Costituzione di organoidi e fibroblasti tumorali derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco

Riepilogo

Gli organoidi tumorali hanno rivoluzionato la ricerca sul cancro e l'approccio alla medicina personalizzata. Rappresentano un modello tumorale clinicamente rilevante che consente ai ricercatori di stare un passo avanti rispetto al tumore in clinica. Questo protocollo stabilisce organoidi tumorali da campioni di tessuto tumorale pancreatico fresco e xenotrapianti derivati da pazienti di origine adenocarcinoma pancreatica.

Abstract

Gli organoidi tumorali sono modelli tumorali tridimensionali (3D) ex vivo che ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave dei tessuti tumorali primari originali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono stati utilizzati nella ricerca traslazionale sul cancro e possono essere applicati per valutare la sensibilità e la resistenza al trattamento, le interazioni cellula-cellula e le interazioni delle cellule tumorali con il microambiente tumorale. Gli organoidi tumorali sono sistemi di coltura complessi che richiedono tecniche avanzate di coltura cellulare e terreni di coltura con cocktail di fattori di crescita specifici e una membrana basale biologica che imita l'ambiente extracellulare. La capacità di stabilire colture tumorali primarie dipende fortemente dal tessuto di origine, dalla cellularità e dalle caratteristiche cliniche del tumore, come il grado del tumore. Inoltre, la raccolta dei campioni di tessuto, la qualità e la quantità dei materiali, nonché la corretta biobanca e conservazione sono elementi cruciali di questa procedura. Anche le capacità tecniche del laboratorio sono fattori cruciali da considerare. In questo articolo, riportiamo una SOP/protocollo convalidato che è tecnicamente ed economicamente fattibile per la coltura di organoidi tumorali ex vivo da campioni di tessuto fresco di origine adenocarcinoma pancreatica, sia da tessuto di donatore paziente primario fresco resecato che da xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). La tecnica qui descritta può essere eseguita in laboratori con colture tissutali di base e strutture murine ed è adattata per un'ampia applicazione nel campo dell'oncologia traslazionale.

Introduzione

Gli organoidi tumorali sono colture organizzate tridimensionali (3D) ex vivo derivate da tessuto tumorale fresco e forniscono modelli di cancro. Gli organoidi tumorali ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave del tumore primario ^originale 1,2,3,4 e possono essere espansi fino a diversi mesi e crioconservati^, in modo simile alle linee cellulari immortalizzate convenzionali. Gli organoidi tumorali forniscono una biobanca di modelli tumorali derivati da pazienti per la medicina traslazionale/personalizzata⁵

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per il benessere degli animali da esperimento approvate dal Comitato Etico dell'Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) e La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) e in conformità con le linee guida per la condotta etica nella cura e nell'uso degli animali come indicato nei Principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolge gli animali. sviluppato dal Consiglio per le Organizzazioni Internazionali delle Scienze Mediche (CIOMS). Il protocollo ha seguito i principi etici per la ricerca biomedica con il consenso informato scritto. È stata ottenuta una preventiv....

Discussione

I principali progressi nelle terapie farmacologiche antitumorali sono impegnativi, poiché la probabilità di approvazione dei farmaci negli studi clinici oncologici di fase I è del 5,1%, che è la più bassa di tutti i tipi di malattia²³. Il motivo principale è che il cancro è molto eterogeneo e, pertanto, le coorti di pazienti non rispondono uniformemente come previsto al trattamento dato, il che evidenzia la necessità di un approccio più personalizzato. Le colture bidimensionali (2D) sono .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054