הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

Summary

אורגנואידים סרטניים חוללו מהפכה בחקר הסרטן ובגישה לרפואה מותאמת אישית. הם מייצגים מודל גידול רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחוקרים להישאר צעד אחד לפני הגידול במרפאה. פרוטוקול זה מבסס אורגנואידים סרטניים מדגימות טריות של רקמת גידול בלבלב וקסנוגרפטים שמקורם באדנוקרצינומה של הלבלב.

Abstract

אורגנואידים של הגידול הם מודלים תלת-ממדיים (3D) של גידולי ex vivo המשחזרים את תכונות המפתח הביולוגיות של רקמות הגידול הראשוניות המקוריות. אורגנואידים סרטניים שמקורם במטופל שימשו במחקר סרטן תרגומי וניתן ליישם אותם כדי להעריך רגישות ועמידות לטיפול, אינטראקציות תא-תא ואינטראקציות תאי גידול עם מיקרו-סביבה של הגידול. אורגנואידים סרטניים הם מערכות תרבית מורכבות הדורשות טכניקות מתקדמות של תרביות תאים ומדיה תרבית עם קוקטיילים ספציפיים של גורמי גדילה וקרום מרתף ביולוגי המחקה את הסביבה החוץ תאית. היכולת לקבוע תרביות גידול ראשוניות תלויה מאוד ברקמת המוצא, התא והמאפיינים הקליניים של הגידול, כגון דרגת הגידול. יתר על כן, איסוף דגימות רקמות, איכות החומר וכמותו, כמו גם ביו-בנקאות נכונה ואחסון הם מרכיבים חיוניים בהליך זה. היכולות הטכניות של המעבדה הן גם גורמים מכריעים שיש לקחת בחשבון. כאן, אנו מדווחים על SOP/פרוטוקול מאומת שהוא אפשרי מבחינה טכנית וכלכלית לתרבית של אורגנואידים מגידול ex vivo מדגימות רקמה טריות ממקור אדנוקרצינומה של הלבלב, בין אם מרקמת תורם ראשונית ראשונית טרייה או מקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). הטכניקה המתוארת כאן יכולה להתבצע במעבדות עם תרבית רקמה בסיסית ומתקני עכבר והיא מותאמת ליישום רחב בתחום האונקולוגיה התרגומית.

Introduction

אורגנואידים סרטניים הם תרביות מאורגנות תלת ממדיות (3D) Ex vivo הנגזרות מרקמת גידול טרייה ומספקות מודלים לסרטן. אורגנואידים סרטניים משחזרים את תכונות המפתח הביולוגיות של הגידול הראשוני המקורי 1,2,3,4 וניתן להרחיבם עד מספר חודשים ולשמר אותם בהקפאה^, בדומה לקווי תאים אימורטליים קונבנציונליים. אורגנואידים גידוליים מספקים ביובנק של מודלים גידוליים שמקורם במטופל עבור רפואה תרגומית/מותאמת אישית⁵ ומייצגים התקדמות חשובה במערכות/מודלים של ביולוגיה של תאים סרטניים. אורגנואידים סרטניים שמקורם במטופל יכולים לשמש כמודלים <....

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לרווחת חיות ניסוי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה האוטונומית של מדריד (CEI 103-1958-A337) ולה קומונידד דה מדריד (PROEX 294/19) ובהתאם להנחיות להתנהגות אתית בטיפול ובשימוש בבעלי חיים כאמור בעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי המערבים בעלי חיים, פותח על ידי המועצה לארגונים בינלאומיים של מדעי הרפואה (CIOMS). הפרוטוקול פעל על פי העקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי בהסכמה מדעת בכתב. התקבל אישור אתי מוקדם לשימוש ברקמה טרייה להקמת תרביות אורגנואידים גידוליים. הדגימות סופקו על ידי בית החולים BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (הרישום הלאומי של Biobanks B.0000678), שולבו בפלטפורמת Biobanks and Biomodels של ISCIII (PT20/00045), ועו....

תוצאות

חשוב לתעד כיצד תרבית האורגנואידים של הגידול מתקדמת לאורך זמן, במיוחד בשבועות הראשונים, על מנת להעריך כיצד התרבית תתנהג בבדיקות במורד הזרם. איור 2 מראה דוגמה לבידוד אופטימלי של תאי הגידול והתבססות אורגנואידים של הגידול מרקמה טרייה במשך תקופה של 15 יום. לפעמים יש כמות גדולה ש?.......

Discussion

ההתקדמות הגדולה בטיפולים פרמקולוגיים לסרטן מאתגרת, שכן הסיכוי לאישור תרופות בשלב I של הניסויים האונקולוגיים הקליניים הוא 5.1%, שהוא הנמוך ביותר מבין כל סוגי המחלה²³. הסיבה העיקרית היא שהסרטן הוא הטרוגני מאוד, ולכן קבוצות החולים אינן מגיבות באופן אחיד כמצופה לטיפול הנתון, מה שמד?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054