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Resumo

Os organoides tumorais revolucionaram a pesquisa do câncer e a abordagem da medicina personalizada. Eles representam um modelo de tumor clinicamente relevante que permite aos pesquisadores ficar um passo à frente do tumor na clínica. Este protocolo estabelece organoides tumorais a partir de amostras de tecido tumoral pancreático fresco e xenoenxertos derivados do paciente de origem adenocarcinoma pancreático.

Resumo

Os organoides tumorais são modelos tumorais tridimensionais (3D) ex vivo que recapitulam as características-chave biológicas dos tecidos tumorais primários originais. Organoides tumorais derivados de pacientes têm sido usados em pesquisas translacionais sobre câncer e podem ser aplicados para avaliar a sensibilidade e resistência ao tratamento, interações célula-célula e interações de células tumorais com o microambiente tumoral. Os organoides tumorais são sistemas de cultura complexos que requerem técnicas avançadas de cultura celular e meios de cultura com coquetéis específicos de fatores de crescimento e uma membrana basal biológica que mimetiza o ambiente extracelular. A capacidade de estabelecer culturas de tumores primários depende muito do tecido de origem, da celularidade e das características clínicas do tumor, como o grau tumoral. Além disso, a coleta de amostras de tecido, a qualidade e quantidade do material, bem como o correto biobanco e armazenamento são elementos cruciais desse procedimento. As capacidades técnicas do laboratório também são fatores cruciais a serem considerados. Aqui, relatamos um POP/protocolo validado que é técnica e economicamente viável para a cultura de organoides tumorais ex vivo a partir de amostras de tecido fresco de origem adenocarcinoma pancreático, seja a partir de tecido doador primário ressecado a fresco ou xenoenxertos derivados do paciente (PDX). A técnica aqui descrita pode ser realizada em laboratórios com cultura básica de tecidos e instalações em camundongos e é adaptada para ampla aplicação no campo da oncologia translacional.

Introdução

Os organoides tumorais são culturas tridimensionais (3D) organizadas ex vivo que são derivadas do tecido tumoral fresco e fornecem modelos de câncer. Os organoides tumorais recapitulam as características biológicas fundamentais do tumor primário original1,2,3,4 e podem ser expandidos por até vários meses e criopreservados, semelhante às linhagens celulares imortalizadas convencionais. Os organoides tumorais fornecem um biobanco de modelos tumorais derivados do paciente para medicina translacional/personalizada5 e representam um importante avanço nos sistemas/modelos de biologia de células cancerosas. Organoides tumorais derivados do paciente podem ser usados como modelos ex vivo para predizer a eficácia de terapias oncológicas/farmacológicas (neo)adjuvantes, para as quais culturas são estabelecidas a partir de tecido tumoral fresco e ensaios de sensibilidade a drogas ou farmacotipagem são realizados em uma base específica do paciente para identificar agentes eficazes para linhas de terapiasubsequentes1,4. Além disso, os organoides tumorais superam a limitação da disponibilidade de tecido tumoral primário e, mais importante, fornecem um excelente sistema alternativo ou complementar aos modelos de camundongos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX)2. A complexidade dos organoides tumorais aumenta se as células tumorais primárias são combinadas com células estromais encontradas no microambiente tumoral (TME), como fibroblastos associados ao câncer (CAFs), células endoteliais e células imunes, que mimetizam o funcionamento e a complexa celularidade do tumor primário. Organoides tumorais têm sido estabelecidos para vários tipos de tumores utilizando protocolos padronizados6,7,8,9,10. A propagação organoide a partir de diferentes tumores sólidos, incluindo tecido colorretal e câncer de mama, é bem estabelecida e tecnicamente acessível 11,12,13,14,15.

Ressecções cirúrgicas de tumores ou biópsias tumorais fornecem espécimes de tecido tumoral primário. Idealmente, os espécimes de tecido tumoral devem vir do centro da massa tumoral ou da borda invasora do tumor, bem como do tecido de aparência normal adjacente ao tumor. Em comparação com culturas 2D convencionais, os organoides tumorais requerem vários "add-ons", incluindo uma membrana basal biológica (como Matrigel, hidrogel ou um arcabouço à base de colágeno), que imita a TME extracelular, e um meio de crescimento líquido que fornece nutrientes e fatores de crescimento específicos e suporta a proliferação e viabilidade celular em cultura16.

Os passos mais básicos na cultura de células primárias são lavar o tecido em solução salina para evitar contaminação, cortar/digerir mecanicamente o tumor em pequenos pedaços de 1-3 mm3 e tratamento com colagenase para a digestão enzimática do tecido. A mistura digerida é então filtrada para remover grandes fragmentos de tecido, ressuspensa em uma membrana basal biológica como Matrigel, e plaqueada como cúpulas em placas de cultura de baixa fixação para aumentar o crescimento não aderente. As cúpulas da matriz da membrana basal são cobertas com meio de cultura líquido e suplementadas com glutamina e antibióticos para evitar contaminação, bem como com fatores de crescimento específicos dependendo do tipo de tecido 7,8,9,16,17. Outras células relevantes presentes no tumor em massa e na EMT também podem ser isoladas, como fibroblastos associados ao câncer (CAFs) e células imunes. Essa técnica, recentementerevisada18, permite o estabelecimento de coculturas com diferentes tipos celulares para estudar a resposta à terapia em um ambiente tumoral mais "realista". Além disso, as interações célula-célula e a interação entre células tumorais e componentes da matriz biológica circundante podem ser estudadas.

A taxa de sucesso relatada do estabelecimento organoide tumoral usando tecido fresco de biópsias ou tecido tumoral gastrointestinal ressecado é de cerca de 50%11, e a taxa de sucesso deste último é amplamente dependente do tipo e origem dotecido4, particularmente do grau tumoral e da celularidade tumoral global. Modelos tumorais tridimensionais têm complexidade variável, desde agregados unicelulares simples até modelos de engenharia altamente complexos consistindo de vários tipos celulares. A terminologia utilizada para descrever culturas 3D na literatura é altamente inconsistente 19,20,21, pois diferentes termos como esferoides, tumoresferas e organoides são usados, embora a diferença entre eles não seja clara. Como um consenso claro sobre a definição ainda não foi alcançado, neste artigo, um organoide tumoral é descrito como uma cultura de células tumorais organizada embebida em uma membrana basal biológica.

Neste trabalho, um protocolo validado é relatado para o estabelecimento de organoides tumorais a partir de amostras de tecido fresco provenientes de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) primário ressecado ou derivado do PDX, e esse protocolo pode ser realizado na maioria dos laboratórios com instalações básicas de cultura de tecidos. Este protocolo foi adaptado de vários protocolos relatados no estado da arte que são atualmente usados para estabelecer organoides tumorais ou tumoróides a partir do tecido tumoral digestivo dos grupos de David Tuveson9, HansClevers8 e Aurel Perren7.

Este protocolo não discute como o tecido fresco é retirado. Para obter tecido tumoral humano fresco de alta qualidade, é importante ter uma coordenação eficiente entre os cirurgiões que coletam o tecido e o departamento de patologia que extrai a amostra de tecido para cultura de organoides. Da mesma forma, ao usar PDX como fonte de tecido fresco, a coordenação eficiente com a pessoa que coleta a amostra de tecido também é importante. É fundamental obter a amostra de tecido o mais rápido possível (dentro de 30-60 min a partir do momento da colheita), a fim de manter uma alta qualidade.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais para o bem-estar dos animais de experimentação aprovadas pelo Comitê de Ética da Universidade Autônoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) e La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) e de acordo com as diretrizes de Conduta Ética no Cuidado e Uso de Animais conforme estabelecido nos Princípios Orientadores Internacionais para Pesquisa Biomédica Envolvendo Animais, desenvolvido pelo Conselho das Organizações Internacionais de Ciências Médicas (CIOMS). O protocolo seguiu os princípios éticos para pesquisa biomédica com assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Obteve-se aprovação ética prévia para o uso de tecido fresco para o estabelecimento das culturas de organoides tumorais. As amostras foram fornecidas pelo BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Registro Nacional de Biobancos B.0000678), integrado à Plataforma de Biobancos e Biomodelos do ISCIII (PT20/00045), e processadas seguindo procedimentos operacionais padrão com a devida aprovação ética. Os tumores foram implantados por via subcutânea, como previamente descrito22, em camundongos fêmeas NU-Foxn1nu nuas imunocomprometidas com 6 semanas de idade (ver Tabela de Materiais) e passados in vivo para estabelecer PDXs PDAC.

1. Preparação experimental

  1. Manusear amostras humanas em um gabinete de biossegurança classe II.
  2. Use jaleco, luvas de proteção e óculos durante todo o procedimento para evitar a infecção por patógenos transmitidos por tecidos.
    NOTA: Um mínimo de 3 h é necessário para processar a amostra de tecido fresco e placa os organoides e fibroblastos.
  3. Processar as amostras de tecido fresco 22 no prazo máximo de24 h após a colheita e armazenar a 4 °C em meio de cultura de tecidos (DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%) até o processamento.
  4. Mantenha todas as amostras e reagentes no gelo durante todo o procedimento e certifique-se de pré-ajustar uma centrífuga refrigerada a 4 °C e usá-la em baixa velocidade para evitar danificar a preparação celular.
  5. Guarde as pontas das pipetas P1.000 e P200 em um freezer de −20 °C para usar durante o protocolo.
  6. Alíquota da matriz da membrana basal (ver Tabela de Materiais) antes do uso. Para esse protocolo, recomendam-se alíquotas de 250 mL.

2. Processamento de tecido tumoral primário fresco para estabelecer organoides tumorais e fibroblastos primários

NOTA: Um mínimo de 3 h é necessário para processar a amostra de tecido fresco (tumores humanos ressecáveis primários ou PDXs) e para plaquear os organoides tumorais e fibroblastos. Um esboço do processo de preparação dos organoides é mostrado na Figura 1, desde a digestão dos tecidos até o plaqueamento dos organoides tumorais. Antes de iniciar o protocolo, retire uma alíquota da matriz da membrana basal do freezer de -20 °C e deixe-a no gelo por aproximadamente 30-60 minutos antes do uso.

  1. Colocar uma placa de cultura de 6 poços em uma incubadora de cultura celular a 37 °C 3 h antes de plaquear os organoides.
  2. Medir, fotografar e lavar o tecido (passo 1.3) com 3 mL de DMEM-F12 Avançado (Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)/Mistura de Nutrientes F-12 Ham (F12), suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), 15 mM Hepes, 1% L-Glutamina, 1% Penicilina-Estreptomicina, 125 ng/mL Anfotericina B, 0,1 mg/mL Normocina) (ver Tabela de Materiais) pipetando para cima e para baixo e, em seguida, lavar com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pipetando para cima e para baixo.
  3. Retirar o meio por aspiração da placa de cultura de tecidos e cortar o tecido em pedaços de 1 mm3 em uma placa de cultura de tecido estéril usando duas lâminas estéreis e 2 mL de meio de digestão (DMEM-F12 avançado + 10 mg de colagenase IV/mL, 0,000625% de tripsina-EDTA e 10 μg/mL de DNase). Recolher o tecido num tubo de 50 ml com 5 ml de meio de digestão total e incubar durante 1 h a 37 °C com digestão mecânica com equipamento comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) ou com mistura periódica da amostra, pipetando a amostra para cima e para baixo.
  4. Adicionar 5 mL de DMEM-F12 avançado para inativar a tripsina e filtrar a amostra através de um filtro de poros de 70 μm para remover grandes detritos.
  5. Adicionar 2 mL de DMEM com FBS a 10% na parte superior do filtro e coletar os restos de detritos e tecidos para estabelecer culturas de fibroblastos (ver etapa 5).
  6. Centrifugar o filtrado a 200-300 x g por 5 min à temperatura ambiente, e aspirar o sobrenadante, deixando apenas o pellet celular. Adicionar 5 mL de DMEM-F12 avançado e centrifugar por 5 min a 300 x g.
  7. Ressuspender o pellet em 4 mL de tampão de lise de cloreto de amônio e potássio (ACK, ver Tabela de Materiais). Passar a mistura para um tubo de 15 ml e incubar à temperatura ambiente durante 2 minutos para lisar os glóbulos vermelhos.
    NOTA: Esta etapa de lise de glóbulos vermelhos pode ser removida quando não há evidência visível de contaminação.
  8. Centrifugar a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Adicionar 5 mL de DMEM-F12 avançado e centrifugar por 5 min a 300 x g.
  9. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação celular comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) suplementado com DNase (1 μg/ml) ao pellet celular e incubar durante 2-3 minutos à temperatura ambiente.
  10. Centrifugar a 300 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante. Adicionar 5 mL de DMEM-F12 avançado e ressuspender o pellet de células.
  11. Pipetar para cima e para baixo 30 vezes com uma pipeta P1.000 para dissociar as células, centrifugar por 5 min a 300 x g e remover o sobrenadante.
  12. Pegue as pontas das pipetas P1.000 e P200 do freezer de -20 °C e ressuspenda o pellet de células na matriz de membrana usando uma pipeta P1.000 e pontas frias (50 μL por gota, levando em conta o volume do pellet, seis a sete cúpulas por poço). Retire a placa previamente aquecida da incubadora. Ajuste uma pipeta P200 para 48 μL e use pontas frias para criar cúpulas da matriz da membrana basal na placa de 6 poços pré-aquecida.
  13. Coloque a placa com as cúpulas de células da matriz da membrana basal na incubadora de 37 °C 5% CO2 por 15 minutos para solidificar a matriz da membrana basal.
  14. Adicionar 2-2,5 mL de DMEM-F12 avançado, suplementado com 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/mL de fator de crescimento da placenta humana (PlGF), 10 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos humanos recombinante (bFGF), 769 ng/mL de fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e 10,5 μM de inibidor de ROCK (DMEM-F12 avançado + fatores de crescimento) (ver Tabela de Materiais).

3. Monitoramento dos organoides

  1. Monitorar visualmente a cultura organoide tumoral nos primeiros 7 dias e, posteriormente, três vezes por semana.
  2. Troque o meio duas vezes por semana com DMEM-F12 avançado contendo 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/mL de fator de crescimento da placenta humana (PlGF), 10 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos humanos recombinante (bFGF), 769 ng/mL de fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e 10,5 μM de inibidor de ROCK (DMEM-F12 avançado + fatores de crescimento).
  3. Capturar imagens da cultura organoide tumoral periodicamente nos dias 1, 3, 7, 10 e 15 dias após o processamento da amostra e plaqueamento da cultura na matriz para observar o crescimento e a viabilidade.

4. Passagem e crioarmazenamento dos organoides

  1. Retire o meio de cultura da placa de 6 poços.
  2. Adicionar 1 ml de um reagente de recuperação celular adequado (ver Tabela de Materiais) para dissociar a matriz da membrana basal e obter uma suspensão celular, e recuperar o sobrenadante num tubo de 15 ml. Se a matriz não se dissociar imediatamente, incubar a amostra a 4 °C durante 15-20 min até se dissolver completamente.
  3. Adicionar 1 ml do mesmo reagente de recuperação celular utilizado no passo 4.2 ao orifício da placa para recuperar células dissociadas adicionais e adicionar o sobrenadante ao mesmo tubo de 15 ml do passo 4.2.
  4. Adicionar 5 mL de DMEM-F12 frio e centrifugar a 200 x g por 5 min.
  5. Retire o sobrenadante e seque o pellet cuidadosamente, removendo qualquer líquido restante com uma pipeta de 5 mL; Evite ao máximo movimentar o tubo. Ressuspender o pellet celular em duas vezes o volume original da matriz da membrana basal para obter uma passagem de 1:2.
  6. Para o crioarmazenamento das culturas organoides, ressuspender o pellet obtido na etapa 4,5 em 1 mL de meio de congelamento (DMSO 10%, FBS 20%, DMEM-F12 50%, inibidor ROCK 10,5 μM) e armazenar a −80 °C.
    NOTA: O volume da matriz da membrana basal pode ser ajustado para realizar diferentes passagens, como 1:1 (usando o mesmo volume da matriz da membrana basal que o original) ou 1:3 (adicionando três vezes o volume original da matriz da membrana basal).

5. Estabelecimento de fibroblastos

  1. Após recuperar os detritos e restos teciduais em 2 mL de DMEM com SFB a 10%, adicioná-lo a uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C com CO2 a 5%.
  2. Remover os restos de tecido das culturas de fibroblastos da etapa 2.5 pela aspiração do meio 2 dias ou 3 dias após o plaqueamento, e substituir por DMEM fresco com SFB a 10%.
  3. Monitorar visualmente a cultura de fibroblastos três vezes por semana e trocar o meio de cultura pelo menos duas vezes por semana usando DMEM suplementado com SFB a 10%.

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Resultados

É importante documentar como a cultura organoide tumoral progride ao longo do tempo, particularmente nas primeiras semanas, a fim de estimar como a cultura se comportará nos ensaios a jusante. A Figura 2 mostra um exemplo de ótimo isolamento de células tumorais e estabelecimento de organoides tumorais a partir de tecido fresco durante um período de 15 dias. Às vezes, há um grande volume de restos celulares na amostra, e é difícil visualizar os organoides tumorais em desenvolvimento,...

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Discussão

Grandes avanços nas terapias farmacológicas do câncer são desafiadores, pois a probabilidade de aprovação de fármacos em ensaios clínicos oncológicos de fase I é de 5,1%, sendo a menor de todos os tipos dedoenças23. A principal razão é que o câncer é muito heterogêneo e, portanto, as coortes de pacientes não respondem uniformemente como esperado ao tratamento dado, o que destaca que uma abordagem mais personalizada é necessária. Culturas bidimensionais (2D) têm sido usadas em p...

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Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo financiamento da Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Programa de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção n.º 857381, projeto VISION (Estratégias para reforçar a excelência científica e a capacidade de inovação para o diagnóstico precoce de cancros gastrointestinais), Chamada intramuros para novos projetos de pesquisa para pesquisadores clínicos e grupos de pesquisa emergentes IRYCIS (2021/0446), Projeto Organoides Derivados do Paciente 2.0 (CIBERONC) e o projeto TRANSCAN II JTC 2017 chamada "Estabelecendo um algoritmo para o diagnóstico precoce e acompanhamento de pacientes com tumores neuroendócrinos pancreáticos (NExT)", número de concessão 1.1.1.5/ERANET/20/03. As amostras biológicas utilizadas neste protocolo foram cedidas pelo BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) e integradas à Plataforma de Biobancos e Biomodelos do ISCIII (PT20/00045). Também gostaríamos de agradecer a Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita e Thorsten Knoll por seu inestimável apoio para desenvolver este protocolo como parte dos projetos NExT e VISION.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well Costar Ultra-low Attachment platesBiofilTCP011006
70 μm pore strainerVWR732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis BufferGibcoA10492-01
Amphotericin BGibco15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)NuaireNU-4750E
Cell recovery solutionCorning 354253
Collagenase IVGibco17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPESGibco31330-038
DNaseRoche10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-079-CV
Freezing container, NalgeneMerckC1562
gentleMACS Octo DissociatorMilteny Biotec130-096-427
HEPESGibco15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)enQuireBioQP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude miceJanvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)InvitrogenRP10931
L-GlutamineCorning354235
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning356234
NormocinInvivoGenant-nr-2
Pasteur pipettesDeltalab200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)Corning30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)GibcoPHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)GibcoPHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL72304
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501
Surgical BladesNahitaFMB018
TrypsinGibco25300054

Referências

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