A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
يصف هذا البروتوكول طريقة للاكتساب المتزامن والتسجيل المشترك لأحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الأنسولين والجلوكاجون بواسطة الجزر الكاذبة البشرية الأولية باستخدام توصيل الفيروس الغدي لمستشعر حيوي دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وكاشف فرق cAMP في الموقع (cADDis) ، ونظام microperifusion.
جزر البنكرياس في لانجرهانز ، وهي مجموعات 3D صغيرة من الغدد الصماء المتخصصة والخلايا الداعمة التي تتخللها البنكرياس ، لها دور مركزي في السيطرة على توازن الجلوكوز من خلال إفراز الأنسولين بواسطة خلايا بيتا ، مما يخفض نسبة الجلوكوز في الدم ، والجلوكاجون بواسطة خلايا ألفا ، مما يرفع نسبة الجلوكوز في الدم. تعد مسارات الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتوسطها cAMP ، أساسية لتنظيم إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا. هيكل جزيرة 3D ، في حين أنه ضروري لوظيفة الجزيرة المنسقة ، يقدم تحديات تجريبية للدراسات الميكانيكية لمسارات الإشارات داخل الخلايا في خلايا الجزيرة البشرية الأولية. للتغلب على هذه التحديات والقيود ، يصف هذا البروتوكول تصويرا متكاملا للخلايا الحية ومنصة الموائع الدقيقة باستخدام الجزر الكاذبة البشرية الأولية المتولدة من متبرعين غير مصابين بداء السكري تشبه الجزر الأصلية في مورفولوجيتها وتكوينها ووظيفتها. يتم التحكم في حجم هذه الجزر الكاذبة من خلال عملية التشتت وإعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية الأولية. في الحالة المشتتة ، يمكن التلاعب بالتعبير الجيني لخلية الجزيرة. على سبيل المثال ، يمكن إدخال أجهزة الاستشعار الحيوية مثل المستشعر الحيوي cAMP المشفر وراثيا ، cADDis. بمجرد تشكيلها ، تسمح الجزر الكاذبة التي تعبر عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر ومنصة microperifusion ، بالتقييم المتزامن لديناميكيات المستشعر الحيوي الفلوري وملامح إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا لتوفير مزيد من التبصر في العمليات الخلوية والوظيفة.
جزر لانجرهانز أعضاء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء البنكرياس، ووظيفتها حاسمة للحفاظ على توازن الجلوكوز. يفرز الأنسولين من خلايا بيتا بعد استقلاب الجلوكوز ، وزيادة نسبة ATP / ADP ، وإغلاق قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، وإزالة استقطاب غشاء البلازما ، وتدفق الكالسيوم خارج الخلية1. إفراز الجلوكاجون من خلايا ألفا أقل فهما ، ولكن تم افتراض أن المسارات داخل الخلايا و paracrine تساهم في زيادة عدد الخلايا الحبيبيةللجلوكاجون 2،3،4. يرتبط كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 بخلل الخلايا الجزيرية5،6،
تم الحصول على الجزر البشرية (N = 4 مستحضرات) من خلال شراكات مع برنامج توزيع الجزر المتكامل ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري ، ومختبرات Prodo ، Inc. ، و Imagine Pharma. لا يعتبر مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فاندربيلت عينات البنكرياس البشرية غير المحددة كأبحاث بشرية. لن يكون هذا العمل ممكنا بدون المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم ومنظمات شراء الأعضاء. انظر الجدول 1 للاطلاع على المعلومات الديمغرافية للمانحين. تم عزل الجزر البشرية من المتبرعين بالبنكرياس غير المصابين بداء السكري بأقل من 15 ساعة من وقت نقص التروية الباردة.
1. تشكيل جزيرة زائفة (مفصلة في Walker et al.7)
تم إنشاء الجزر الكاذبة البشرية المعبرة عن أجهزة الاستشعار الحيوية عن طريق توصيل الفيروسات الغدية للتركيبات التي تشفر cAMP biosensor cADDis (الشكل 1 أ). يوضح الشكل 1B إعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية المتحولة بمرور الوقت ، مع ملاحظة الجزر الكاذبة كاملة التكو?.......
يسمح دمج نظام microperifusion ، والجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر بالتقييم المتزامن لأحداث الإشارات داخل الخلايا وملامح إفراز الهرمونات الديناميكية. يمكن لنظام microperifusion الديناميكي تقديم سلسلة من المحفزات المحددة جيدا إلى الجزر الكا?.......
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
يتم تقدير المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم لتبرعاتهم التي لا تقدر بثمن ، ويتم الاعتراف بالمعهد الدولي لمنظمات شراء الأعضاء ، وتقدم الطب (IIAM) والتبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI) لشراكتهم في جعل أنسجة البنكرياس البشرية متاحة للبحث. تم دعم هذا العمل من قبل شبكة أبحاث الجزر البشرية (RRID: SCR_014393) ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري (RRID: SCR_016202) ، DK106755 ، DK123716 ، DK123743 ، DK120456 ، DK104211 ، DK108120 ، DK112232 ، DK117147 ، DK112217 ، EY032442 ، و DK20593 (مركز فاندربيلت لأبحاث وتدريب مرض السكري) ، صندوق ليونا إم وهاري بي هيلمسلي الخيري ، JDRF ، وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية (BX000666) ، NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007347) ، F30DK134041 ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Environmental chamber | okolab | IX83 | |
Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
Peristaltic pump | Instech | P720 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved