Costituzione di organoidi e fibroblasti tumorali derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco

Riepilogo

Gli organoidi tumorali hanno rivoluzionato la ricerca sul cancro e l'approccio alla medicina personalizzata. Rappresentano un modello tumorale clinicamente rilevante che consente ai ricercatori di stare un passo avanti rispetto al tumore in clinica. Questo protocollo stabilisce organoidi tumorali da campioni di tessuto tumorale pancreatico fresco e xenotrapianti derivati da pazienti di origine adenocarcinoma pancreatica.

Abstract

Gli organoidi tumorali sono modelli tumorali tridimensionali (3D) ex vivo che ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave dei tessuti tumorali primari originali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono stati utilizzati nella ricerca traslazionale sul cancro e possono essere applicati per valutare la sensibilità e la resistenza al trattamento, le interazioni cellula-cellula e le interazioni delle cellule tumorali con il microambiente tumorale. Gli organoidi tumorali sono sistemi di coltura complessi che richiedono tecniche avanzate di coltura cellulare e terreni di coltura con cocktail di fattori di crescita specifici e una membrana basale biologica che imita l'ambiente extracellulare. La capacità di stabilire colture tumorali primarie dipende fortemente dal tessuto di origine, dalla cellularità e dalle caratteristiche cliniche del tumore, come il grado del tumore. Inoltre, la raccolta dei campioni di tessuto, la qualità e la quantità dei materiali, nonché la corretta biobanca e conservazione sono elementi cruciali di questa procedura. Anche le capacità tecniche del laboratorio sono fattori cruciali da considerare. In questo articolo, riportiamo una SOP/protocollo convalidato che è tecnicamente ed economicamente fattibile per la coltura di organoidi tumorali ex vivo da campioni di tessuto fresco di origine adenocarcinoma pancreatica, sia da tessuto di donatore paziente primario fresco resecato che da xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). La tecnica qui descritta può essere eseguita in laboratori con colture tissutali di base e strutture murine ed è adattata per un'ampia applicazione nel campo dell'oncologia traslazionale.

Introduzione

Gli organoidi tumorali sono colture organizzate tridimensionali (3D) ex vivo derivate da tessuto tumorale fresco e forniscono modelli di cancro. Gli organoidi tumorali ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave del tumore primario ^originale 1,2,3,4 e possono essere espansi fino a diversi mesi e crioconservati^, in modo simile alle linee cellulari immortalizzate convenzionali. Gli organoidi tumorali forniscono una biobanca di modelli tumorali derivati da pazienti per la medicina traslazionale/personalizzata⁵ e rappresentano un importante progresso nei sistemi/modelli di biologia delle cellule tumorali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti possono essere utilizzati come modelli ex vivo per prevedere l'efficacia delle terapie oncologiche/farmacologiche (neo)adiuvanti, per le quali vengono stabilite colture da tessuto tumorale fresco e vengono eseguiti saggi di sensibilità ai farmaci o farmacotipizzazione su base paziente-specifica per identificare agenti efficaci per le successive linee di terapia ^1,4. Inoltre, gli organoidi tumorali superano i limiti della disponibilità di tessuto tumorale primario e, cosa più importante, forniscono un eccellente sistema alternativo o complementare ai modelli murini in vivo, come gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX)². La complessità degli organoidi tumorali aumenta se le cellule tumorali primarie sono combinate con le cellule stromali che si trovano nel microambiente tumorale (TME), come i fibroblasti associati al cancro (CAF), le cellule endoteliali e le cellule immunitarie, che imitano il funzionamento e la complessa cellularità del tumore primario. Gli organoidi tumorali sono stati stabiliti per molti tipi di tumore utilizzando i protocolli standardizzati 6,7,8,9,10. La propagazione degli organoidi da diversi tumori solidi, tra cui il tessuto del cancro del colon-retto e della mammella, è ben consolidata e tecnicamente conveniente 11,12,13,14,15.

Le resezioni chirurgiche del tumore o le biopsie tumorali forniscono campioni di tessuto tumorale primario. Idealmente, i campioni di tessuto tumorale dovrebbero provenire dal centro della massa tumorale o dal bordo invasore del tumore, nonché dal tessuto dall'aspetto normale adiacente al tumore. Rispetto alle colture 2D convenzionali, gli organoidi tumorali richiedono diversi "componenti aggiuntivi", tra cui una membrana basale biologica (come Matrigel, idrogel o un'impalcatura a base di collagene), che imita la TME extracellulare, e un terreno di crescita liquido che fornisce nutrienti e fattori di crescita specifici e supporta la proliferazione e la vitalità cellulare in coltura¹⁶.

Le fasi più basilari della coltura cellulare primaria sono il lavaggio del tessuto in soluzione salina per prevenire la contaminazione, il taglio/digestione meccanica del tumore in piccoli pezzi di 1-3^mm3 e il trattamento con collagenasi per la digestione enzimatica del tessuto. La miscela digerita viene quindi filtrata per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni, risospesa in una membrana basale biologica come Matrigel e placcata come cupole in piastre di coltura a basso attaccamento per migliorare la crescita senza attaccamento. Le cupole della matrice della membrana basale sono ricoperte con terreno di coltura liquido e integrate con glutammina e antibiotici per evitare contaminazioni, nonché con fattori di crescita specifici a seconda del tipo di tessuto 7,8,9,16,17. Possono essere isolate anche altre cellule rilevanti presenti all'interno del tumore di massa e della TME, come i fibroblasti associati al cancro (CAF) e le cellule immunitarie. Questa tecnica, che è stata recentemente rivista¹⁸, consente la costituzione di co-colture con diversi tipi cellulari per studiare la risposta alla terapia in un ambiente tumorale più "realistico". Inoltre, possono essere studiate le interazioni cellula-cellula e l'interazione tra cellule tumorali e componenti della matrice biologica circostante.

Il tasso di successo riportato per l'insediamento di organoidi tumorali utilizzando tessuto fresco proveniente da biopsie o tessuto tumorale gastrointestinale resecato è di circa il 50%¹¹ e il tasso di successo di quest'ultimo dipende in gran parte dal tipo di tessuto e dall'origine⁴, in particolare dal grado del tumore e dalla cellularità complessiva del tumore. I modelli tumorali tridimensionali hanno una complessità variabile, da semplici aggregati unicellulari a modelli ingegnerizzati altamente complessi costituiti da vari tipi di cellule. La terminologia utilizzata per descrivere le culture 3D in letteratura è altamente incoerente 19,20,21, poiché vengono utilizzati termini diversi come sferoidi, tumoresfere e organoidi^, sebbene la differenza tra loro non sia chiara. Poiché non è stato ancora raggiunto un chiaro consenso sulla definizione, in questo articolo, un organoide tumorale è descritto come una coltura cellulare tumorale organizzata incorporata in una membrana basale biologica.

In questo documento, viene riportato un protocollo convalidato per la creazione di organoidi tumorali da campioni di tessuto fresco provenienti da adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) primario resecato o derivato da PDX, e questo protocollo può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori con strutture di coltura tissutale di base. Questo protocollo è stato adattato da diversi protocolli all'avanguardia che sono attualmente utilizzati per stabilire organoidi tumorali o tumoroidi da tessuto tumorale digestivo dei gruppi di David Tuveson⁹, Hans Clevers⁸ e Aurel Perren⁷.

Questo protocollo non discute il modo in cui il tessuto fresco viene raccolto. Per ottenere tessuto tumorale umano fresco di alta qualità, è importante avere un coordinamento efficiente tra i chirurghi che prelevano il tessuto e il reparto di patologia che estrae il campione di tessuto per la coltura di organoidi. Allo stesso modo, quando si utilizza PDX come fonte di tessuto fresco, è importante anche un coordinamento efficiente con la persona che raccoglie il campione di tessuto. È fondamentale ottenere il campione di tessuto il più rapidamente possibile (entro 30-60 minuti dal momento del prelievo) per mantenere un'elevata qualità.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per il benessere degli animali da esperimento approvate dal Comitato Etico dell'Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) e La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) e in conformità con le linee guida per la condotta etica nella cura e nell'uso degli animali come indicato nei Principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolge gli animali. sviluppato dal Consiglio per le Organizzazioni Internazionali delle Scienze Mediche (CIOMS). Il protocollo ha seguito i principi etici per la ricerca biomedica con il consenso informato scritto. È stata ottenuta una preventiva approvazione etica per l'uso di tessuto fresco per l'istituzione delle colture di organoidi tumorali. I campioni sono stati forniti dalla Biobanca Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Registro Nazionale delle Biobanche B.0000678), integrati nella Piattaforma Biobanche e Biomodelli dell'ISCIII (PT20/00045), e processati seguendo procedure operative standard con l'appropriata approvazione etica. I tumori sono stati impiantati per via sottocutanea, come descritto^{in precedenza 22}, in topi nudi femmine NU-Foxn1nu immunocompromessi di 6 settimane (vedi Tabella dei materiali) e passati in vivo per stabilire PDX PDAC.

1. Preparazione sperimentale

1. Maneggiare campioni umani in una cabina di biosicurezza di classe II.
2. Indossare un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali durante tutta la procedura per evitare l'infezione da agenti patogeni trasmessi dai tessuti.
   NOTA: Sono necessarie almeno 3 ore per processare il campione di tessuto fresco e placcare gli organoidi e i fibroblasti.
3. Processare i campioni di tessuto fresco 22 entro un massimo di²⁴ ore dal prelievo e conservare a 4 °C in terreno di coltura tissutale (DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina) fino alla lavorazione.
4. Tenere tutti i campioni e i reagenti sul ghiaccio durante l'intera procedura e assicurarsi di preimpostare una centrifuga refrigerata a 4 °C e di utilizzarla a bassa velocità per evitare di danneggiare la preparazione della cella.
5. Conservare i puntali per pipette P1.000 e P200 in un congelatore a -20 °C da utilizzare durante il protocollo.
6. Aliquotare la matrice della membrana basale (vedere la tabella dei materiali) prima dell'uso. Per questo protocollo, si raccomandano aliquote da 250 mL.

2. Elaborazione di tessuto tumorale primario fresco per stabilire organoidi tumorali e fibroblasti primari

NOTA: Sono necessarie almeno 3 ore per processare il campione di tessuto fresco (tumori umani primari resecabili o PDX) e per placcare gli organoidi tumorali e i fibroblasti. Nella Figura 1 è mostrato uno schema del processo di preparazione degli organoidi, dalla digestione dei tessuti alla placcatura degli organoidi tumorali. Prima di iniziare il protocollo, prelevare un'aliquota della matrice di membrana basale dal congelatore a -20 °C e lasciarla su ghiaccio per circa 30-60 minuti prima dell'uso.

1. Mettere una piastra di coltura a 6 pozzetti in un incubatore per colture cellulari a 37 °C 3 ore prima di placcare gli organoidi.
2. Misurare, fotografare e lavare il tessuto (passaggio 1.3) con 3 mL di Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F-12 Ham (F12), integrato con il 5% di siero fetale bovino (FBS), 15 mM di Hepes, 1% di L-Glutammina, 1% di Penicillina-Streptomicina, 125 ng/mL di Amfotericina B, 0,1 mg/mL di Normocina) (vedere la Tabella dei Materiali) pipettando su e giù e poi lavare con 3 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) pipettando su e giù.
3. Rimuovere il terreno mediante aspirazione dalla piastra di coltura tissutale e tagliare il tessuto in³ pezzi di 1 mm in una piastra di coltura sterile utilizzando due lame sterili e 2 mL di terreno di digestione (DMEM-F12 avanzato + 10 mg di collagenasi EV/mL, 0,000625% tripsina-EDTA e 10 μg/mL DNasi). Raccogliere il tessuto in una provetta da 50 mL con 5 mL totali di terreno di digestione e incubare per 1 ora a 37 °C con digestione meccanica con apparecchiature disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali) o con miscelazione periodica del campione, pipettando il campione su e giù.
4. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 per inattivare la tripsina e filtrare il campione attraverso un filtro per pori da 70 μm per rimuovere i detriti di grandi dimensioni.
5. Aggiungere 2 mL di DMEM con il 10% di FBS nella parte superiore del filtro e raccogliere i detriti e i resti di tessuto per stabilire colture di fibroblasti (vedere il passaggio 5).
6. Centrifugare il filtrato a 200-300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante, lasciando solo il pellet cellulare. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
7. Risospendere il pellet in 4 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro di potassio (ACK, vedere Tabella dei materiali). Passare la miscela in una provetta da 15 ml e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti per lisare i globuli rossi.
   NOTA: Questa fase di lisi dei globuli rossi può essere rimossa quando non ci sono prove visibili di contaminazione.
8. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
9. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) integrato con DNasi (1 μg/mL) al pellet cellulare e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente.
10. Centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare il surnatante. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 e risospendere il pellet cellulare.
11. Pipettare su e giù 30 volte con una pipetta P1.000 per dissociare le cellule, centrifugare per 5 minuti a 300 x g e rimuovere il surnatante.
12. Prelevare i puntali per pipette P1.000 e P200 dal congelatore a −20 °C e risospendere il pellet cellulare nella matrice di membrana utilizzando una pipetta P1.000 e puntali freddi (50 μL per goccia, tenendo conto del volume del pellet, da sei a sette cupole per pozzetto). Estrarre la piastra precedentemente riscaldata dall'incubatrice. Impostare una pipetta P200 su 48 μL e utilizzare puntali freddi per creare cupole della matrice della membrana basale nella piastra a 6 pozzetti preriscaldata.
13. Mettere la piastra con le cupole della matrice della membrana basale nell'incubatore a 37 °C 5% CO₂ per 15 minuti per solidificare la matrice della membrana basale.
14. Aggiungere 2-2,5 mL di Advanced DMEM-F12, integrato con 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF), 100 ng/mL di fattore di crescita della placenta umana (PlGF), 10 ng/mL di fattore di crescita di base dei fibroblasti umani ricombinanti (bFGF), 769 ng/mL di fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1) e 10,5 μM di inibitore ROCK (Advanced DMEM-F12 + fattori di crescita) (vedere la tabella dei materiali).

3. Monitoraggio degli organoidi

1. Monitorare visivamente la coltura dell'organoide tumorale per i primi 7 giorni e successivamente tre volte alla settimana.
2. Cambiare il terreno due volte alla settimana con Advanced DMEM-F12 contenente 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF), 100 ng/mL di fattore di crescita della placenta umana (PlGF), 10 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti di base umano ricombinante (bFGF), 769 ng/mL di fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1) e 10,5 μM di inibitore ROCK (Advanced DMEM-F12 + fattori di crescita).
3. Acquisire periodicamente immagini della coltura di organoidi tumorali il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7, il giorno 10 e il giorno 15 dopo aver elaborato il campione e placcato la coltura nella matrice per osservare la crescita e la vitalità.

4. Passaggio e crioconservazione degli organoidi

1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 6 pozzetti.
2. Aggiungere 1 mL di un reagente appropriato per il recupero cellulare (vedere Tabella dei materiali) per dissociare la matrice di membrana basale e ottenere una sospensione cellulare, quindi recuperare il surnatante in una provetta da 15 mL. Se la matrice non si dissocia immediatamente, incubare il campione a 4 °C per 15-20 minuti fino a completa dissoluzione.
3. Aggiungere 1 mL dello stesso reagente di recupero cellulare utilizzato nella fase 4.2 nel pozzetto della piastra per recuperare ulteriori cellule dissociate e aggiungere il surnatante nella stessa provetta da 15 mL della fase 4.2.
4. Aggiungere 5 ml di Advanced DMEM-F12 freddo e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
5. Rimuovere il surnatante e asciugare accuratamente il pellet rimuovendo il liquido residuo con una pipetta da 5 mL; Evitare il più possibile di spostare il tubo. Risospendere il pellet cellulare nel doppio del volume originale della matrice di membrana basale per ottenere un passaggio di 1:2.
6. Per la crioconservazione delle colture di organoidi, risospendere il pellet ottenuto nella fase 4,5 in 1 mL di terreno di congelamento (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10,5 μM ROCK inibitore) e conservare a -80 °C.
   NOTA: Il volume della matrice della membrana basale può essere regolato per eseguire diversi passaggi, ad esempio 1:1 (utilizzando lo stesso volume della matrice della membrana basale dell'originale) o 1:3 (aggiungendo tre volte il volume originale della matrice della membrana basale).

5. Insediamento dei fibroblasti

1. Dopo aver recuperato i detriti e i resti di tessuto in 2 mL di DMEM con il 10% di FBS, aggiungerlo a una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ .
2. Rimuovere i resti di tessuto dalle colture di fibroblasti dal passaggio 2.5 aspirando il terreno 2 giorni o 3 giorni dopo la placcatura e sostituirli con DMEM fresco con FBS al 10%.
3. Monitorare visivamente la coltura dei fibroblasti tre volte alla settimana e cambiare il terreno di coltura almeno due volte alla settimana utilizzando DMEM integrato con FBS al 10%.

Risultati

È importante documentare come la coltura di organoidi tumorali progredisce nel tempo, in particolare nelle prime settimane, al fine di stimare come si comporterà la coltura nei saggi a valle. La Figura 2 mostra un esempio di isolamento ottimale delle cellule tumorali e di insediamento di organoidi tumorali da tessuto fresco per un periodo di 15 giorni. A volte, c'è un grande volume di detriti cellulari nel campione ed è difficile vedere gli organoidi tumorali in via di sviluppo, come mos...

Discussione

I principali progressi nelle terapie farmacologiche antitumorali sono impegnativi, poiché la probabilità di approvazione dei farmaci negli studi clinici oncologici di fase I è del 5,1%, che è la più bassa di tutti i tipi di malattia²³. Il motivo principale è che il cancro è molto eterogeneo e, pertanto, le coorti di pazienti non rispondono uniformemente come previsto al trattamento dato, il che evidenzia la necessità di un approccio più personalizzato. Le colture bidimensionali (2D) sono ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054