Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Zusammenfassung

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Zusammenfassung

Tumororganoide sind dreidimensionale (3D) ex vivo Tumormodelle, die die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen primären Tumorgewebes rekapitulieren. Von Patienten stammende Tumororganoide wurden in der translationalen Krebsforschung verwendet und können zur Beurteilung der Behandlungsempfindlichkeit und -resistenz, der Zell-Zell-Interaktionen und der Tumorzellinteraktionen mit der Tumormikroumgebung eingesetzt werden. Tumor-Organoide sind komplexe Kultursysteme, die fortschrittliche Zellkulturtechniken und Nährmedien mit spezifischen Wachstumsfaktor-Cocktails und einer biologischen Basalmembran erfordern, die die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Die Fähigkeit, primäre Tumorkulturen zu etablieren, hängt stark vom Ursprungsgewebe, der Zellularität und den klinischen Merkmalen des Tumors, wie z. B. dem Tumorgrad, ab. Darüber hinaus sind die Entnahme von Gewebeproben, die Materialqualität und -quantität sowie das korrekte Biobanking und die Lagerung entscheidende Elemente dieses Verfahrens. Auch die technischen Möglichkeiten des Labors sind entscheidende Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt. Hier berichten wir über ein validiertes SOP/Protokoll, das technisch und wirtschaftlich für die Kultivierung von ex vivo Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben des Pankreas-Adenokarzinoms geeignet ist, entweder aus frischem primär reseziertem Patientenspendergewebe oder patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX). Die hier beschriebene Technik kann in Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultur- und Mauseinrichtungen durchgeführt werden und ist auf eine breite Anwendung im Bereich der translationalen Onkologie zugeschnitten.

Einleitung

Tumor-Organoide sind ex vivo dreidimensionale (3D) organisierte Kulturen, die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden und Krebsmodelle liefern. Tumor-Organoide rekapitulieren die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen Primärtumors 1,2,3,4 und können^, ähnlich wie herkömmliche immortalisierte Zelllinien, für bis zu mehrere Monate expandiert und kryokonserviert werden. Tumororganoide stellen eine Biobank von patientenabgeleiteten Tumormodellen für die translationale/personalisierte Medizin dar⁵ und ....

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für das Wohlergehen von Versuchstieren durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) und La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) genehmigt wurden, sowie in Übereinstimmung mit den Richtlinien für ethisches Verhalten bei der Pflege und Verwendung von Tieren, wie sie in den Internationalen Leitprinzipien für die biomedizinische Forschung mit Tieren festgelegt sind. vom Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) entwickelt. Das Protokoll folgte den ethischen Grundsätzen für biomedizinische Forschung mit schriftlicher Ein....

Diskussion

Große Fortschritte in der pharmakologischen Krebstherapie sind eine Herausforderung, da die Wahrscheinlichkeit der Zulassung von Medikamenten in klinischen Phase-I-onkologischen Studien bei 5,1 % liegt, was die niedrigste aller Krankheitsarten ist²³. Der Hauptgrund dafür ist, dass Krebs sehr heterogen ist und daher die Patientenkohorten nicht einheitlich wie erwartet auf die jeweilige Behandlung ansprechen, was unterstreicht, dass ein personalisierterer Ansatz erforderlich ist. Zweidimensionale .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054