Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Zusammenfassung

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Zusammenfassung

Tumororganoide sind dreidimensionale (3D) ex vivo Tumormodelle, die die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen primären Tumorgewebes rekapitulieren. Von Patienten stammende Tumororganoide wurden in der translationalen Krebsforschung verwendet und können zur Beurteilung der Behandlungsempfindlichkeit und -resistenz, der Zell-Zell-Interaktionen und der Tumorzellinteraktionen mit der Tumormikroumgebung eingesetzt werden. Tumor-Organoide sind komplexe Kultursysteme, die fortschrittliche Zellkulturtechniken und Nährmedien mit spezifischen Wachstumsfaktor-Cocktails und einer biologischen Basalmembran erfordern, die die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Die Fähigkeit, primäre Tumorkulturen zu etablieren, hängt stark vom Ursprungsgewebe, der Zellularität und den klinischen Merkmalen des Tumors, wie z. B. dem Tumorgrad, ab. Darüber hinaus sind die Entnahme von Gewebeproben, die Materialqualität und -quantität sowie das korrekte Biobanking und die Lagerung entscheidende Elemente dieses Verfahrens. Auch die technischen Möglichkeiten des Labors sind entscheidende Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt. Hier berichten wir über ein validiertes SOP/Protokoll, das technisch und wirtschaftlich für die Kultivierung von ex vivo Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben des Pankreas-Adenokarzinoms geeignet ist, entweder aus frischem primär reseziertem Patientenspendergewebe oder patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX). Die hier beschriebene Technik kann in Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultur- und Mauseinrichtungen durchgeführt werden und ist auf eine breite Anwendung im Bereich der translationalen Onkologie zugeschnitten.

Einleitung

Tumor-Organoide sind ex vivo dreidimensionale (3D) organisierte Kulturen, die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden und Krebsmodelle liefern. Tumor-Organoide rekapitulieren die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen Primärtumors 1,2,3,4 und können^, ähnlich wie herkömmliche immortalisierte Zelllinien, für bis zu mehrere Monate expandiert und kryokonserviert werden. Tumororganoide stellen eine Biobank von patientenabgeleiteten Tumormodellen für die translationale/personalisierte Medizin dar⁵ und stellen einen wichtigen Fortschritt in den Systemen und Modellen der Krebszellbiologie dar. Patienten-abgeleitete Tumor-Organoide können als Ex-vivo-Modelle verwendet werden, um die Wirksamkeit von (neo)adjuvanten onkologischen/pharmakologischen Therapien vorherzusagen, für die Kulturen aus frischem Tumorgewebe etabliert und Arzneimittelsensitivitätsassays oder Pharmakotypisierungen patientenspezifisch durchgeführt werden, um wirksame Wirkstoffe für nachfolgende Therapielinien zu identifizieren ^1,4. Darüber hinaus überwinden Tumororganoide die Begrenzung der Verfügbarkeit von primärem Tumorgewebe und, was noch wichtiger ist, sie bieten eine hervorragende Alternative oder Ergänzung zu In-vivo-Mausmodellen, wie z. B. patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX)². Die Komplexität von Tumororganoiden wird erhöht, wenn die primären Tumorzellen mit Stromazellen kombiniert werden, die sich in der Tumormikroumgebung (TME) befinden, wie z. B. krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), Endothelzellen und Immunzellen, die die Funktionsweise und komplexe Zellularität des Primärtumors nachahmen. Tumor-Organoide wurden für viele Tumorarten unter Verwendung standardisierter Protokolle 6,7,8,9,10 etabliert. Die Vermehrung von Organoiden aus verschiedenen soliden Tumoren, einschließlich Darm- und Brustkrebsgewebe, ist gut etabliert und technisch erschwinglich 11,12,13,14,15.

Chirurgische Tumorresektionen oder Tumorbiopsien liefern primäre Tumorgewebeproben. Im Idealfall sollten Tumorgewebeproben aus dem Zentrum der Tumormasse oder dem eindringenden Rand des Tumors sowie aus normal aussehendem Gewebe in der Nähe des Tumors stammen. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen benötigen Tumororganoide mehrere "Add-ons", darunter eine biologische Basalmembran (wie Matrigel, Hydrogel oder ein kollagenbasiertes Gerüst), die das extrazelluläre TME nachahmt, und ein flüssiges Wachstumsmedium, das spezifische Nährstoffe und Wachstumsfaktoren liefert und die Zellproliferation und Lebensfähigkeit in Kultur unterstützt¹⁶.

Die grundlegendsten Schritte in der primären Zellkultur sind das Waschen des Gewebes in Kochsalzlösung, um eine Kontamination zu verhindern, das mechanische Schneiden/Verdauen des Tumors in kleine Stücke von 1-3^mm3 und die Behandlung mit Kollagenase für die enzymatische Verdauung des Gewebes. Die verdaute Mischung wird dann filtriert, um große Gewebefragmente zu entfernen, in einer biologischen Basalmembran wie Matrigel resuspendiert und als Kuppeln in Kulturplatten mit geringer Anhaftung plattiert, um das Wachstum ohne Anhaftung zu fördern. Die Membran-Kuppeln der Basalmembran sind mit flüssigem Nährmedium bedeckt und mit Glutamin und Antibiotika ergänzt, um eine Kontamination zu vermeiden, sowie mit spezifischen Wachstumsfaktoren je nach Gewebetyp 7,8,9,16,17. Andere relevante Zellen, die innerhalb des Massentumors und der TME vorhanden sind, können ebenfalls isoliert werden, wie z. B. krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) und Immunzellen. Diese Technik, die kürzlich überprüft wurde¹⁸, ermöglicht die Etablierung von Kokulturen mit verschiedenen Zelltypen, um das Ansprechen auf die Therapie in einer "realistischeren" Tumorumgebung zu untersuchen. Darüber hinaus können Zell-Zell-Interaktionen und die Interaktion zwischen Tumorzellen und Komponenten der umgebenden biologischen Matrix untersucht werden.

Die berichtete Erfolgsrate der Etablierung von Tumororganoiden unter Verwendung von frischem Gewebe aus Biopsien oder reseziertem gastrointestinalem Tumorgewebe liegt bei etwa 50 %¹¹, wobei die Erfolgsrate bei letzterem weitgehend vom Gewebetyp und^{der Herkunft 4} abhängt, insbesondere vom Tumorgrad und der allgemeinen Tumorzellularität. Dreidimensionale Tumormodelle haben eine unterschiedliche Komplexität, von einfachen einzelligen Aggregaten bis hin zu hochkomplexen Modellen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen. Die Terminologie, die in der Literatur zur Beschreibung von 3D-Kulturen verwendet wird, ist höchst inkonsistent 19,20,21, da verschiedene Begriffe wie Sphäroide, Tumorsphären und Organoide verwendet werden^, obwohl der Unterschied zwischen ihnen unklar ist. Da ein eindeutiger Konsens über die Definition noch nicht erreicht wurde, wird in diesem Artikel ein Tumororganoid als eine organisierte Tumorzellkultur beschrieben, die in eine biologische Basalmembran eingebettet ist.

Hierin wird ein validiertes Protokoll für die Etablierung von Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben vorgestellt, die aus einem frischen primär resezierten oder PDX-abgeleiteten duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) stammen, und dieses Protokoll kann in den meisten Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultureinrichtungen durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde von mehreren hochmodernen Protokollen adaptiert, die derzeit verwendet werden, um Tumororganoide oder Tumoroide aus Verdauungstumorgewebe aus den Gruppen von David Tuveson⁹, Hans Clevers⁸ und Aurel Perren⁷ zu etablieren.

In diesem Protokoll wird nicht erläutert, wie das frische Gewebe geerntet wird. Um qualitativ hochwertiges frisches menschliches Tumorgewebe zu erhalten, ist es wichtig, eine effiziente Koordination zwischen den Chirurgen, die das Gewebe entnehmen, und der Pathologieabteilung, die die Gewebeprobe für die Organoidkultur entnimmt, zu haben. Auch bei der Verwendung von PDX als Frischgewebequelle ist eine effiziente Koordination mit der Person, die die Gewebeprobe entnimmt, wichtig. Es ist wichtig, die Gewebeprobe so schnell wie möglich zu erhalten (innerhalb von 30-60 Minuten nach der Entnahme), um eine hohe Qualität aufrechtzuerhalten.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für das Wohlergehen von Versuchstieren durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) und La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) genehmigt wurden, sowie in Übereinstimmung mit den Richtlinien für ethisches Verhalten bei der Pflege und Verwendung von Tieren, wie sie in den Internationalen Leitprinzipien für die biomedizinische Forschung mit Tieren festgelegt sind. vom Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) entwickelt. Das Protokoll folgte den ethischen Grundsätzen für biomedizinische Forschung mit schriftlicher Einverständniserklärung. Für die Verwendung von frischem Gewebe für die Etablierung der Tumororganoidkulturen wurde eine vorherige ethische Genehmigung eingeholt. Die Proben wurden vom BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Nationales Register der Biobanken B.0000678) zur Verfügung gestellt, in die Biobanken- und Biomodellplattform des ISCIII (PT20/00045) integriert und nach Standardarbeitsanweisungen mit der entsprechenden ethischen Genehmigung verarbeitet. Die Tumoren wurden, wie zuvor beschrieben²², subkutan in immungeschwächte 6 Wochen alte weibliche NU-Foxn1nu-Nacktmäuse implantiert (siehe Materialtabelle) und in vivo zur Etablierung von PDAC-PDXs durchgelassen.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Behandeln Sie menschliche Proben in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II.
2. Tragen Sie während des gesamten Eingriffs einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Brille, um eine Infektion mit durch Gewebe übertragenen Krankheitserregern zu vermeiden.
   HINWEIS: Es sind mindestens 3 Stunden erforderlich, um die frische Gewebeprobe zu verarbeiten und die Organoide und Fibroblasten zu plattieren.
3. Die frischen Gewebeproben²² werden innerhalb von maximal 24 Stunden nach der Entnahme verarbeitet und bis zur Verarbeitung bei 4 °C in Gewebekulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin) gelagert.
4. Bewahren Sie alle Proben und Reagenzien während des gesamten Verfahrens auf dem Eis auf und stellen Sie sicher, dass Sie eine gekühlte Zentrifuge auf 4 °C voreinstellen und mit niedriger Geschwindigkeit verwenden, um eine Beschädigung der Zellvorbereitung zu vermeiden.
5. Bewahren Sie die Pipettenspitzen P1.000 und P200 in einem Gefrierschrank bei −20 °C auf, um sie während des Protokolls zu verwenden.
6. Aliquotieren Sie die Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) vor der Verwendung. Für dieses Protokoll werden 250-ml-Aliquots empfohlen.

2. Aufbereitung von frischem Primärtumorgewebe zur Etablierung von Tumororganoiden und primären Fibroblasten

HINWEIS: Für die Verarbeitung der frischen Gewebeprobe (entweder primär humane resezierbare Tumoren oder PDXs) und die Platte der Tumororganoide und Fibroblasten sind mindestens 3 h erforderlich. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den Prozess der Organoidpräparation, vom Gewebeaufschluss bis zur Plattierung der Tumororganoide. Bevor Sie mit dem Protokoll beginnen, nehmen Sie ein Aliquot der Basalmembranmatrix aus dem −20 °C-Gefrierschrank und lassen Sie es vor der Verwendung ca. 30-60 Minuten auf Eis.

1. Legen Sie eine 6-Well-Kulturplatte 3 h vor dem Plattieren der Organoide in einen 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator.
2. Messen, fotografieren und waschen Sie das Gewebe (Schritt 1.3) mit 3 ml Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nährstoffmischung F-12 Schinken (F12), ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), 15 mM Hepes, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin, 125 ng/ml Amphotericin B, 0,1 mg/ml Normocin) (siehe Materialtabelle) und waschen Sie es dann mit 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Auf- und Abpipettieren.
3. Entfernen Sie das Medium durch Aspiration von der Gewebekulturplatte und schneiden Sie das Gewebe in einer sterilen Gewebekulturplatte mit zwei sterilen Klingen und 2 ml Verdauungsmedium (Advanced DMEM-F12 + 10 mg Kollagenase IV/ml, 0,000625% Trypsin-EDTA und 10 μg/ml DNase) in^{1 mm 3} Stücke. Das Gewebe wird in einem 50-ml-Röhrchen mit insgesamt 5 ml Aufschlussmedien entnommen und 1 Stunde lang bei 37 °C mit mechanischem Aufschluss mit handelsüblichen Geräten (siehe Materialtabelle) oder mit regelmäßigem Mischen der Probe durch Pipettieren der Probe auf und ab inkubiert.
4. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und filtern Sie die Probe durch ein 70-μm-Porensieb, um große Ablagerungen zu entfernen.
5. Geben Sie 2 ml DMEM mit 10 % FBS an die Oberseite des Filters und sammeln Sie die Ablagerungen und Gewebereste, um Kulturen von Fibroblasten zu etablieren (siehe Schritt 5).
6. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 200-300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand ab, so dass nur das Zellpellet übrig bleibt. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer (ACK, siehe Materialtabelle). Geben Sie die Mischung in ein 15-ml-Röhrchen und inkubieren Sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
   HINWEIS: Dieser Lyseschritt der roten Blutkörperchen kann entfernt werden, wenn es keine sichtbaren Anzeichen einer Kontamination gibt.
8. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand absaugen. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g.
9. Geben Sie 1 ml handelsübliches Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle), ergänzt mit DNase (1 μg/ml), zum Zellpellet und inkubieren Sie es 2-3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
10. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand absaugen. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet.
11. 30 Mal mit einer P1.000-Pipette auf und ab pipettieren, um die Zellen zu dissoziieren, 5 Minuten bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
12. Nehmen Sie P1.000- und P200-Pipettenspitzen aus dem −20 °C-Gefrierschrank und resuspendieren Sie das Zellpellet in der Membranmatrix mit einer P1.000-Pipette und kalten Spitzen (50 μl pro Tropfen, unter Berücksichtigung des Pelletvolumens, sechs bis sieben Kuppeln pro Well). Nehmen Sie die zuvor erhitzte Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie eine P200-Pipette auf 48 μl ein und verwenden Sie kalte Spitzen, um Kuppeln der Basalmembranmatrix in der vorgeheizten 6-Well-Platte zu erzeugen.
13. Legen Sie die Platte mit den Basalmembran-Matrix-Zelldomen für 15 min in den 37 °C 5% CO₂ -Inkubator, um die Basalmembranmatrix zu verfestigen.
14. Fügen Sie 2-2,5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu, ergänzt mit 20 ng/ml rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng/ml humanem Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinantem humanem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und 10,5 μM ROCK-Inhibitor (Advanced DMEM-F12 + Wachstumsfaktoren) (siehe Materialtabelle).

3. Überwachung der Organoide

1. Überwachen Sie die Tumor-Organoid-Kultur in den ersten 7 Tagen visuell und danach dreimal pro Woche.
2. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche mit Advanced DMEM-F12, das 20 ng/ml rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng/ml humanen Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und 10,5 μM ROCK-Inhibitor (Advanced DMEM-F12 + Wachstumsfaktoren) enthält.
3. Nehmen Sie regelmäßig Bilder der Tumor-Organoid-Kultur an Tag 1, Tag 3, Tag 7, Tag 10 und Tag 15 auf, nachdem Sie die Probe verarbeitet und die Kultur in der Matrix plattiert haben, um das Wachstum und die Lebensfähigkeit zu beobachten.

4. Passage und Kryolagerung der Organoide

1. Entfernen Sie das Nährmedium von der 6-Well-Platte.
2. Fügen Sie 1 ml eines geeigneten Zellrückgewinnungsreagenzes hinzu (siehe Materialtabelle), um die Basalmembranmatrix zu trennen und eine Zellsuspension zu erhalten, und gewinnen Sie den Überstand in einem 15-ml-Röhrchen. Wenn die Matrix nicht sofort dissoziiert, wird die Probe bei 4 °C für 15-20 Minuten inkubiert, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
3. Geben Sie 1 ml des gleichen Zellrückgewinnungsreagenzes, das in Schritt 4.2 verwendet wurde, in die Vertiefung der Platte, um zusätzliche dissoziierte Zellen zu gewinnen, und geben Sie den Überstand in dasselbe 15-ml-Röhrchen wie in Schritt 4.2.
4. 5 ml kaltes Advanced DMEM-F12 zugeben und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie die restliche Flüssigkeit mit einer 5-ml-Pipette entfernen. Vermeiden Sie es, den Schlauch so weit wie möglich zu bewegen. Resuspendieren Sie das Zellpellet im doppelten Volumen der Basalmembranmatrix, um eine Passage von 1:2 zu erhalten.
6. Für die Kryolagerung der Organoidkulturen wird das in Schritt 4.5 erhaltene Pellet in 1 ml Gefriermedium (10 % DMSO, 20 % FBS, 50 % DMEM-F12, 10,5 μM ROCK-Inhibitor) resuspendiert und bei −80 °C gelagert.
   HINWEIS: Das Volumen der Basalmembranmatrix kann so eingestellt werden, dass verschiedene Durchgänge durchgeführt werden, z. B. 1:1 (unter Verwendung des gleichen Volumens der Basalmembranmatrix wie beim Original) oder 1:3 (Hinzufügen des dreifachen Volumens der Basalmembranmatrix).

5. Etablierung von Fibroblasten

1. Nach der Rückgewinnung der Ablagerungen und Gewebereste in 2 ml DMEM mit 10 % FBS wird dies auf eine 6-Well-Platte gegeben und bei 37 °C mit 5 %_CO2 inkubiert.
2. Entfernen Sie die Gewebereste aus den Fibroblastenkulturen aus Schritt 2.5 durch die Aspiration des Mediums 2 Tage oder 3 Tage nach der Beschichtung und ersetzen Sie sie durch frisches DMEM mit 10% FBS.
3. Überwachen Sie die Fibroblastenkultur dreimal pro Woche visuell und wechseln Sie das Kulturmedium mindestens zweimal pro Woche mit DMEM, das mit 10% FBS ergänzt wird.

Ergebnisse

Es ist wichtig zu dokumentieren, wie sich die Tumororganoidkultur im Laufe der Zeit, insbesondere in den ersten Wochen, entwickelt, um abschätzen zu können, wie sich die Kultur in nachgeschalteten Assays verhalten wird. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die optimale Isolierung von Tumorzellen und die Etablierung von Tumororganoiden aus frischem Gewebe über einen Zeitraum von 15 Tagen. Manchmal befindet sich eine große Menge an Zelltrümmern in der Probe, und es ist schwierig, die sich ...

Diskussion

Große Fortschritte in der pharmakologischen Krebstherapie sind eine Herausforderung, da die Wahrscheinlichkeit der Zulassung von Medikamenten in klinischen Phase-I-onkologischen Studien bei 5,1 % liegt, was die niedrigste aller Krankheitsarten ist²³. Der Hauptgrund dafür ist, dass Krebs sehr heterogen ist und daher die Patientenkohorten nicht einheitlich wie erwartet auf die jeweilige Behandlung ansprechen, was unterstreicht, dass ein personalisierterer Ansatz erforderlich ist. Zweidimensionale ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054