JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אורגנואידים סרטניים חוללו מהפכה בחקר הסרטן ובגישה לרפואה מותאמת אישית. הם מייצגים מודל גידול רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחוקרים להישאר צעד אחד לפני הגידול במרפאה. פרוטוקול זה מבסס אורגנואידים סרטניים מדגימות טריות של רקמת גידול בלבלב וקסנוגרפטים שמקורם באדנוקרצינומה של הלבלב.

Abstract

אורגנואידים של הגידול הם מודלים תלת-ממדיים (3D) של גידולי ex vivo המשחזרים את תכונות המפתח הביולוגיות של רקמות הגידול הראשוניות המקוריות. אורגנואידים סרטניים שמקורם במטופל שימשו במחקר סרטן תרגומי וניתן ליישם אותם כדי להעריך רגישות ועמידות לטיפול, אינטראקציות תא-תא ואינטראקציות תאי גידול עם מיקרו-סביבה של הגידול. אורגנואידים סרטניים הם מערכות תרבית מורכבות הדורשות טכניקות מתקדמות של תרביות תאים ומדיה תרבית עם קוקטיילים ספציפיים של גורמי גדילה וקרום מרתף ביולוגי המחקה את הסביבה החוץ תאית. היכולת לקבוע תרביות גידול ראשוניות תלויה מאוד ברקמת המוצא, התא והמאפיינים הקליניים של הגידול, כגון דרגת הגידול. יתר על כן, איסוף דגימות רקמות, איכות החומר וכמותו, כמו גם ביו-בנקאות נכונה ואחסון הם מרכיבים חיוניים בהליך זה. היכולות הטכניות של המעבדה הן גם גורמים מכריעים שיש לקחת בחשבון. כאן, אנו מדווחים על SOP/פרוטוקול מאומת שהוא אפשרי מבחינה טכנית וכלכלית לתרבית של אורגנואידים מגידול ex vivo מדגימות רקמה טריות ממקור אדנוקרצינומה של הלבלב, בין אם מרקמת תורם ראשונית ראשונית טרייה או מקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). הטכניקה המתוארת כאן יכולה להתבצע במעבדות עם תרבית רקמה בסיסית ומתקני עכבר והיא מותאמת ליישום רחב בתחום האונקולוגיה התרגומית.

Introduction

אורגנואידים סרטניים הם תרביות מאורגנות תלת ממדיות (3D) Ex vivo הנגזרות מרקמת גידול טרייה ומספקות מודלים לסרטן. אורגנואידים סרטניים משחזרים את תכונות המפתח הביולוגיות של הגידול הראשוני המקורי 1,2,3,4 וניתן להרחיבם עד מספר חודשים ולשמר אותם בהקפאה, בדומה לקווי תאים אימורטליים קונבנציונליים. אורגנואידים גידוליים מספקים ביובנק של מודלים גידוליים שמקורם במטופל עבור רפואה תרגומית/מותאמת אישית5 ומייצגים התקדמות חשובה במערכות/מודלים של ביולוגיה של תאים סרטניים. אורגנואידים סרטניים שמקורם במטופל יכולים לשמש כמודלים ex vivo כדי לחזות את יעילותם של טיפולים אונקולוגיים/פרמקולוגיים (ניאו)אדג'ובנטיים, שעבורם נקבעות תרביות מרקמת גידול טרייה ומבחני רגישות לתרופות או פרמקוטיפ מבוצעים על בסיס ספציפי למטופל כדי לזהות סוכנים יעילים לקווי הטיפול הבאים 1,4. יתר על כן, אורגנואידים סרטניים מתגברים על מגבלת הזמינות של רקמת גידול ראשונית, וחשוב מכך, מספקים חלופה מצוינת או מערכת משלימה למודלים של עכברי in vivo, כגון xenografts שמקורם במטופל (PDX)2. המורכבות של אורגנואידים סרטניים גדלה אם תאי הגידול הראשוניים משולבים עם תאי סטרומה הנמצאים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), כגון פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון, המחקים את התפקוד והמורכבות של הגידול הראשוני. אורגנואידים גידוליים נקבעו עבור סוגי גידולים רבים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 6,7,8,9,10. התפשטות אורגנואידים מגידולים מוצקים שונים, כולל רקמת סרטן המעי הגס וסרטן השד, מבוססת היטב ובמחיר סביר מבחינה טכנית 11,12,13,14,15.

כריתות גידול כירורגיות או ביופסיות גידול מספקות דגימות ראשוניות של רקמת גידול. באופן אידיאלי, דגימות רקמת הגידול צריכות להגיע ממרכז מסת הגידול או מהקצה הפולש של הגידול, כמו גם רקמה רגילה למראה הסמוכה לגידול. בהשוואה לתרביות דו-ממדיות קונבנציונליות, אורגנואידים סרטניים דורשים מספר "תוספות", כולל קרום מרתף ביולוגי (כגון מטריג'ל, הידרוג'ל או פיגום מבוסס קולגן), המחקה את ה-TME החוץ-תאי, ומדיום גידול נוזלי המספק חומרי מזון וגורמי גדילה ספציפיים ותומך בשגשוג תאים וביכולת הקיום שלהם בתרבית16.

השלבים הבסיסיים ביותר בתרבית תאים ראשונית הם שטיפת הרקמה בתמיסת מלח למניעת זיהום, חיתוך מכני / עיכול הגידול לחתיכות קטנות של 1-3 מ"מ3, וטיפול בקולגנאז לעיכול אנזימטי של הרקמה. לאחר מכן מסוננים את התערובת המעוכלת כדי להסיר שברי רקמה גדולים, מרחפים מחדש בקרום מרתף ביולוגי כמו מטריג'ל, ומצופים ככיפות בלוחות תרבית בעלי חיבור נמוך כדי להגביר את הצמיחה שאינה מחוברת. כיפות מטריצת קרום המרתף מכוסות בתווך תרבית נוזלית ומשלימות גלוטמין ואנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום, כמו גם עם גורמי גדילה ספציפיים בהתאם לסוג הרקמה 7,8,9,16,17. תאים רלוונטיים אחרים הנמצאים בתוך הגידול בתפזורת וב- TME עשויים גם הם להיות מבודדים, כגון פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) ותאים חיסוניים. טכניקה זו, אשר נסקרה לאחרונה18, מאפשרת הקמת תרביות משותפות עם סוגי תאים שונים כדי לחקור את התגובה לטיפול בסביבת גידול "מציאותית" יותר. יתר על כן, ניתן לחקור אינטראקציות תא-תא ואת האינטראקציה בין תאי הגידול לבין רכיבי המטריצה הביולוגית הסובבת.

שיעור ההצלחה המדווח של התבססות אורגנואידים של הגידול באמצעות רקמה טרייה מביופסיות או רקמת גידול במערכת העיכול שנכרתה הוא סביב 50%11, ושיעור ההצלחה של האחרונה תלוי במידה רבה בסוג הרקמה ובמקור4, במיוחד בדרגת הגידול ובתאיות הגידול הכללית. מודלים תלת-ממדיים של גידולים הם בעלי מורכבות משתנה, החל מאגרגטים חד-תאיים פשוטים ועד מודלים מהונדסים מורכבים ביותר המורכבים מסוגי תאים שונים. המינוח המשמש לתיאור תרבויות תלת-ממדיות בספרות הוא מאוד לא עקבי 19,20,21, שכן משתמשים במונחים שונים כגון ספרואידים, גידולים ואורגנואידים, אם כי ההבדל ביניהם אינו ברור. מכיוון שעדיין לא הושגה הסכמה ברורה על ההגדרה, במאמר זה, אורגנואיד גידולי מתואר כתרבית תאי גידול מאורגנת המשובצת בקרום מרתף ביולוגי.

כאן, פרוטוקול מאומת מדווח להקמת אורגנואידים גידוליים מדגימות רקמה טריות שמקורן באדנוקרצינומה טרייה ראשונית או PDX שמקורה באדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), וניתן לבצע פרוטוקול זה ברוב המעבדות עם מתקני תרבית רקמה בסיסיים. פרוטוקול זה הותאם ממספר פרוטוקולים מדווחים עדכניים המשמשים כיום לקביעת אורגנואידים גידוליים או גידולים מרקמת גידול העיכול מהקבוצות של David Tuveson9, Hans Clevers8 ו- Aurel Perren7.

פרוטוקול זה אינו דן באופן קצירת הרקמה הטרייה. כדי להשיג רקמת גידול אנושית טרייה באיכות גבוהה, חשוב שיהיה תיאום יעיל בין המנתחים שקוצרים את הרקמה לבין המחלקה הפתולוגית שמחלצת את דגימת הרקמה לתרבית אורגנואידים. כמו כן, בעת שימוש ב- PDX כמקור רקמה טרי, חשוב גם תיאום יעיל עם האדם שקוצר את דגימת הרקמה. חשוב מאוד לקבל את דגימת הרקמה מהר ככל האפשר (תוך 30-60 דקות מזמן הקציר) על מנת לשמור על איכות גבוהה.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לרווחת חיות ניסוי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה האוטונומית של מדריד (CEI 103-1958-A337) ולה קומונידד דה מדריד (PROEX 294/19) ובהתאם להנחיות להתנהגות אתית בטיפול ובשימוש בבעלי חיים כאמור בעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי המערבים בעלי חיים, פותח על ידי המועצה לארגונים בינלאומיים של מדעי הרפואה (CIOMS). הפרוטוקול פעל על פי העקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי בהסכמה מדעת בכתב. התקבל אישור אתי מוקדם לשימוש ברקמה טרייה להקמת תרביות אורגנואידים גידוליים. הדגימות סופקו על ידי בית החולים BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (הרישום הלאומי של Biobanks B.0000678), שולבו בפלטפורמת Biobanks and Biomodels של ISCIII (PT20/00045), ועובדו בהתאם לנוהלי הפעלה סטנדרטיים עם אישור אתי מתאים. הגידולים הושתלו תת עורית, כפי שתואר קודם לכן22, בנקבות NU-Foxn1nu עירומות מדוכאות חיסון בנות 6 שבועות (ראו טבלת חומרים) ועברו in vivo כדי לבסס PDAC PDXs.

1. הכנה ניסיונית

  1. טפל בדגימות אנושיות בארון בטיחות ביולוגית Class II.
  2. יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום על ידי פתוגנים הנישאים ברקמות.
    הערה: נדרש מינימום של 3 שעות כדי לעבד את דגימת הרקמה הטרייה ולצלחת את האורגנואידים והפיברובלסטים.
  3. יש לעבד את דגימות הרקמה הטרייה22 תוך 24 שעות לכל היותר מהקטיף, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C במדיום תרבית רקמה (DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) עד לעיבוד.
  4. שמור את כל הדגימות והריאגנטים על הקרח במהלך כל ההליך, והקפד להגדיר מראש צנטריפוגה בקירור ל -4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בה במהירות נמוכה כדי למנוע נזק להכנת התא.
  5. אחסנו קצוות פיפטה P1,000 ו-P200 במקפיא בטמפרטורה של -20°C לשימוש במהלך הפרוטוקול.
  6. יש להשתמש במטריצת קרום המרתף (ראו טבלת חומרים) לפני השימוש. עבור פרוטוקול זה, מומלץ 250 מ"ל aliquots.

2. עיבוד רקמת גידול ראשונית טרייה לביסוס אורגנואידים סרטניים ופיברובלסטים ראשוניים

הערה: נדרש מינימום של 3 שעות כדי לעבד את דגימת הרקמה הטרייה (גידולים אנושיים ראשוניים הניתנים לניתוח או PDX) וכדי לצלחת את אורגנואידים הגידול ופיברובלסטים. מתאר של תהליך הכנת האורגנואידים מוצג באיור 1, מעיכול רקמות ועד ציפוי האורגנואידים של הגידול. לפני תחילת הפרוטוקול, הוציאו אליקוט של מטריצת קרום המרתף מהמקפיא בטמפרטורה של 20°C, והשאירו אותו על קרח למשך כ-30-60 דקות לפני השימוש.

  1. שים צלחת תרבית 6 בארות באינקובטור תרבית תאים 37 מעלות צלזיוס 3 שעות לפני ציפוי האורגנואידים.
  2. מדדו, צלמו ושטפו את הרקמה (שלב 1.3) עם 3 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Blend Blend F-12 Ham (F12), בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), 15 mM Hepes, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 125 ng/mL Amphotericin B, 0.1 מ"ג/מ"ל Normocin) (ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטציה למעלה ולמטה ולאחר מכן לשטוף עם 3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  3. הסר את המדיה על ידי שאיפה מצלחת תרבית הרקמה וחתך את הרקמה ל 1 מ"מ3 חתיכות בצלחת תרבית רקמה סטרילית באמצעות שני להבים סטריליים ו 2 מ"ל של מדיום עיכול (מתקדם DMEM-F12 + 10 מ"ג Collagenase IV / מ"ל, 0.000625% טריפסין-EDTA, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל DNase). לאסוף את הרקמה בצינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל סה"כ של מדיה העיכול ולדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C עם עיכול מכני עם ציוד זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים) או עם ערבוב תקופתי של הדגימה, על ידי pipeting הדגימה למעלה ולמטה.
  4. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם כדי להשבית את הטריפסין, וסנן את הדגימה דרך מסננת נקבוביות של 70 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה.
  5. הוסף 2 מ"ל DMEM עם 10% FBS לחלק העליון של המסנן, ואסוף את הפסולת ושאריות הרקמה כדי ליצור תרביות של פיברובלסטים (ראה שלב 5).
  6. צנטריפוגו את התסנין ב 200-300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ושאפו את supernatant, משאיר רק את גלולת התא. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
  7. להשהות מחדש את הגלולה ב 4 מ"ל של אשלגן אמוניום-כלוריד (ACK, ראה טבלה של חומרים) חיץ ליזיס. מעבירים את התערובת לצינור של 15 מ"ל, ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות כדי לשכך את תאי הדם האדומים.
    הערה: ניתן להסיר שלב זה של ליזה של תאי דם אדומים כאשר אין עדות נראית לעין לזיהום.
  8. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולשאוף את supernatant. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
  9. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאי זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) בתוספת DNase (1 מיקרוגרם / מ"ל) לכדורית התא, ודגרה במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, והשהה מחדש את גלולת התא.
  11. פיפטה למעלה ולמטה 30 פעמים עם פיפטה P1,000 כדי לנתק את התאים, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם, ולהסיר את supernatant.
  12. קחו קצוות פיפטה P1,000 ו-P200 מהמקפיא בטמפרטורה של 20°C-, והשהו מחדש את כדורית התא במטריצת הממברנה באמצעות פיפטה P1,000 וקצוות קרים (50 מיקרוליטר לטיפה, תוך התחשבות בנפח הכדור, שש עד שבע כיפות לבאר). מוציאים את הצלחת שחוממה בעבר מהאינקובטור. הגדר פיפטה P200 ל 48 μL, והשתמש בקצוות קרים כדי ליצור כיפות של מטריצת קרום המרתף בצלחת 6 בארות שחוממה מראש.
  13. הכנס את הצלחת עם כיפות תאי המטריקס של קרום המרתף לתוך אינקובטור 37 ° C 5% CO2 למשך 15 דקות כדי למצק את מטריצת קרום המרתף.
  14. הוסף 2-2.5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, בתוספת 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF), 100 ng/mL גורם גדילה שליה אנושית (PlGF), 10 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF), 769 ng/mL גורם גדילה דמוי אינסולין-1 (IGF-1), ומעכב ROCK 10.5 μM (DMEM-F12 מתקדם + גורמי גדילה) (ראה טבלת חומרים).

3. ניטור האורגנואידים

  1. עקוב אחר תרבית האורגנואידים של הגידול באופן חזותי במשך 7 הימים הראשונים ולאחר מכן שלוש פעמים בשבוע לאחר מכן.
  2. שנה את המדיום פעמיים בשבוע עם DMEM-F12 מתקדם המכיל 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF), 100 ng/mL גורם גדילה שליה אנושית (PlGF), 10 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF), 769 ng/mL גורם גדילה דמוי אינסולין-1 (IGF-1), ומעכב ROCK 10.5 μM (DMEM-F12 מתקדם + גורמי גדילה).
  3. צלם תמונות של תרבית אורגנואיד הגידול מעת לעת ביום 1, יום 3, יום 7, יום 10 ויום 15 לאחר עיבוד הדגימה וציפוי התרבית במטריצה כדי לבחון את הצמיחה ואת הכדאיות.

4. מעבר והקפאה של האורגנואידים

  1. מוציאים את מדיום התרבית מצלחת 6 הבארות.
  2. הוסף 1 מ"ל של מגיב שחזור תאים מתאים (ראה טבלת חומרים) כדי לנתק את מטריצת קרום המרתף ולקבל תרחיף תא, ולשחזר את supernatant בצינור 15 מ"ל. אם המטריצה אינה מתנתקת מיד, יש לדגור על הדגימה בטמפרטורה של 4°C למשך 15-20 דקות עד להמסה מלאה.
  3. הוסף 1 מ"ל של אותו מגיב שחזור תאים המשמש בשלב 4.2 לבאר הצלחת כדי לשחזר תאים מנותקים נוספים, והוסף את supernatant לאותו צינור 15 מ"ל כמו בשלב 4.2.
  4. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם קר, וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
  5. הסר את supernatant, ולייבש את הגלולה בזהירות על ידי הסרת כל נוזל שנותר עם פיפטה 5 מ"ל; הימנעו ככל האפשר מהזזת הצינור. השהה מחדש את גלולת התא בנפח כפול מהנפח המקורי של מטריצת קרום המרתף על מנת לקבל מעבר של 1:2.
  6. עבור cryostorage של תרביות אורגנואידים, להשעות מחדש את הגלולה המתקבלת בשלב 4.5 ב 1 מ"ל של מדיום הקפאה (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10.5 μM מעכב רוק), ולאחסן ב -80 ° C.
    הערה: ניתן לכוונן את נפח מטריצת קרום המרתף לביצוע מעברים שונים, כגון 1:1 (תוך שימוש באותו נפח של מטריצת קרום מרתף כמו המקור) או 1:3 (הוספת פי שלושה מהנפח המקורי של מטריצת קרום המרתף).

5. הקמת פיברובלסטים

  1. לאחר שחזור פסולת ושאריות רקמות ב 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, להוסיף את זה צלחת 6 באר, לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2.
  2. הסר את שאריות הרקמה מתרביות הפיברובלסטים משלב 2.5 בשאיפה של המדיום יומיים או 3 ימים לאחר הציפוי, והחלף ב- DMEM טרי ב- 10% FBS.
  3. עקוב אחר תרבית הפיברובלסטים באופן חזותי שלוש פעמים בשבוע, ושנה את מדיום התרבית לפחות פעמיים בשבוע באמצעות DMEM בתוספת FBS של 10%.

תוצאות

חשוב לתעד כיצד תרבית האורגנואידים של הגידול מתקדמת לאורך זמן, במיוחד בשבועות הראשונים, על מנת להעריך כיצד התרבית תתנהג בבדיקות במורד הזרם. איור 2 מראה דוגמה לבידוד אופטימלי של תאי הגידול והתבססות אורגנואידים של הגידול מרקמה טרייה במשך תקופה של 15 יום. לפעמים יש כמות גדולה ש?...

Discussion

ההתקדמות הגדולה בטיפולים פרמקולוגיים לסרטן מאתגרת, שכן הסיכוי לאישור תרופות בשלב I של הניסויים האונקולוגיים הקליניים הוא 5.1%, שהוא הנמוך ביותר מבין כל סוגי המחלה23. הסיבה העיקרית היא שהסרטן הוא הטרוגני מאוד, ולכן קבוצות החולים אינן מגיבות באופן אחיד כמצופה לטיפול הנתון, מה שמד?...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מימון של Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם מענק מס '857381, פרויקט VISION (אסטרטגיות לחיזוק מצוינות מדעית ויכולת חדשנות לאבחון מוקדם של סרטן מערכת העיכול), קול קורא לפרויקטים מחקריים חדשים עבור חוקרים קליניים וקבוצות מחקר מתפתחות IRYCIS (2021/0446), פרויקט אורגנואידים נגזרים ממטופל 2.0 (CIBERONC) ופרויקט TRANSCAN II JTC 2017 קוראים "הקמת אלגוריתם לאבחון מוקדם ומעקב אחר חולים עם גידולים נוירואנדוקריניים בלבלב (NExT)", מענק מספר 1.1.1.5/ERANET/20/03. הדגימות הביולוגיות המשמשות בפרוטוקול זה סופקו על ידי בית החולים BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) ושולבו בפלטפורמת Biobanks and Biomodels של ISCIII (PT20/00045). ברצוננו גם להודות לאיבון קוהל, אגאפי קטאקי ויטה רוביטה ותורסטן קנול על תמיכתם שלא תסולא בפז בפיתוח פרוטוקול זה כחלק מהפרויקטים של NExT ו-VISION.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well Costar Ultra-low Attachment platesBiofilTCP011006
70 μm pore strainerVWR732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis BufferGibcoA10492-01
Amphotericin BGibco15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)NuaireNU-4750E
Cell recovery solutionCorning 354253
Collagenase IVGibco17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPESGibco31330-038
DNaseRoche10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-079-CV
Freezing container, NalgeneMerckC1562
gentleMACS Octo DissociatorMilteny Biotec130-096-427
HEPESGibco15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)enQuireBioQP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude miceJanvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)InvitrogenRP10931
L-GlutamineCorning354235
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning356234
NormocinInvivoGenant-nr-2
Pasteur pipettesDeltalab200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)Corning30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)GibcoPHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)GibcoPHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL72304
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501
Surgical BladesNahitaFMB018
TrypsinGibco25300054

References

  1. April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
  2. Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
  3. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  4. Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
  6. Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
  7. April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
  8. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
  11. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
  12. Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
  13. Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
  14. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
  17. Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
  18. Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
  19. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  20. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  21. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  22. Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
  23. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  24. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  25. Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
  26. Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
  27. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
  28. Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
  29. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  30. Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
  31. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  32. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  33. Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
  34. Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
  35. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
  36. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  37. Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195Ex VivoSOPPDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved