Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco

Resumo

Os organoides tumorais revolucionaram a pesquisa do câncer e a abordagem da medicina personalizada. Eles representam um modelo de tumor clinicamente relevante que permite aos pesquisadores ficar um passo à frente do tumor na clínica. Este protocolo estabelece organoides tumorais a partir de amostras de tecido tumoral pancreático fresco e xenoenxertos derivados do paciente de origem adenocarcinoma pancreático.

Resumo

Os organoides tumorais são modelos tumorais tridimensionais (3D) ex vivo que recapitulam as características-chave biológicas dos tecidos tumorais primários originais. Organoides tumorais derivados de pacientes têm sido usados em pesquisas translacionais sobre câncer e podem ser aplicados para avaliar a sensibilidade e resistência ao tratamento, interações célula-célula e interações de células tumorais com o microambiente tumoral. Os organoides tumorais são sistemas de cultura complexos que requerem técnicas avançadas de cultura celular e meios de cultura com coquetéis específicos de fatores de crescimento e uma membrana basal biológica que mimetiza o ambiente extracelular. A capacidade de estabelecer culturas de tumores primários depende muito do tecido de origem, da celularidade e das características clínicas do tumor, como o grau tumoral. Além disso, a coleta de amostras de tecido, a qualidade e quantidade do material, bem como o correto biobanco e armazenamento são elementos cruciais desse procedimento. As capacidades técnicas do laboratório também são fatores cruciais a serem considerados. Aqui, relatamos um POP/protocolo validado que é técnica e economicamente viável para a cultura de organoides tumorais ex vivo a partir de amostras de tecido fresco de origem adenocarcinoma pancreático, seja a partir de tecido doador primário ressecado a fresco ou xenoenxertos derivados do paciente (PDX). A técnica aqui descrita pode ser realizada em laboratórios com cultura básica de tecidos e instalações em camundongos e é adaptada para ampla aplicação no campo da oncologia translacional.

Introdução

Os organoides tumorais são culturas tridimensionais (3D) organizadas ex vivo que são derivadas do tecido tumoral fresco e fornecem modelos de câncer. Os organoides tumorais recapitulam as características biológicas fundamentais do tumor primário original1,2,3,4 e podem ser expandidos por até vários meses e criopreservados^, semelhante às linhagens celulares imortalizadas convencionais. Os organoides tumorais fornecem um biobanco de modelos tumorais derivados do paciente para medicina translacional/^{personalizada5}

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais para o bem-estar dos animais de experimentação aprovadas pelo Comitê de Ética da Universidade Autônoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) e La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) e de acordo com as diretrizes de Conduta Ética no Cuidado e Uso de Animais conforme estabelecido nos Princípios Orientadores Internacionais para Pesquisa Biomédica Envolvendo Animais, desenvolvido pelo Conselho das Organizações Internacionais de Ciências Médicas (CIOMS). O protocolo seguiu os princípios éticos para pesquisa biomédica com assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Obteve-se aprov....

Discussão

Grandes avanços nas terapias farmacológicas do câncer são desafiadores, pois a probabilidade de aprovação de fármacos em ensaios clínicos oncológicos de fase I é de 5,1%, sendo a menor de todos os tipos de^doenças23. A principal razão é que o câncer é muito heterogêneo e, portanto, as coortes de pacientes não respondem uniformemente como esperado ao tratamento dado, o que destaca que uma abordagem mais personalizada é necessária. Culturas bidimensionais (2D) têm sido usadas em p.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054