JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Tümör organoidleri, kanser araştırmalarında ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımında devrim yarattı. Araştırmacıların klinikte tümörden bir adım önde olmalarını sağlayan klinik olarak ilgili bir tümör modelini temsil ederler. Bu protokol, taze pankreas tümör dokusu örneklerinden ve pankreas adenokarsinomu kökenli hasta kaynaklı ksenogreftlerden tümör organoidlerini oluşturur.

Özet

Tümör organoidleri, orijinal primer tümör dokularının biyolojik temel özelliklerini özetleyen üç boyutlu (3D) ex vivo tümör modelleridir. Hasta kaynaklı tümör organoidleri, translasyonel kanser araştırmalarında kullanılmıştır ve tedavi duyarlılığını ve direncini, hücre-hücre etkileşimlerini ve tümör mikroçevresi ile tümör hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir. Tümör organoidleri, gelişmiş hücre kültürü teknikleri ve spesifik büyüme faktörü kokteylleri ve hücre dışı ortamı taklit eden biyolojik bir bazal membran içeren kültür ortamı gerektiren karmaşık kültür sistemleridir. Primer tümör kültürlerini oluşturma yeteneği büyük ölçüde orijin dokusuna, hücreselliğe ve tümörün tümör derecesi gibi klinik özelliklerine bağlıdır. Ayrıca, doku örneği toplama, malzeme kalitesi ve miktarının yanı sıra doğru biyobankacılık ve depolama bu prosedürün çok önemli unsurlarıdır. Laboratuvarın teknik özellikleri de dikkate alınması gereken çok önemli faktörlerdir. Burada, pankreas adenokarsinomu orijinli taze doku örneklerinden, taze primer rezeke edilmiş hasta donör dokusundan veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden (PDX) ex vivo tümör organoidlerinin kültürü için teknik ve ekonomik olarak uygulanabilir olan doğrulanmış bir SOP/protokol sunuyoruz. Burada açıklanan teknik, temel doku kültürü ve fare olanaklarına sahip laboratuvarlarda gerçekleştirilebilir ve translasyonel onkoloji alanında geniş uygulama için uyarlanmıştır.

Giriş

Tümör organoidleri, taze tümör dokusundan türetilen ve kanser modelleri sağlayan ex vivo üç boyutlu (3D) organize kültürlerdir. Tümör organoidleri, orijinal primer tümörün 1,2,3,4 biyolojik temel özelliklerini özetler ve geleneksel ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına benzer şekilde birkaç aya kadar genişletilebilir ve dondurularak saklanabilir. Tümör organoidleri, translasyonel/kişiselleştirilmiş tıp5 için hasta kaynaklı tümör modellerinin bir biyobankasını sağlar ve kanser hücresi biyolojisi sistemlerinde/modellerinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder. Hasta kaynaklı tümör organoidleri, kültürlerin taze tümör dokusundan oluşturulduğu ve ilaç duyarlılık testlerinin veya farmakotiplemenin sonraki tedavi hatları için etkili ajanları belirlemek için hastaya özgü bazda gerçekleştirildiği (neo)adjuvan onkolojik/farmakolojik tedavilerin etkinliğini tahmin etmek için ex vivo modeller olarak kullanılabilir 1,4. Ayrıca, tümör organoidleri, primer tümör dokusunun mevcudiyeti sınırlamasının üstesinden gelir ve daha da önemlisi, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo fare modellerine mükemmel bir alternatif veya tamamlayıcı sistem sağlar2. Primer tümör hücreleri, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), endotel hücreleri ve primer tümörün işleyişini ve karmaşık hücreselliğini taklit eden bağışıklık hücreleri gibi tümör mikroçevresinde (TME) bulunan stromal hücrelerle birleştirilirse, tümör organoidlerinin karmaşıklığı artar. Tümör organoidleri, standartprotokoller 6,7,8,9,10 kullanılarak birçok tümör tipi için oluşturulmuştur. Kolorektal ve meme kanseri dokusu dahil olmak üzere farklı katı tümörlerden organoid yayılımı, köklü ve teknik olarak uygun maliyetlidir 11,12,13,14,15.

Cerrahi tümör rezeksiyonları veya tümör biyopsileri, primer tümör dokusu örnekleri sağlar. İdeal olarak, tümör dokusu örnekleri, tümör kitlesinin merkezinden veya tümörün istilacı kenarından ve ayrıca tümöre bitişik normal görünümlü dokudan gelmelidir. Geleneksel 2D kültürlerle karşılaştırıldığında, tümör organoidleri, hücre dışı TME'yi taklit eden biyolojik bir bazal membran (Matrigel, hidrojel veya kollajen bazlı bir iskele gibi) ve spesifik besinler ve büyüme faktörleri sağlayan ve kültürde hücre proliferasyonunu ve canlılığını destekleyen bir sıvı büyüme ortamı dahil olmak üzere birkaç "eklenti" gerektirir16.

Primer hücre kültüründe en temel adımlar, kontaminasyonu önlemek için dokunun salin solüsyonunda yıkanması, tümörün mekanik olarak 1-3mm3'lük küçük parçalara kesilmesi/sindirilmesi ve dokunun enzimatik sindirimi için kollajenaz ile muamele edilmesidir. Sindirilmiş karışım daha sonra büyük doku parçalarını çıkarmak için süzülür, Matrigel gibi biyolojik bir bazal membranda yeniden süspanse edilir ve bağlanmayan büyümeyi arttırmak için düşük bağlı kültür plakalarında kubbeler olarak kaplanır. Bazal membran matris kubbeleri, sıvı kültür ortamı ile kaplanır ve kontaminasyonu önlemek için glutamin ve antibiyotiklerin yanı sıradoku tipine bağlı olarak spesifik büyüme faktörleri ile desteklenir 7,8,9,16,17. Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler) ve bağışıklık hücreleri gibi toplu tümör ve TME içinde bulunan diğer ilgili hücreler de izole edilebilir. Yakın zamanda gözden geçirilen bu teknik,18, daha "gerçekçi" bir tümör ortamında tedaviye yanıtı incelemek için farklı hücre tiplerine sahip ko-kültürlerin kurulmasına izin verir. Ayrıca, hücre-hücre etkileşimleri ve tümör hücreleri ile çevredeki biyolojik matrisin bileşenleri arasındaki etkileşim incelenebilir.

Biyopsilerden veya rezeke edilen gastrointestinal tümör dokusundan alınan taze doku kullanılarak tümör organoid oluşumunun bildirilen başarı oranı %50 civarındadır11 ve ikincisinden elde edilen başarı oranı büyük ölçüde doku tipine ve orijine4, özellikle tümör derecesine ve genel tümör hücreselliğine bağlıdır. Üç boyutlu tümör modelleri, basit tek hücreli agregalardan çeşitli hücre tiplerinden oluşan oldukça karmaşık mühendislik modellerine kadar değişen karmaşıklıklara sahiptir. Literatürde 3D kültürleri tanımlamak için kullanılan terminoloji oldukça tutarsızdır 19,20,21, çünkü aralarındaki fark belirsiz olsa da, sferoidler, tümör küreleri ve organoidler gibi farklı terimler kullanılmaktadır. Tanım üzerinde henüz net bir fikir birliğine varılamadığından, bu makalede bir tümör organoidi, biyolojik bir bazal membrana gömülü organize bir tümör hücre kültürü olarak tanımlanmaktadır.

Burada, taze primer rezeke edilmiş veya PDX kaynaklı pankreatik duktal adenokarsinomdan (PDAC) kaynaklanan taze doku örneklerinden tümör organoidlerinin oluşturulması için onaylanmış bir protokol bildirilmiştir ve bu protokol temel doku kültürü olanaklarına sahip çoğu laboratuvarda uygulanabilir. Bu protokol, şu anda David Tuveson9, Hans Clevers8 ve Aurel Perren7 gruplarından sindirim tümörü dokusundan tümör organoidleri veya tümöroidleri oluşturmak için kullanılan son teknoloji rapor edilmiş birkaç protokolden uyarlanmıştır.

Bu protokol, taze dokunun nasıl toplandığını tartışmaz. Yüksek kaliteli taze insan tümör dokusu elde etmek için, dokuyu toplayan cerrahlar ile organoid kültür için doku örneğini çıkaran patoloji departmanı arasında verimli bir koordinasyona sahip olmak önemlidir. Benzer şekilde, PDX'i taze doku kaynağı olarak kullanırken, doku örneğini alan kişiyle etkili koordinasyon da önemlidir. Yüksek kaliteyi korumak için doku örneğini mümkün olduğunca çabuk (hasat zamanından itibaren 30-60 dakika içinde) elde etmek çok önemlidir.

Protokol

Tüm prosedürler, Universidad Autónoma de Madrid Etik Komitesi (CEI 103-1958-A337) ve La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) tarafından onaylanan deney hayvanlarının refahı için kurumsal yönergelere ve Hayvanları İçeren Biyomedikal Araştırmalar için Uluslararası Yol Gösterici İlkeler'de belirtildiği gibi Hayvanların Bakımı ve Kullanımında Etik Davranış yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Uluslararası Tıp Bilimleri Örgütleri Konseyi (CIOMS) tarafından geliştirilmiştir. Protokol, yazılı bilgilendirilmiş onam ile biyomedikal araştırmalar için etik ilkeleri takip etti. Tümör organoid kültürlerinin oluşturulması için taze doku kullanımı için önceden etik onay alınmıştır. Numuneler, BioBank Hastanesi Ramón y Cajal-IRYCIS (Ulusal Biyobankalar Sicili B.0000678) tarafından sağlandı, ISCIII'nin Biyobankalar ve Biyomodeller Platformuna (PT20/00045) entegre edildi ve uygun etik onay ile standart işletim prosedürlerini izleyerek işlendi. Tümörler, daha önce tarif edildiği gibi,22, bağışıklığı baskılanmış 6 haftalık dişi NU-Foxn1nu çıplak farelere deri altından implante edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve PDAC PDX'leri oluşturmak için in vivo olarak geçirildi.

1. Deneysel hazırlık

  1. İnsan numunelerini sınıf II biyogüvenlik kabininde kullanın.
  2. Doku kaynaklı patojenlerin neden olduğu enfeksiyonu önlemek için prosedür boyunca laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük takın.
    NOT: Taze doku örneğini işlemek ve organoidleri ve fibroblastları kaplamak için en az 3 saat gereklidir.
  3. Taze doku örneklerini 22 hasattan sonra maksimum24 saat içinde işleyin ve işlenene kadar doku kültürü ortamında (%10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM) 4 °C'de saklayın.
  4. Tüm prosedür boyunca tüm numuneleri ve reaktifleri buz üzerinde tutun ve soğutulmuş bir santrifüjü 4 °C'ye önceden ayarladığınızdan emin olun ve hücre hazırlığına zarar vermemek için düşük hızda kullanın.
  5. Protokol sırasında kullanmak üzere P1.000 ve P200 pipet uçlarını −20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
  6. Kullanmadan önce bazal membran matrisini (Malzeme Tablosuna bakınız) ayırın. Bu protokol için 250 mL alikotlar önerilir.

2. Tümör organoidleri ve primer fibroblastlar oluşturmak için taze primer tümör dokusunun işlenmesi

NOT: Taze doku örneğini (primer insan rezektabl tümörleri veya PDX'ler) işlemek ve tümör organoidlerini ve fibroblastları kaplamak için en az 3 saat gereklidir. Doku sindiriminden tümör organoidlerinin kaplanmasına kadar organoid hazırlama sürecinin bir taslağı Şekil 1'de gösterilmektedir. Protokole başlamadan önce, −20 °C dondurucudan bazal membran matrisinin bir kısmını çıkarın ve kullanmadan önce yaklaşık 30-60 dakika buz üzerinde bırakın.

  1. Organoidleri kaplamadan 3 saat önce 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatörüne 6 oyuklu bir kültür plakası koyun.
  2. Dokuyu ölçün, fotoğraflayın ve yıkayın (adım 1.3) 3 mL Gelişmiş DMEM-F12 (Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)/Besin Karışımı F-12 Jambon (F12), %5 fetal sığır serumu (FBS), 15 mM Hepes, %1 L-Glutamin, %1 Penisilin-Streptomisin, 125 ng/mL Amfoterisin B, 0.1 mg/mL Normosin) ile yukarı ve aşağı pipetleyerek ve ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  3. Ortamı doku kültürü plakasından aspirasyon yoluyla çıkarın ve iki steril bıçak ve 2 mL Sindirim Ortamı (Gelişmiş DMEM-F12 + 10 mg Kollajenaz IV/mL, %0.000625 Tripsin-EDTA ve 10 μg/mL DNaz) kullanarak dokuyu steril bir doku kültürü plakasında 1 mm3 parçaya kesin. Dokuyu toplam 5 mL Çürütme Ortamı içeren 50 mL'lik bir tüpte toplayın ve 37 °C'de 37 °C'de 1 saat boyunca piyasada bulunan ekipmanla (Malzeme Tablosuna bakın) mekanik parçalama ile veya numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek periyodik olarak karıştırarak inkübe edin.
  4. Tripsini etkisiz hale getirmek için 5 mL Gelişmiş DMEM-F12 ekleyin ve büyük kalıntıları gidermek için numuneyi 70 μm'lik bir gözenek süzgecinden süzün.
  5. Filtrenin üst kısmına% 10 FBS ile 2 mL DMEM ekleyin ve fibroblast kültürleri oluşturmak için kalıntıları ve doku kalıntılarını toplayın (bkz. adım 5).
  6. Süzüntüyü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200-300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire ederek sadece hücre peletini bırakın. 5 mL Gelişmiş DMEM-F12 ekleyin ve 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  7. Pelet, 4 mL amonyum-klorür potasyum (ACK, bkz. Malzeme Tablosu) lizis tamponunda yeniden süspanse edilir. Karışımı 15 mL'lik bir tüpe geçirin ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu kırmızı kan hücresi lizis adımı, görünür bir kontaminasyon kanıtı olmadığında çıkarılabilir.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. 5 mL Gelişmiş DMEM-F12 ekleyin ve 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  9. Hücre peletine DNaz (1 μg/mL) ile desteklenmiş 1 mL ticari olarak temin edilebilen hücre ayrışma reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
  10. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. 5 mL Gelişmiş DMEM-F12 ekleyin ve hücre peletini yeniden süspanse edin.
  11. Hücreleri ayırmak için bir P1.000 pipetle 30 kez yukarı ve aşağı pipetleyin, 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  12. −20 °C dondurucudan P1.000 ve P200 pipet uçlarını alın ve bir P1.000 pipet ve soğuk uçlar (pelet hacmi dikkate alınarak damla başına 50 μL, kuyu başına altı ila yedi kubbe) kullanarak hücre peletini membran matrisinde yeniden süspanse edin. Önceden ısıtılmış plakayı inkübatörden çıkarın. Bir P200 pipetini 48 μL'ye ayarlayın ve önceden ısıtılmış 6 oyuklu plakada bazal membran matrisinin kubbelerini oluşturmak için soğuk uçlar kullanın.
  13. Bazal membran matris hücre kubbeli plakayı, bazal membran matrisini katılaştırmak için 15 dakika boyunca 37 °C% 5CO2 inkübatörüne koyun.
  14. 20 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng/mL insan plasenta büyüme faktörü (PlGF), 10 ng/mL rekombinant insan bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 769 ng/mL insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1) ve 10.5 μM ROCK İnhibitörü (Gelişmiş DMEM-F12 + büyüme faktörleri) ile desteklenmiş 2-2.5 mL Gelişmiş DMEM-F12 ekleyin (bkz.

3. Organoidlerin izlenmesi

  1. Tümör organoid kültürünü ilk 7 gün boyunca ve daha sonra haftada üç kez görsel olarak izleyin.
  2. 20 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng/mL insan plasenta büyüme faktörü (PlGF), 10 ng/mL rekombinant insan bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 769 ng/mL insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1) ve 10.5 μM ROCK inhibitörü (Gelişmiş DMEM-F12 + büyüme faktörleri) içeren Gelişmiş DMEM-F12 ile ortamı haftada iki kez değiştirin.
  3. Numuneyi işledikten ve büyümeyi ve canlılığı gözlemlemek için kültürü matrise kapladıktan sonra 1. gün, 3. gün, 7. gün, 10. gün ve 15. günde periyodik olarak tümör organoid kültürünün görüntülerini yakalayın.

4. Organoidlerin geçişi ve kriyopdepolanması

  1. Kültür ortamını 6 oyuklu plakadan çıkarın.
  2. Bazal membran matrisini ayırmak ve bir hücre süspansiyonu elde etmek için 1 mL uygun bir hücre geri kazanım reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve süpernatanı 15 mL'lik bir tüpte geri kazanın. Matris hemen ayrışmazsa, numuneyi tamamen eriyene kadar 4 °C'de 15-20 dakika inkübe edin.
  3. Ek ayrışmış hücreleri geri kazanmak için plakanın kuyucuğuna adım 4.2'de kullanılan aynı hücre geri kazanım reaktifinden 1 mL ekleyin ve süpernatanı adım 4.2'deki gibi aynı 15 mL tüpe ekleyin.
  4. 5 mL soğuk Gelişmiş DMEM-F12 ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı çıkarın ve kalan sıvıyı 5 mL'lik bir pipetle çıkararak peleti dikkatlice kurutun; Tüpü mümkün olduğunca hareket ettirmekten kaçının. 1:2'lik bir geçiş elde etmek için hücre peletini orijinal bazal membran matrisi hacminin iki katı kadar yeniden süspanse edin.
  6. Organoid kültürlerin dondurularak saklanması için, adım 4.5'te elde edilen peleti 1 mL dondurma ortamında (%10 DMSO, %20 FBS, %50 DMEM-F12, 10.5 μM ROCK inhibitörü) yeniden süspanse edin ve −80 °C'de saklayın.
    NOT: Bazal membran matrisinin hacmi, 1:1 (orijinaliyle aynı hacimde bazal membran matrisi kullanılarak) veya 1:3 (orijinal bazal membran matrisi hacminin üç katı eklenerek) gibi farklı geçişler gerçekleştirecek şekilde ayarlanabilir.

5. Fibroblastların oluşumu

  1. Enkaz ve doku kalıntılarını %10 FBS ile 2 mL DMEM'de geri kazandıktan sonra, bunu 6 oyuklu bir plakaya ekleyin ve 37 °C'de %5CO2 ile inkübe edin.
  2. Fibroblast kültürlerinden doku kalıntılarını, kaplamadan 2 gün veya 3 gün sonra ortamın aspirasyonu ile adım 2.5'ten çıkarın ve% 10 FBS'li taze DMEM ile değiştirin.
  3. Fibroblast kültürünü haftada üç kez görsel olarak izleyin ve% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM kullanarak kültür ortamını haftada en az iki kez değiştirin.

Sonuçlar

Kültürün aşağı akış tahlillerinde nasıl davranacağını tahmin etmek için, tümör organoid kültürünün zaman içinde, özellikle ilk birkaç hafta içinde nasıl ilerlediğini belgelemek önemlidir. Şekil 2, 15 günlük bir süre boyunca taze dokudan optimal tümör hücresi izolasyonu ve tümör organoid oluşumunun bir örneğini göstermektedir. Bazen, numunede büyük miktarda hücre kalıntısı vardır ve Şekil 3'te gösterildiği gibi gel...

Tartışmalar

Farmakolojik kanser tedavilerindeki büyük ilerlemeler zordur, çünkü faz I onkoloji klinik çalışmalarında ilaçların onaylanma olasılığı tüm hastalık türleri arasında en düşük olan %5.1'dir23. Bunun ana nedeni, kanserin çok heterojen olması ve bu nedenle hasta kohortlarının verilen tedaviye beklendiği gibi tek tip yanıt vermemesidir, bu da daha kişiselleştirilmiş bir yaklaşıma ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. İki boyutlu (2D) kültürler, translasyonel kanser ar...

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı olan Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), 857381 No'lu hibe sözleşmesi kapsamında Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı, VISION (Gastrointestinal kanserlerin erken teşhisi için bilimsel mükemmellik ve inovasyon kapasitesini güçlendirme stratejileri) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Klinik araştırmacılar ve gelişmekte olan araştırma grupları için yeni araştırma projeleri için intramural çağrı IRYCIS (2021/0446), Hasta Kaynaklı Organoidler 2.0 Projesi (CIBERONC) ve TRANSCAN II projesi JTC 2017 çağrısı "Pankreas nöroendokrin tümörleri (NExT) olan hastaların erken tanısı ve takibi için bir algoritma oluşturulması", hibe numarası 1.1.1.5/ERANET/20/03. Bu protokolde kullanılan biyolojik örnekler, BioBank Hastanesi Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) tarafından sağlanmış ve ISCIII'nin Biyobankalar ve Biyomodeller Platformuna (PT20/00045) entegre edilmiştir. Ayrıca Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita ve Thorsten Knoll'a NExT ve VISION projelerinin bir parçası olarak bu protokolün geliştirilmesine verdikleri paha biçilmez destek için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well Costar Ultra-low Attachment platesBiofilTCP011006
70 μm pore strainerVWR732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis BufferGibcoA10492-01
Amphotericin BGibco15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)NuaireNU-4750E
Cell recovery solutionCorning 354253
Collagenase IVGibco17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPESGibco31330-038
DNaseRoche10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-079-CV
Freezing container, NalgeneMerckC1562
gentleMACS Octo DissociatorMilteny Biotec130-096-427
HEPESGibco15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)enQuireBioQP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude miceJanvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)InvitrogenRP10931
L-GlutamineCorning354235
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning356234
NormocinInvivoGenant-nr-2
Pasteur pipettesDeltalab200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)Corning30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)GibcoPHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)GibcoPHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL72304
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501
Surgical BladesNahitaFMB018
TrypsinGibco25300054

Referanslar

  1. April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
  2. Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
  3. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  4. Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
  6. Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
  7. April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
  8. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
  11. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
  12. Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
  13. Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
  14. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
  17. Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
  18. Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
  19. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  20. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  21. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  22. Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
  23. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  24. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  25. Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
  26. Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
  27. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
  28. Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
  29. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  30. Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
  31. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  32. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  33. Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
  34. Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
  35. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
  36. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  37. Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 195FibroblastlarEx Vivo T m r ModelleriPrimer T m r DokularTranslasyonel Kanser Ara t rmalarTedavi Duyarl l ve DirenciH cre H cre Etkile imleriT m r Mikro evresiK lt r TeknikleriB y me Fakt r KokteylleriBiyolojik Bazal MembranDoku rne i ToplamaBiyobankac l k ve SaklamaLaboratuvar YetenekleriSOP protokolPankreas AdenokarsinomuHasta Kaynakl Ksenogreftler PDXDoku K lt rFare Olanaklar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır