PDAC PDXs.

1. التحضير التجريبي

  1. التعامل مع العينات البشرية في خزانة السلامة الأحيائية من الدرجة الثانية.
  2. ارتد معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات طوال الإجراء لتجنب العدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالأنسجة.
    ملاحظة: مطلوب ما لا يقل عن 3 ساعات لمعالجة عينة الأنسجة الطازجة ولوحة المواد العضوية والخلايا الليفية.
  3. قم بمعالجة عينات الأنسجة الطازجة22 في غضون 24 ساعة كحد أقصى من الحصاد ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في وسط زراعة الأنسجة (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) حتى المعالجة.
  4. احتفظ بجميع العينات والكواشف على الجليد أثناء الإجراء بأكمله ، وتأكد من ضبط جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا على 4 درجات مئوية واستخدامه بسرعة منخفضة لتجنب إتلاف تحضير الخلية.
  5. قم بتخزين أطراف ماصة P1000 و P200 في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لاستخدامها أثناء البروتوكول.
  6. قسمة مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) قبل الاستخدام. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يوصى باستخدام 250 مل من القسامة.

2. معالجة أنسجة الورم الأولية الطازجة لإنشاء عضويات الورم والخلايا الليفية الأولية

ملاحظة: مطلوب ما لا يقل عن 3 ساعات لمعالجة عينة الأنسجة الطازجة (إما الأورام البشرية الأولية القابلة للاستئصال أو PDXs) ولوحة عضويات الورم والخلايا الليفية. يوضح الشكل 1 مخططا لعملية تحضير العضو العضوي، من هضم الأنسجة إلى طلاء عضويات الورم. قبل بدء البروتوكول ، أخرج حصة من مصفوفة الغشاء القاعدي من الفريزر -20 درجة مئوية ، واتركها على الثلج لمدة 30-60 دقيقة تقريبا قبل الاستخدام.

  1. ضع صفيحة استزراع ذات 6 آبار في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية قبل 3 ساعات من طلاء المواد العضوية.
  2. قم بقياس وتصوير وغسل الأنسجة (الخطوة 1.3) ب 3 مل من DMEM-F12 المتقدم (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / خليط المغذيات F-12 Ham (F12) ، المكمل بمصل بقري جنيني 5٪ (FBS) ، 15 مللي مول هيبس ، 1٪ ل-جلوتامين ، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين ، 125 نانوغرام / مل أمفوتريسين ب ، 0.1 مجم / مل نورموسين) (انظر جدول المواد) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ثم غسله ب 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
  3. قم بإزالة الوسائط عن طريق الشفط من لوحة زراعة الأنسجة وقطع الأنسجة إلى 1 مم3 قطع في صفيحة زراعة الأنسجة المعقمة باستخدام شفرتين معقمتين و 2 مل من وسط الهضم (Advanced DMEM-F12 + 10 mg Collagenase IV / mL ، 0.000625٪ Trypsin-EDTA ، و 10 ميكروغرام / مل DNase). اجمع الأنسجة في أنبوب سعة 50 مل بإجمالي 5 مل من وسائط الهضم واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهضم الميكانيكي باستخدام المعدات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) أو بالخلط الدوري للعينة ، عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
  4. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 لتعطيل التربسين ، وقم بتصفية العينة من خلال مصفاة مسام 70 ميكرومتر لإزالة الحطام الكبير.
  5. أضف 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS إلى الجزء العلوي من المرشح ، واجمع الحطام وبقايا الأنسجة لإنشاء مزارع الخلايا الليفية (انظر الخطوة 5).
  6. أجهزة الطرد المركزي الترشيح في 200-300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ونضح طاف ، وترك فقط بيليه الخلية. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 4 مل من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم (ACK ، انظر جدول المواد). مرر الخليط إلى أنبوب سعة 15 مل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتحلل خلايا الدم الحمراء.
    ملاحظة: يمكن إزالة خطوة تحلل خلايا الدم الحمراء هذه عندما لا يكون هناك دليل واضح على التلوث.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ونضح المادة الطافية. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
  9. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) المكمل ب DNase (1 ميكروغرام / مل) إلى حبيبات الخلية ، واحتضانها لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، ونضح طاف. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 ، وأعد تعليق حبيبات الخلية.
  11. ماصة صعودا وهبوطا 30 مرة مع ماصة P1,000 لفصل الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × غرام ، وإزالة المادة الطافية.
  12. خذ أطراف ماصة P1,000 و P200 من الفريزر -20 درجة مئوية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة الغشاء باستخدام ماصة P1,000 وأطراف باردة (50 ميكرولتر لكل قطرة ، مع مراعاة حجم الحبيبات ، من ستة إلى سبعة قباب لكل بئر). أخرج اللوحة التي تم تسخينها مسبقا من الحاضنة. اضبط ماصة P200 على 48 ميكرولتر ، واستخدم الأطراف الباردة لإنشاء قباب من مصفوفة الغشاء القاعدي في لوحة 6 آبار مسخنة مسبقا.
  13. ضع اللوحة مع قباب مصفوفة الخلايا الغشائية القاعدية في حاضنة CO2 37 °C 5٪ لمدة 15 دقيقة لترسيخ مصفوفة الغشاء القاعدي.
  14. أضف 2-2.5 مل من DMEM-F12 المتقدم ، مع استكماله بعامل نمو البشرة البشري المؤتلف 20 نانوغرام / مل (EGF) ، وعامل نمو المشيمة البشرية 100 نانوغرام / مل (PlGF) ، وعامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية المؤتلف 10 نانوغرام / مل (bFGF) ، وعامل النمو الشبيه بالأنسولين 769 نانوغرام / مل -1 (IGF-1) ، ومثبط ROCK 10.5 ميكرومتر (DMEM-F12 المتقدم + عوامل النمو) (انظر جدول المواد).

3. مراقبة المواد العضوية

  1. مراقبة ثقافة الورم العضوية بصريا لأول 7 أيام ثم ثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك.
  2. قم بتغيير الوسط مرتين في الأسبوع باستخدام DMEM-F12 المتقدم الذي يحتوي على 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (EGF) ، وعامل نمو المشيمة البشرية 100 نانوغرام / مل (PlGF) ، وعامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية المؤتلف 10 نانوغرام / مل (bFGF) ، وعامل النمو الشبيه بالأنسولين 769 نانوغرام / مل -1 (IGF-1) ، ومثبط 10.5 ميكرومتر ROCK (DMEM-F12 المتقدم + عوامل النمو).
  3. التقط صورا لثقافة الورم العضوية بشكل دوري في اليوم 1 واليوم 3 واليوم 7 واليوم 10 واليوم 15 بعد معالجة العينة وطلاء الثقافة في المصفوفة لمراقبة النمو والجدوى.

4. مرور وتخزين المواد العضوية بالتبريد

  1. قم بإزالة وسط الاستزراع من لوحة 6 آبار.
  2. أضف 1 مل من كاشف استعادة الخلية المناسب (انظر جدول المواد) لفصل مصفوفة الغشاء القاعدي والحصول على تعليق خلية ، واستعادة المادة الطافية في أنبوب سعة 15 مل. إذا لم تنفصل المصفوفة على الفور ، احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى تذوب تماما.
  3. أضف 1 مل من نفس كاشف استعادة الخلية المستخدم في الخطوة 4.2 إلى بئر اللوحة لاستعادة الخلايا المنفصلة الإضافية ، وأضف المادة الطافية إلى نفس الأنبوب 15 مل كما في الخطوة 4.2.
  4. أضف 5 مل من DMEM-F12 المتقدم البارد ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. قم بإزالة المادة الطافية وجفف الحبيبات بعناية عن طريق إزالة أي سائل متبقي باستخدام ماصة سعة 5 مل ؛ تجنب تحريك الأنبوب قدر الإمكان. أعد تعليق حبيبات الخلية في ضعف الحجم الأصلي لمصفوفة الغشاء القاعدي من أجل الحصول على ممر 1: 2.
  6. للتخزين بالتبريد للمزارع العضوية ، أعد تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.5 بوصة 1 مل من وسط التجميد (10٪ DMSO ، 20٪ FBS ، 50٪ DMEM-F12 ، مثبط 10.5 ميكرومتر ROCK) ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تعديل حجم مصفوفة الغشاء القاعدي لأداء مقاطع مختلفة ، مثل 1: 1 (باستخدام نفس حجم مصفوفة الغشاء القاعدي مثل الأصل) أو 1: 3 (إضافة ثلاثة أضعاف الحجم الأصلي لمصفوفة الغشاء القاعدي).

5. إنشاء الخلايا الليفية

  1. بعد استعادة الحطام وبقايا الأنسجة في 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS ، أضف هذا إلى لوحة 6 آبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. قم بإزالة بقايا الأنسجة من مزارع الخلايا الليفية من الخطوة 2.5 عن طريق شفط الوسط بعد يومين أو 3 أيام من الطلاء ، واستبدله ب DMEM الطازج بنسبة 10٪ FBS.
  3. راقب ثقافة الخلايا الليفية بصريا ثلاث مرات في الأسبوع ، وقم بتغيير وسط الاستزراع مرتين على الأقل في الأسبوع باستخدام DMEM المكمل ب 10٪ FBS.

النتائج

من المهم توثيق كيفية تقدم ثقافة الورم العضوي بمرور الوقت ، خاصة في الأسابيع القليلة الأولى ، من أجل تقدير كيفية تصرف الثقافة في فحوصات المصب. يوضح الشكل 2 مثالا على العزل الأمثل للخلايا السرطانية وتكوين الورم العضوي من الأنسجة الطازجة على مدار 15 يوما. في بعض الأحيان، يوجد ح...

Discussion

تمثل التطورات الرئيسية في علاجات السرطان الدوائية تحديا ، حيث أن احتمال الموافقة على الأدوية في المرحلة الأولى من التجارب السريرية للأورام هو 5.1٪ ، وهو أدنى مستوى بين جميع أنواع الأمراض23. السبب الرئيسي هو أن السرطان غير متجانس للغاية ، وبالتالي ، فإن مجموعات المرضى لا تستجيب ...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بتمويل من Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I + D + i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20 / 00045) ، برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 857381 ، مشروع VISION (استراتيجيات لتعزيز التميز العلمي والقدرة على الابتكار للتشخيص المبكر لسرطانات الجهاز الهضمي) ، دعوة داخلية لمشاريع بحثية جديدة للباحثين السريريين ومجموعات البحث الناشئة IRYCIS (2021/0446) ، مشروع Patient Derived Organoids 2.0 (CIBERONC) ومشروع TRANSCAN II JTC 2017 دعوة "إنشاء خوارزمية للتشخيص المبكر ومتابعة المرضى الذين يعانون من أورام الغدد الصم العصبية في البنكرياس (NExT)" ، رقم المنحة 1.1.1.5 / ERANET / 20/03. تم توفير العينات البيولوجية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل مستشفى البنك الحيوي Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) وتم دمجها في منصة البنوك الحيوية والنماذج الحيوية التابعة ل ISCIII (PT20 / 00045). نود أيضا أن نشكر إيفون كول وأغابي كاتاكي فيتا روفيتا وثورستن نول على دعمهم القيم لتطوير هذا البروتوكول كجزء من مشاريع NExT و VISION.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well Costar Ultra-low Attachment platesBiofilTCP011006
70 μm pore strainerVWR732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis BufferGibcoA10492-01
Amphotericin BGibco15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)NuaireNU-4750E
Cell recovery solutionCorning 354253
Collagenase IVGibco17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPESGibco31330-038
DNaseRoche10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-079-CV
Freezing container, NalgeneMerckC1562
gentleMACS Octo DissociatorMilteny Biotec130-096-427
HEPESGibco15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)enQuireBioQP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude miceJanvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)InvitrogenRP10931
L-GlutamineCorning354235
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning356234
NormocinInvivoGenant-nr-2
Pasteur pipettesDeltalab200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)Corning30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)GibcoPHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)GibcoPHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL72304
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501
Surgical BladesNahitaFMB018
TrypsinGibco25300054

References

  1. April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
  2. Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
  3. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  4. Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
  6. Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
  7. April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
  8. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
  11. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
  12. Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
  13. Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
  14. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
  17. Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
  18. Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
  19. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  20. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  21. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  22. Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
  23. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  24. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  25. Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
  26. Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
  27. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
  28. Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
  29. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  30. Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
  31. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  32. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  33. Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
  34. Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
  35. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
  36. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  37. Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195 SOP PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved