A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للاكتساب المتزامن والتسجيل المشترك لأحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الأنسولين والجلوكاجون بواسطة الجزر الكاذبة البشرية الأولية باستخدام توصيل الفيروس الغدي لمستشعر حيوي دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وكاشف فرق cAMP في الموقع (cADDis) ، ونظام microperifusion.

Abstract

جزر البنكرياس في لانجرهانز ، وهي مجموعات 3D صغيرة من الغدد الصماء المتخصصة والخلايا الداعمة التي تتخللها البنكرياس ، لها دور مركزي في السيطرة على توازن الجلوكوز من خلال إفراز الأنسولين بواسطة خلايا بيتا ، مما يخفض نسبة الجلوكوز في الدم ، والجلوكاجون بواسطة خلايا ألفا ، مما يرفع نسبة الجلوكوز في الدم. تعد مسارات الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتوسطها cAMP ، أساسية لتنظيم إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا. هيكل جزيرة 3D ، في حين أنه ضروري لوظيفة الجزيرة المنسقة ، يقدم تحديات تجريبية للدراسات الميكانيكية لمسارات الإشارات داخل الخلايا في خلايا الجزيرة البشرية الأولية. للتغلب على هذه التحديات والقيود ، يصف هذا البروتوكول تصويرا متكاملا للخلايا الحية ومنصة الموائع الدقيقة باستخدام الجزر الكاذبة البشرية الأولية المتولدة من متبرعين غير مصابين بداء السكري تشبه الجزر الأصلية في مورفولوجيتها وتكوينها ووظيفتها. يتم التحكم في حجم هذه الجزر الكاذبة من خلال عملية التشتت وإعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية الأولية. في الحالة المشتتة ، يمكن التلاعب بالتعبير الجيني لخلية الجزيرة. على سبيل المثال ، يمكن إدخال أجهزة الاستشعار الحيوية مثل المستشعر الحيوي cAMP المشفر وراثيا ، cADDis. بمجرد تشكيلها ، تسمح الجزر الكاذبة التي تعبر عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر ومنصة microperifusion ، بالتقييم المتزامن لديناميكيات المستشعر الحيوي الفلوري وملامح إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا لتوفير مزيد من التبصر في العمليات الخلوية والوظيفة.

Introduction

جزر لانجرهانز أعضاء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء البنكرياس، ووظيفتها حاسمة للحفاظ على توازن الجلوكوز. يفرز الأنسولين من خلايا بيتا بعد استقلاب الجلوكوز ، وزيادة نسبة ATP / ADP ، وإغلاق قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، وإزالة استقطاب غشاء البلازما ، وتدفق الكالسيوم خارج الخلية1. إفراز الجلوكاجون من خلايا ألفا أقل فهما ، ولكن تم افتراض أن المسارات داخل الخلايا و paracrine تساهم في زيادة عدد الخلايا الحبيبيةللجلوكاجون 2،3،4. يرتبط كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 بخلل الخلايا الجزيرية5،6،

Protocol

تم الحصول على الجزر البشرية (N = 4 مستحضرات) من خلال شراكات مع برنامج توزيع الجزر المتكامل ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري ، ومختبرات Prodo ، Inc. ، و Imagine Pharma. لا يعتبر مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فاندربيلت عينات البنكرياس البشرية غير المحددة كأبحاث بشرية. لن يكون هذا العمل ممكنا بدون المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم ومنظمات شراء الأعضاء. انظر الجدول 1 للاطلاع على المعلومات الديمغرافية للمانحين. تم عزل الجزر البشرية من المتبرعين بالبنكرياس غير المصابين بداء السكري بأقل من 15 ساعة من وقت نقص التروية الباردة.

1. تشكيل جزيرة زائفة (مفصلة في Walker et al.7)

    <....

النتائج

تم إنشاء الجزر الكاذبة البشرية المعبرة عن أجهزة الاستشعار الحيوية عن طريق توصيل الفيروسات الغدية للتركيبات التي تشفر cAMP biosensor cADDis (الشكل 1 أ). يوضح الشكل 1B إعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية المتحولة بمرور الوقت ، مع ملاحظة الجزر الكاذبة كاملة التكو?.......

Discussion

يسمح دمج نظام microperifusion ، والجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر بالتقييم المتزامن لأحداث الإشارات داخل الخلايا وملامح إفراز الهرمونات الديناميكية. يمكن لنظام microperifusion الديناميكي تقديم سلسلة من المحفزات المحددة جيدا إلى الجزر الكا?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم تقدير المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم لتبرعاتهم التي لا تقدر بثمن ، ويتم الاعتراف بالمعهد الدولي لمنظمات شراء الأعضاء ، وتقدم الطب (IIAM) والتبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI) لشراكتهم في جعل أنسجة البنكرياس البشرية متاحة للبحث. تم دعم هذا العمل من قبل شبكة أبحاث الجزر البشرية (RRID: SCR_014393) ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري (RRID: SCR_016202) ، DK106755 ، DK123716 ، DK123743 ، DK120456 ، DK104211 ، DK108120 ، DK112232 ، DK117147 ، DK112217 ، EY032442 ، و DK20593 (مركز فاندربيلت لأبحاث وتدريب مرض السكري) ، صندوق ليونا إم وهاري بي هيلمسلي الخيري ، JDRF ، وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية (BX000666) ، NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007347) ، F30DK134041 ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ad-CMV-cADDisWelgenNot applicable
 0.01” FEP tubingIDEX1527L
1 M HEPESGibco15630-080Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubesAnyAny
10 μm PTFE filterCole-ParmerSK-21940-41Change every 8-10 runs
100 mM Sodium PyruvateThermo Scientific11360070Enriched-CMRL Media Component
190 proof EthanolDecon labs2816Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I SupplementGibco35050061Enriched-CMRL Media Component
AscorbateSigmaA5960DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum AlbuminSigmaA7888DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap Omnifit006BT
CellCarrier ULA 96-well MicroplatesPerkin Elmer6055330
cellSens analysis softwareOlympusv3.1Software used for data analysis
CMRL 1066MediaTech 15-110-CVEnriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)IDEXP-794
D-(+)-GlucoseSigmaG7528Glucose Buffer Component
DMEM SigmaD5030DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamberokolabIX83
Epinepherine (Epi)SigmaE4250Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat InactivatedSigma12306CEnriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISAMercodia10-1281-01
Glucagon Kit HTRFCisbio62CGLPEH
HCl (12N)AnyAnyAcid Ethanol Component
HEPESSigmaH7523DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium SupplementCell DynamicsM1019iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24Cole-ParmerEW-00414-LW
Insulin ELISAMercodia10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)SigmaI5879Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscopeOlympusFV3000
L-GlutamineSigmaG8540DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)University of MiamiFP-3W
Microchip holder Micronit MicrofluidicsFC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction CollectorBiorad7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tipsAnyAny
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump InstechP720
Phosphate Buffered SalineGibco14190-144Wash Islets
Sarstedt dishesSarstedtdepends on dish diameter
Sodium BicarbonateSigmaS6014DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium PyruvateSigmaP2256 DMEM Perifusion Buffer Component
StereoscopeOlympusSZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)MilliporeSCGP00525Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine Cell TechnologyLL-0003iEC Media Component

References

  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glu....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved