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要約

腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。

要約

腫瘍オルガノイドは、元の原発腫瘍組織の生物学的重要な特徴を再現する3次元(3D) ex vivo 腫瘍モデルです。患者由来の腫瘍オルガノイドは、トランスレーショナルがん研究で使用されており、治療の感受性と抵抗性、細胞間相互作用、および腫瘍微小環境との腫瘍細胞相互作用の評価に適用できます。腫瘍オルガノイドは複雑な培養系であり、高度な細胞培養技術と、特定の成長因子カクテルを用いた培地、および細胞外環境を模倣した生物学的基底膜が必要です。原発腫瘍培養を確立する能力は、起源組織、細胞性、および腫瘍の悪性度などの腫瘍の臨床的特徴に大きく依存します。さらに、組織サンプルの収集、材料の質と量、および正しいバイオバンクと保管は、この手順の重要な要素です。また、研究所の技術力も重要な要素です。ここでは、膵臓腺癌由来の新鮮な組織サンプルからの ex vivo 腫瘍オルガノイドの培養に技術的および経済的に実行可能な検証済みのSOP/プロトコルを報告します。本明細書に記載の技術は、基本的な組織培養およびマウス設備を有する実験室で実施することができ、トランスレーショナル腫瘍学分野における幅広い応用のために調整される。

概要

腫瘍オルガノイドは、新鮮な腫瘍組織に由来するex vivoの3次元(3D)組織化培養物であり、がんモデルを提供します。腫瘍オルガノイドは、元の原発腫瘍の生物学的重要な特徴を再現しており1,2,3,4、従来の不死化細胞株と同様に、最大数ヶ月間増殖して凍結保存することができます。腫瘍オルガノイドは、トランスレーショナル/個別化医療5のための患者由来腫瘍モデルのバイオバンクを提供し、がん細胞生物学システム/モデルにおける重要な進歩を表しています。患者由来の腫瘍オルガノイドは、新鮮な腫瘍組織から培養を確立し、その後の治療ラインに有効な薬剤を特定するために患者固有のベースで薬物感受性アッセイまたは薬物型決定が実施される(ネオ)アジュバント腫瘍学的/薬理学的治療の有効性を予測するためのex vivoモデルとして使用できます1,4.さらに、腫瘍オルガノイドは、原発腫瘍組織の利用可能性の限界を克服し、さらに重要なことに、患者由来異種移植片(PDX)などのin vivoマウスモデルに対する優れた代替または補完的なシステムを提供します2。原発腫瘍細胞が、がん関連線維芽細胞(CAF)、内皮細胞、免疫細胞など、腫瘍微小環境(TME)に見られる間質細胞と組み合わされ、原発腫瘍の機能と複雑な細胞性を模倣すると、腫瘍オルガノイドの複雑さが増します。腫瘍オルガノイドは、標準化されたプロトコル6、7、8、9、10を使用して、多くの腫瘍タイプに対して確立されています。結腸直腸癌や乳がん組織を含むさまざまな固形腫瘍からのオルガノイド増殖は十分に確立されており、技術的に手頃な価格です11、12、13、14、15。

外科的腫瘍切除または腫瘍生検は、原発腫瘍組織標本を提供する。理想的には、腫瘍組織標本は、腫瘍塊の中心または腫瘍の浸潤縁、および腫瘍に隣接する正常に見える組織から採取する必要があります。従来の2D培養と比較して、腫瘍オルガノイドは、細胞外TMEを模倣する生物学的基底膜(マトリゲル、ハイドロゲル、コラーゲンベースの足場など)や、特定の栄養素と成長因子を供給し、培養における細胞増殖と生存率をサポートする液体増殖培地など、いくつかの「アドオン」を必要とします16。

初代細胞培養の最も基本的なステップは、汚染を防ぐために生理食塩水で組織を洗浄し、腫瘍を機械的に1〜3mm3の小片に切断/消化し、組織の酵素消化のためにコラゲナーゼで処理することです。次に、消化された混合物をろ過して大きな組織断片を除去し、マトリゲルなどの生物学的基底膜に再懸濁し、非接着性増殖を促進するために低接着性培養プレートにドーム状に播種します。基底膜マトリックスドームは液体培養培地で覆われ、グルタミンと抗生物質が添加され、組織タイプに応じて特定の成長因子が添加されます7,8,9,16,17。がん関連線維芽細胞(CAF)や免疫細胞など、バルク腫瘍およびTME内に存在する他の関連細胞も単離され得る。最近見直されたこの技術18は、より「現実的な」腫瘍環境で治療に対する反応を研究するために、異なる細胞タイプとの共培養を確立することを可能にします。さらに、細胞間相互作用や、腫瘍細胞と周囲の生物学的マトリックスの成分との相互作用を研究することができます。

生検または切除された消化管腫瘍組織からの新鮮組織を使用した腫瘍オルガノイド確立の成功率は約50%であり11、後者からの成功率は、組織の種類と起源4、特に腫瘍の悪性度と全体的な腫瘍細胞性に大きく依存します。3次元腫瘍モデルには、単純な単細胞凝集体から、さまざまな細胞タイプで構成される非常に複雑な工学的モデルまで、さまざまな複雑さがあります。文献で3D培養を説明するために使用される用語は、スフェロイド、腫瘍球、オルガノイドなどの異なる用語が使用されているため、非常に一貫性がありません19,20,21が、それらの違いは不明です。定義に関する明確なコンセンサスはまだ得られていないため、この記事では、腫瘍オルガノイドを生物学的基底膜に埋め込まれた組織化された腫瘍細胞培養として説明しています。

本明細書では、新鮮な原発切除またはPDX由来の膵管腺癌(PDAC)に由来する新鮮な組織サンプルからの腫瘍オルガノイドの確立について検証済みのプロトコルが報告されており、このプロトコルは基本的な組織培養施設を備えたほとんどの実験室で実施できます。このプロトコルは、David Tuveson9、Hans Clevers8、および Aurel Perren7 のグループからの消化器系腫瘍組織から腫瘍オルガノイドまたは腫瘍型を確立するために現在使用されているいくつかの最先端の報告されたプロトコルから適応されています。

このプロトコルでは、新鮮な組織がどのように収穫されるかについては説明しません。高品質の新鮮なヒト腫瘍組織を得るためには、組織を採取する外科医と、オルガノイド培養のために組織サンプルを抽出する病理学部門との間の効率的な調整が重要です。同様に、PDXを新鮮な組織源として使用する場合、組織サンプルを採取する人との効率的な調整も重要です。高品質を維持するためには、組織サンプルをできるだけ早く(採取時間から30〜60分以内に)入手することが重要です。

プロトコル

すべての手順は、マドリッド自治大学倫理委員会(CEI 103-1958-A337)およびマドリッド市議会(PROEX 294/19)によって承認された実験動物の福祉に関する制度的ガイドラインに準拠し、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に記載されている動物の世話と使用における倫理的行動に関するガイドラインに従って実施されました。 国際医学機関評議会(CIOMS)によって開発されました。プロトコルは、書面によるインフォームドコンセントによる生物医学研究の倫理原則に従った。腫瘍オルガノイド培養の確立のための新鮮組織の使用については、事前の倫理的承認が得られました。サンプルは、BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS(National Registry of Biobanks B.0000678)から提供され、ISCIII(PT20/00045)のバイオバンクおよびバイオモデルプラットフォームに統合され、適切な倫理的承認を得て、標準操作手順に従って処理されました。腫瘍は、前述のように22、免疫不全の6週齢の雌のNU-Foxn1nuヌードマウス( 資料表参照)に皮下移植され、 in vivo で継代されてPDAC PDXが確立されました。

1. 実験準備

  1. クラスIIのバイオセーフティキャビネットでヒトサンプルを取り扱います。
  2. 組織媒介性病原体による感染を避けるために、処置中は白衣、保護手袋、眼鏡を着用してください。
    注:新鮮な組織サンプルを処理し、オルガノイドと線維芽細胞をプレーティングするには、最低3時間が必要です。
  3. 採取から最大24時間以内に新鮮な組織サンプル22 を処理し、処理するまで組織培養培地(10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM)中で4°Cで保存します。
  4. 手順全体を通してすべてのサンプルと試薬を氷上に保管し、細胞調製の損傷を防ぐために、冷蔵遠心分離機を4°Cにプリセットし、低速で使用してください。
  5. P1,000およびP200ピペットチップは-20°Cの冷凍庫に保管し、プロトコル中に使用してください。
  6. 使用前に基底膜マトリックス( 材料表を参照)を分注してください。このプロトコルでは、250 mLのアリコートが推奨されます。

2.腫瘍オルガノイドと原発性線維芽細胞を確立するための新鮮な原発腫瘍組織の処理

注:新鮮な組織サンプル(原発性ヒト切除可能腫瘍またはPDX)を処理し、腫瘍オルガノイドと線維芽細胞をプレーティングするには、最低3時間が必要です。オルガノイド調製プロセスの概要を 図1に示します(組織消化から腫瘍オルガノイドのプレーティングまで)。プロトコルを開始する前に、-20°Cの冷凍庫から基底膜マトリックスのアリコートを取り出し、使用前に約30〜60分間氷上に置いておきます。

  1. オルガノイドをプレーティングする3時間前に、6ウェル培養プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに入れます。
  2. 3 mLのAdvanced DMEM-F12(ダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)/栄養混合物F-12ハム(F12))で組織を測定、写真撮影、洗浄(ステップ1.3)、5%ウシ胎児血清(FBS)、15 mM Hepes、1%L-グルタミン、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、125 ng/mLアムホテリシンB、0.1 mg/mLノルモシン)(材料表を参照)でピペッティングして上下にピペッティングし、3 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でピペッティングして洗浄します。
  3. 2枚の滅菌ブレードと2 mLの消化培地(Advanced DMEM-F12 + 10 mgコラゲナーゼIV/mL、0.000625%トリプシン-EDTA、および10 μg/mL DNase)を使用して、組織を滅菌組織培養プレートで1 mm3に切断します。合計5 mLの消化培地を含む50 mLチューブに組織を採取し、市販の機器( 材料表を参照)による機械的消化、またはサンプルをピペッティングしてサンプルを上下にピペッティングして、37°Cで1時間インキュベートします。
  4. 5 mL の Advanced DMEM-F12 を添加してトリプシンを不活化し、70 μm のポアストレーナーでサンプルをろ過して大きな破片を取り除きます。
  5. 2 mLのDMEMと10%FBSをフィルターの上部に加え、破片と組織残骸を回収して線維芽細胞の培養を確立します(ステップ5を参照)。
  6. 濾液を室温で200〜300× g で5分間遠心分離し、細胞ペレットのみを残して上清を吸引する。5 mL の Advanced DMEM-F12 を加え、300 x g で 5 分間遠心分離します。
  7. ペレットを4 mLの塩化アンモニウムカリウム(ACK、 材料表を参照)溶解緩衝液に再懸濁します。混合物を15 mLチューブに通し、室温で2分間インキュベートして赤血球を溶解します。
    注:この赤血球溶解ステップは、汚染の目に見える証拠がない場合に除去できます。
  8. 室温で300× g で5分間遠心分離し、上清を吸引する。5 mL の Advanced DMEM-F12 を加え、300 x g で 5 分間遠心分離します。
  9. DNase(1 μg/mL)を添加した市販の細胞解離試薬( 材料表参照)1 mLを細胞ペレットに加え、室温で2〜3分間インキュベートします。
  10. 300 x g で 5 分間遠心分離し、上清を吸引します。5 mL の Advanced DMEM-F12 を加え、細胞ペレットを再懸濁します。
  11. P1,000ピペットで30回上下にピペットして細胞を解離し、300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。
  12. -20°Cの冷凍庫からP1,000およびP200ピペットチップを取り出し、P1,000ピペットとコールドチップ(ペレット容量を考慮して1滴あたり50 μL、ウェルあたり6〜7ドーム)を使用して細胞ペレットをメンブレンマトリックスに再懸濁します。以前に加熱したプレートをインキュベーターから取り出します。P200 ピペットを 48 μL にセットし、コールドチップを使用して、予熱した 6 ウェルプレートに基底メンブレンマトリックスのドームを作成します。
  13. 基底膜マトリックスセルドームの入ったプレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに15分間入れて、基底膜マトリックスを固化させます。
  14. 2〜2.5 mLのAdvanced DMEM-F12を添加し、20 ng / mLの組換えヒト上皮成長因子(EGF)、100 ng / mLのヒト胎盤成長因子(PlGF)、10 ng / mL組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、769 ng / mLのインスリン様成長因子-1(IGF-1)、および10.5 μMのROCK阻害剤(Advanced DMEM-F12 +成長因子)を添加します( 材料表を参照)。

3. オルガノイドのモニタリング

  1. 腫瘍オルガノイド培養を最初の7日間は目視で監視し、その後は週に3回監視します。
  2. 20 ng/mL 組換えヒト上皮成長因子(EGF)、100 ng/mL ヒト胎盤増殖因子(PlGF)、10 ng/mL 組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、769 ng/mL インスリン様成長因子-1(IGF-1)、10.5 μM ROCK 阻害剤(Advanced DMEM-F12 + 成長因子)を含む Advanced DMEM-F12 で培地を週に 2 回交換します。
  3. サンプルを処理し、培養物をマトリックスにプレーティングした後、1日目、3日目、7日目、10日目、および15日目に定期的に腫瘍オルガノイド培養の画像を撮影し、増殖と生存率を観察します。

4. オルガノイドの継代と凍結保存

  1. 6ウェルプレートから培地を取り出します。
  2. 適切な細胞回収試薬( 材料表を参照)を1 mL添加して基底膜マトリックスの解離と細胞懸濁液の取得を行い、15 mLチューブで上清を回収します。マトリックスがすぐに解離しない場合は、サンプルを完全に溶解するまで4°Cで15〜20分間インキュベートします。
  3. ステップ4.2で使用したのと同じ細胞回収試薬1 mLをプレートのウェルに添加して、追加の解離細胞を回収し、ステップ4.2と同じ15 mLチューブに上清を加えます。
  4. 5 mLのコールドアドバンストDMEM-F12を加え、200 x g で5分間遠心分離します。
  5. 上清を取り除き、5 mLのピペットで残りの液体を取り除き、ペレットを慎重に乾燥させます。チューブはできるだけ動かさないでください。細胞ペレットを基底膜マトリックスの元の容量の2倍に再懸濁し、1:2の継代を得ます。
  6. オルガノイド培養物の凍結保存には、ステップ4.5で得られたペレットを1mLの凍結培地(10%DMSO、20%FBS、50%DMEM-F12、10.5μM ROCK阻害剤)に再懸濁し、−80°Cで保存します。
    注:基底膜マトリックスの体積は、1:1(元の基底膜マトリックスと同じ容量を使用)や1:3(基底膜マトリックスの元の体積の3倍を追加する)など、さまざまな継代を実行するように調整できます。

5.線維芽細胞の確立

  1. 10% FBS を含む 2 mL の DMEM で破片と組織残骸を回収した後、これを 6 ウェルプレートに添加し、5% CO2 で 37 °C でインキュベートします。
  2. プレーティングの2日後または3日後に培地の吸引により、ステップ2.5の線維芽細胞培養物から組織残骸を除去し、10%FBSを含む新鮮なDMEMと交換します。
  3. 線維芽細胞培養を週に3回目視でモニタリングし、10%FBSを添加したDMEMを使用して培養培地を週に2回以上交換します。

結果

腫瘍オルガノイド培養が時間の経過とともに、特に最初の数週間でどのように進行するかを記録し、培養物が下流のアッセイでどのように振る舞うかを推定することが重要です。図2は、15日間にわたる新鮮な組織からの最適な腫瘍細胞の単離と腫瘍オルガノイドの確立の例を示しています。サンプル中に大量の細胞破片があり、図3に示すように、...

ディスカッション

がん第I相臨床試験で薬剤が承認される可能性は5.1%であり、全疾患タイプ23の中で最も低いため、薬物療法の大きな進歩は困難である。主な理由は、がんは非常に不均一であるため、患者コホートは特定の治療に対して期待どおりに均一に反応せず、より個別化されたアプローチが必要であることを浮き彫りにしています。2次元(2D)培養は、トランスレーショナルがん研究で?...

開示事項

何一つ。

謝辞

この研究は、助成金契約第857381号に基づく欧州連合のHorizon 2020 Research and Innovation Programme(消化器がんの早期診断のための科学的卓越性とイノベーション能力を強化するための戦略)であるPlataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud(PT20/00045)からの資金提供によって支援されました。 臨床研究者および新興研究グループIRYCIS(2021/0446)、患者由来オルガノイド2.0プロジェクト(CIBERONC)、およびTRANSCAN IIプロジェクトJTC 2017の募集「膵神経内分泌腫瘍(NExT)患者の早期診断とフォローアップのためのアルゴリズムの確立」、助成金番号1.1.1.5 / ERANET / 20/03。このプロトコルで使用された生物学的サンプルは、BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS(B.0000678)から提供され、ISCIII(PT20/00045)のバイオバンクおよびバイオモデルプラットフォームに統合されました。また、Yvonne Kohl氏、Agapi Kataki Vita Rovita氏、Thorsten Knoll氏には、NExTおよびVISIONプロジェクトの一環としてこのプロトコルを開発するための貴重なサポートをいただいたことに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well Costar Ultra-low Attachment platesBiofilTCP011006
70 μm pore strainerVWR732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis BufferGibcoA10492-01
Amphotericin BGibco15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)NuaireNU-4750E
Cell recovery solutionCorning 354253
Collagenase IVGibco17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPESGibco31330-038
DNaseRoche10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-079-CV
Freezing container, NalgeneMerckC1562
gentleMACS Octo DissociatorMilteny Biotec130-096-427
HEPESGibco15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)enQuireBioQP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude miceJanvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)InvitrogenRP10931
L-GlutamineCorning354235
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning356234
NormocinInvivoGenant-nr-2
Pasteur pipettesDeltalab200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)Corning30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)GibcoPHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)GibcoPHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL72304
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501
Surgical BladesNahitaFMB018
TrypsinGibco25300054

参考文献

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