Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Resumen

Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.

Resumen

Los organoides tumorales son modelos tumorales ex vivo tridimensionales (3D) que recapitulan las características biológicas clave de los tejidos tumorales primarios originales. Los organoides tumorales derivados de pacientes se han utilizado en la investigación traslacional del cáncer y se pueden aplicar para evaluar la sensibilidad y la resistencia al tratamiento, las interacciones entre células y las interacciones de las células tumorales con el microambiente tumoral. Los organoides tumorales son sistemas de cultivo complejos que requieren técnicas avanzadas de cultivo celular y medios de cultivo con cócteles específicos de factores de crecimiento y una membrana basal biológica que imita el entorno extracelular. La capacidad de establecer cultivos tumorales primarios depende en gran medida del tejido de origen, la celularidad y las características clínicas del tumor, como el grado tumoral. Además, la recogida de muestras de tejido, la calidad y cantidad del material, así como el correcto biobanco y almacenamiento son elementos cruciales de este procedimiento. Las capacidades técnicas del laboratorio también son factores cruciales a tener en cuenta. Aquí, reportamos un SOP/protocolo validado que es técnica y económicamente factible para el cultivo de organoides tumorales ex vivo a partir de muestras de tejido fresco de origen adenocarcinoma de páncreas, ya sea a partir de tejido fresco de donante de paciente resecado primario o xenoinjertos derivados del paciente (PDX). La técnica descrita en este documento se puede realizar en laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos y ratones y está diseñada para una amplia aplicación en el campo de la oncología traslacional.

Introducción

Los organoides tumorales son cultivos organizados tridimensionales (3D) ex vivo que se derivan de tejido tumoral fresco y proporcionan modelos de cáncer. Los organoides tumorales recapitulan las características biológicas clave del tumor primario original 1,2,3,4 y pueden expandirse hasta varios meses y criopreservarse^, de forma similar a las líneas celulares inmortalizadas convencionales. Los organoides tumorales proporcionan un biobanco de modelos tumorales derivados de pacientes para la medicina traslacional/personalizada

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el bienestar de los animales de experimentación aprobadas por el Comité de Ética de la Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) y la Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) y de acuerdo con las directrices de Conducta Ética en el Cuidado y Uso de los Animales recogidas en los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica con Animales. desarrollado por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (CIOMS). El protocolo siguió los principios éticos para la investigación biomédica con el consentimiento informado por escrito. Se obtuvo ....

Discusión

Los grandes avances en las terapias farmacológicas contra el cáncer son un reto, ya que la probabilidad de aprobación de fármacos en ensayos clínicos oncológicos de fase I es del 5,1%, que es la más baja de todos los tipos de enfermedades²³. La razón principal es que el cáncer es muy heterogéneo y, por lo tanto, las cohortes de pacientes no responden de manera uniforme como se espera al tratamiento dado, lo que pone de manifiesto que se necesita un enfoque más personalizado. Los cultivo.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates	Biofil	TCP011006
70 μm pore strainer	VWR	732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Amphotericin B	Gibco	15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC)	Nuaire	NU-4750E
Cell recovery solution	Corning	354253
Collagenase IV	Gibco	17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES	Gibco	31330-038
DNase	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-079-CV
Freezing container, Nalgene	Merck	C1562
gentleMACS Octo Dissociator	Milteny Biotec	130-096-427
HEPES	Gibco	15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF)	enQuireBio	QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice	Janvier, France
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)	Invitrogen	RP10931
L-Glutamine	Corning	354235
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
Pasteur pipettes	Deltalab	200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x)	Corning	30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Gibco	PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Gibco	PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL	72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501
Surgical Blades	Nahita	FMB018
Trypsin	Gibco	25300054