نظام الجزر الزائفة البشرية للتقييم المتزامن لديناميات الاستشعار الحيوي الفلوري وملامح إفراز الهرمونات

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للاكتساب المتزامن والتسجيل المشترك لأحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الأنسولين والجلوكاجون بواسطة الجزر الكاذبة البشرية الأولية باستخدام توصيل الفيروس الغدي لمستشعر حيوي دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وكاشف فرق cAMP في الموقع (cADDis) ، ونظام microperifusion.

Abstract

جزر البنكرياس في لانجرهانز ، وهي مجموعات 3D صغيرة من الغدد الصماء المتخصصة والخلايا الداعمة التي تتخللها البنكرياس ، لها دور مركزي في السيطرة على توازن الجلوكوز من خلال إفراز الأنسولين بواسطة خلايا بيتا ، مما يخفض نسبة الجلوكوز في الدم ، والجلوكاجون بواسطة خلايا ألفا ، مما يرفع نسبة الجلوكوز في الدم. تعد مسارات الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتوسطها cAMP ، أساسية لتنظيم إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا. هيكل جزيرة 3D ، في حين أنه ضروري لوظيفة الجزيرة المنسقة ، يقدم تحديات تجريبية للدراسات الميكانيكية لمسارات الإشارات داخل الخلايا في خلايا الجزيرة البشرية الأولية. للتغلب على هذه التحديات والقيود ، يصف هذا البروتوكول تصويرا متكاملا للخلايا الحية ومنصة الموائع الدقيقة باستخدام الجزر الكاذبة البشرية الأولية المتولدة من متبرعين غير مصابين بداء السكري تشبه الجزر الأصلية في مورفولوجيتها وتكوينها ووظيفتها. يتم التحكم في حجم هذه الجزر الكاذبة من خلال عملية التشتت وإعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية الأولية. في الحالة المشتتة ، يمكن التلاعب بالتعبير الجيني لخلية الجزيرة. على سبيل المثال ، يمكن إدخال أجهزة الاستشعار الحيوية مثل المستشعر الحيوي cAMP المشفر وراثيا ، cADDis. بمجرد تشكيلها ، تسمح الجزر الكاذبة التي تعبر عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر ومنصة microperifusion ، بالتقييم المتزامن لديناميكيات المستشعر الحيوي الفلوري وملامح إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا لتوفير مزيد من التبصر في العمليات الخلوية والوظيفة.

Introduction

جزر لانجرهانز أعضاء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء البنكرياس، ووظيفتها حاسمة للحفاظ على توازن الجلوكوز. يفرز الأنسولين من خلايا بيتا بعد استقلاب الجلوكوز ، وزيادة نسبة ATP / ADP ، وإغلاق قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، وإزالة استقطاب غشاء البلازما ، وتدفق الكالسيوم خارج الخلية¹. إفراز الجلوكاجون من خلايا ألفا أقل فهما ، ولكن تم افتراض أن المسارات داخل الخلايا و paracrine تساهم في زيادة عدد الخلايا الحبيبية^{للجلوكاجون 2،3،4}. يرتبط كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 بخلل الخلايا الجزيرية^5،6،7. لذلك ، فإن توضيح مسارات الإشارات داخل الخلايا التي تتوسط إفراز هرمون الجزيرة أمر ضروري لفهم الآليات الفسيولوجية والمرضية في جزر البنكرياس.

تمثل العمارة الكروية للجزر بعض العقبات أمام التجريب. وتشمل هذه التحديات اختلاف حجم الجزيرة وطبيعة 3D للجزر ، مما يقلل من نقل الفيروس داخل قلب الجزيرة ^8,9. للتغلب على هذه التحديات ، تم تطوير نظام الجزر الزائفة ، حيث يتم تشتيت الجزر البشرية الأولية في خلايا مفردة ، وتحويلها بشكل غدي مع تركيبات ترميز الأهداف ذات الأهمية ، وإعادة تجميعها لتشكيل هياكل تشبه الجزر يتم التحكم فيها بالحجم تسمى الجزر الزائفة⁷. بالمقارنة مع الجزر الأصلية من نفس المتبرع التي تم استزراعها بالتوازي ، فإن هذه الجزر الزائفة متشابهة في التشكل وتكوين خلايا الغدد الصماء وإفراز الهرمونات⁷. تسمح هذه الطريقة بالتعبير عن التركيبات في جميع أنحاء الجزيرة الكاذبة ، مما يعني أنها تتغلب على حاجز سابق أمام التلاعب الجيني الموحد للجزر البشرية الأولية⁷،^8،9.

في هذا البروتوكول ، تم دمج نظام الجزر الكاذبة مع جهاز الموائع الدقيقة للتعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية في خلايا الجزيرة البشرية الأولية والحصول على دقة زمنية لإفراز هرمون الجزيرة الكاذبة أثناء الانتشار الديناميكي¹⁰،^11،12. يتم وضع الجزر الكاذبة في رقاقة دقيقة وتعريضها لتدفق مستمر من الإفرازات المختلفة عبر مضخة تمعجية¹². تحتوي الرقاقة الدقيقة على قاع زجاجي شفاف ويتم تركيبها على مجهر متحد البؤر لتسجيل ديناميكيات الإشارات داخل الخلايا عبر التغيرات في شدة مضان المستشعر الحيوي. تتم مزامنة تصوير المستشعر الحيوي مع مجموعة النفايات السائلة الدقيقة للتحليل اللاحق لإفراز الأنسولين والجلوكاجون⁷. بالمقارنة مع macroperifusion ، يسمح نهج microperifusion هذا باستخدام عدد أقل من الجزر الكاذبة بسبب الحجم الأصغر لجهاز الموائع الدقيقة مقارنة بغرفة macroperifusion⁷.

لتسخير فائدة هذا النظام ، تم التعبير عن كاشف فرق الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري (cAMP) في المستشعر الحيوي في الموقع (cADDis) في الجزر الكاذبة البشرية لتقييم ديناميكيات cAMP وإفراز الهرمونات . يتكون المستشعر الحيوي cADDis من بروتين فلوري أخضر دائري (cpGFP) يتم وضعه في منطقة المفصلة لبروتين التبادل الذي يتم تنشيطه بواسطة cAMP 2 (EPAC2) ، ويربط مناطقه التنظيمية والحفازة. يؤدي ارتباط cAMP بالمنطقة التنظيمية ل EPAC2 إلى حدوث تغيير توافقي في منطقة المفصلة يزيد من التألق من cpGFP¹³. تستنبط الرسل داخل الخلايا مثل cAMP إفراز الأنسولين والجلوكاجون بعد التنشيط الأولي للمستقبلات المقترنة بالبروتين G¹⁴. يساعد تصوير الخلايا الحية إلى جانب microperifusion على ربط ديناميكيات cAMP داخل الخلايا بإفراز هرمون الجزيرة. على وجه التحديد ، في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء الجزر الكاذبة المعبرة عن cADDis لمراقبة استجابات cAMP في خلايا ألفا وبيتا للمحفزات المختلفة: انخفاض الجلوكوز (2 mM الجلوكوز. G 2) ، ارتفاع الجلوكوز بالإضافة إلى إيزوبوتيل ميثيل زانثين (IBMX ؛ 20 مللي متر جلوكوز + 100 ميكرومتر IBMX ؛ G 20 + IBMX) ، وانخفاض الجلوكوز بالإضافة إلى الأدرينالين (Epi ؛ 2 mM الجلوكوز + 1 μM Epi ؛ G 2 + Epi). يسمح سير عمل العلاج هذا بتقييم ديناميكيات cAMP داخل الخلايا مباشرة عبر 1) تثبيط الفوسفوديستراز بوساطة IBMX ، والذي يعزز مستويات cAMP داخل الخلايا عن طريق منع تدهوره ، و 2) الأدرينالين ، وهو محفز معروف يعتمد على cAMP لإفراز الجلوكاجون في خلايا ألفا بوساطة تنشيط مستقبلات β الأدرينالية. فيما يلي تفاصيل خطوات إعداد جهاز microperifusion لتجارب تصوير الخلايا الحية ، وتحميل الجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة ، والتصوير المتزامن للخلايا الحية و microperifusion ، وتحليل آثار المستشعر الحيوي وإفراز الهرمونات بواسطة فحوصات الهرمونات القائمة على الصفيحة الدقيقة.

Protocol

تم الحصول على الجزر البشرية (N = 4 مستحضرات) من خلال شراكات مع برنامج توزيع الجزر المتكامل ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري ، ومختبرات Prodo ، Inc. ، و Imagine Pharma. لا يعتبر مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فاندربيلت عينات البنكرياس البشرية غير المحددة كأبحاث بشرية. لن يكون هذا العمل ممكنا بدون المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم ومنظمات شراء الأعضاء. انظر الجدول 1 للاطلاع على المعلومات الديمغرافية للمانحين. تم عزل الجزر البشرية من المتبرعين بالبنكرياس غير المصابين بداء السكري بأقل من 15 ساعة من وقت نقص التروية الباردة.

1. تشكيل جزيرة زائفة (مفصلة في Walker et al.⁷)

1. احصل على الجزر البشرية الأولية واخترها يدويا باستخدام ماصة P200 ومجهر منضدة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لعدم تلويث طرف الماصة على أي أسطح خارج وسط استزراع الجزيرة (10٪ FBS ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 2 مللي متر L-glutamine في CMRL 1066).
2. انقل الجزر الأولية إلى أنبوب سعة 15 مل ، وقم بإجراء جميع خطوات تكوين الجزر الزائفة التالية تحت غطاء زراعة الأنسجة لمنع التلوث. افصل الجزر الأولية ببطء لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام ماصة P1000 في 0.025٪ تربسين. سيصبح الحل معتما عندما تبدأ الجزر في الانهيار.
   1. بالنسبة لهذه الدراسات ، فإن 200-300 جزيرة أولية منتقاة يدويا بأقطار تبلغ حوالي 200 ميكرومتر منتشرة في 500 ميكرولتر من 0.025٪ من التربسين تنتج صفيحة إلى صفيحتين من 96 بئرا من الجزر الزائفة. قد يختلف العدد الدقيق اعتمادا على متوسط حجم الجزيرة وصلاحيتها. بالنسبة للجزر >500 جزيرة أولية، قم بزيادة حجم 0.025٪ من التربسين المستخدم بنسبة 1: 1 (على سبيل المثال، 600 ميكرولتر من 0.025٪ تربسين ل 600 جزيرة منتقاة يدويا).
3. قم بإخماد التشتت عن طريق إضافة حجم من وسائط Vanderbilt Pseudoislet (VPM) يعادل حجم التربسين المستخدم. ثم اغسل مرتين ب 1 مل من VPM. بالنسبة للغسيل ، قم بطرد مركزي للخلايا المشتتة عند 485 × جم لمدة 2-3 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة. أعد تعليق الخلايا في وحدة تخزين محددة من VPM (عادة 1 مل) للعد.
   ملاحظة: تم تفصيل جيل الجزر الزائفة وتكوين VPM في منشور سابق⁷. باختصار ، يحتوي VPM على كميات متساوية من وسائط CMRL المخصبة (20٪ FBS ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 1 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 2 مللي مول جلوتاماكس ، 2 مللي مول HEPES في CMRL 1066) و iEC-media (VEGF Medium Complete Kit ناقص FBS + 1 زجاجة من مكمل الخلايا البطانية المتوسط). يتم تضمين مخطط موجز لتوليد الجزر الزائفة في الشكل 1 أ.
4. حدد عدد الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد خلية آلي من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من Trypan Blue مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. امزج تعليق الخلية جيدا لضمان عدد الخلايا بدقة.
5. احسب حجم تعليق الخلية والفيروسات و VPM المطلوب للعدد المطلوب من الجزر الزائفة. قم بتأسيس جميع الحسابات على عدد الخلايا الحية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4.
   1. بالنسبة لهذه الدراسات ، تم تحويل الخلايا الجزيرية البشرية المشتتة عند MOI 500 (N = 1) أو 1000 (N = 2) مع Ad-CMV-cADDis بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. تنتج صفيحة واحدة من الجزر الكاذبة المحولة (2000 خلية / جزيرة زائفة) ثلاث نسخ تقنية لكل متبرع (32 جزيرة كاذبة / تجربة). تم الحصول على الفيروس الغدي تجاريا في هذا العمل.
6. اجمع بين الكميات المحسوبة من تعليق الخلية والفيروسات و VPM في أنبوب سعة 1.5 مل. امزج المحتويات برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
7. أثناء النقل ، احتضان الأنابيب بأغطية مفتوحة ، وقم بتغطيتها بطبق بتري معقم لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂/95٪ هواء.
8. أضف 500 ميكرولتر من VPM إلى كل أنبوب ، واغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لها عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. أكمل غسلتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. نضح من طاف، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من VPM.
9. احسب إجمالي حجم بذر الخلية (200 ميكرولتر / جزيرة كاذبة). أضف VPM (حجم بذر الخلية المحسوب ناقص 2 مل) إلى أنبوب مخروطي الحجم مناسب. أضف معلق الخلية المستحثة من الخطوة 1.7 إلى الأنبوب المخروطي. حافظ على الأنبوب المخروطي مغلقا قليلا ولكن ليس مغلقا بإحكام للسماح بتبادل الهواء للخلايا.
10. اشطف الأنبوب سعة 1.5 مل (من الخطوة 1.7) ب 1 مل من VPM ، وانقل المحتويات إلى الأنبوب المخروطي ، وعند هذه النقطة يجب أن يحتوي الأنبوب المخروطي على إجمالي حجم بذر الخلية.
11. امزج محتويات الأنبوب المخروطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية آلية ، ثم انقل المحتويات إلى خزان كاشف معقم. إذا كان الخزان لا يحتوي على حجم بذر الخلية بالكامل ، فقم بإجراء عمليات نقل تسلسلية ، وتأكد من خلط التعليق جيدا في كل خطوة.
12. باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات ، قم بسحب تعليق الخلية في خزان الكاشف لأعلى ولأسفل 3-4 مرات لضمان التجانس ، ثم قم بسحب 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من ألواح microwell.
13. احتضان الجزر الكاذبة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂/95٪ هواء لمدة 6 أيام دون تغييرات متوسطة. بحلول اليوم 6 ، يجب أن تكون الجزر الكاذبة مكتملة التكوين وجاهزة للتجارب (الشكل 1B-D).

2. التحضير لتصوير الخلايا الحية و microperifusion (1 يوم قبل التجربة)

ملاحظة: تتوفر معلومات عن تحضير وسط microperifusion من خلال مورد protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. احصد الجزر الكاذبة باستخدام ماصة متعددة القنوات عن طريق نقلها من طبق 96 بئرا إلى طبق بتري معقم. بعد ذلك ، اختر الجزر الكاذبة يدويا ، وانقلها إلى طبق بتري معقم آخر يحتوي على VPM طازج. اسمح للجزر الكاذبة بالاحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂/95٪ هواء طوال الليل.
2. تحضير 1 لتر من DMEM عن طريق إضافة 1 غرام من BSA (درجة المقايسة المناعية الإشعاعية) ، 0.11 غرام من بيروفات الصوديوم ، 0.58 غرام من L- الجلوتامين ، 3.2 غرام من بيكربونات الصوديوم ، 1.11 غرام من HEPES ، وزجاجة واحدة من DMEM إلى 1 لتر من الماء فائق النقاء. قم بإعداد محلول مخزون الجلوكوز 1 متر في DMEM. احتفظ بكلا المحلولين عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
3. تحقق من تدفق نظام microperifusion في اليوم السابق للتجربة. قم بتوصيل كل الأنبوب بحامل رقاقة يحتوي على شريحة فارغة ، كما هو موضح في الشكل 2A-B. استخدم المياه فائقة النقاء كنفايات سائلة لتأكيد معدل تدفق يبلغ 100 ميكرولتر / دقيقة في مجمع الكسر.

3. إضافة الأسرار إلى DMEM (يوم التجربة)

1. أضف 0.07 مجم / مل أسكوربات إلى DMEM ، وقم بإعداد الإفرازات في DMEM + مخزن أسكوربات باستخدام مخزون جلوكوز 1 M للمخازن المؤقتة المحتوية على الجلوكوز.
   ملاحظة: يستخدم الأسكوربات لتثبيت الإبينفرين عن طريق منع أكسدته. إذا لم يتم استخدام الإبينفرين ، يمكن حذف الأسكوربات من DMEM.
2. قم بتصفية الإفرازات مرتين من خلال مرشح المسام 0.22 ميكرومتر ، باستخدام مرشح جديد في كل مرة. قم بتسخين المحاليل إلى 37 درجة مئوية ، وقم بقياس الجلوكوز عبر جهاز قياس السكر لتأكيد التركيز المطلوب.

4. إعداد جهاز microperifusion

1. قم بتسخين الغرفة البيئية لمجهر المسح بالليزر متحد البؤر إلى 37 درجة مئوية ، مما يضمن إغلاق جميع الأبواب والحفاظ على درجة حرارة ثابتة. ضع حامل الرقاقة الذي يحتوي على الرقاقة في الحجرة للإحماء. تحقق من درجة حرارة الرقاقة باستخدام مسدس الأشعة تحت الحمراء.
   ملاحظة: في هذه الحالة ، يتم ضبط الغرفة البيئية على 38.5 درجة مئوية ، مما يسمح للرقاقة بالوصول إلى 37 درجة مئوية.
2. قم بتوصيل جميع الأنابيب بحامل الرقاقة (كما هو موضح في الشكل 2A-B). خط دافق مع إفراز خط الأساس لمدة 5 دقائق. في هذه الدراسة ، تم مسح الخط بجلوكوز 2 مللي متر (G 2). قم بتغيير غشاء مصيدة الفقاعات في جهاز إزالة الفقاعات كل 8-10 تجارب.

5. تحميل الجزر الكاذبة في الرقاقة

1. قبل تحميل الرقاقة الدقيقة ، التقط صورة برايت فيلد ودارك فيلد (تكبير 10x) للجزر الزائفة التي سيتم استخدامها في التجربة للقياس الكمي اللاحق لمكافئات الجزر (IEQ).
   ملاحظة: يستخدم IEQ لتطبيع إفراز الهرمون إلى الاختلافات في عدد الجزر عبر التجارب. يمكن أيضا القيام بهذه الخطوة في اليوم السابق للتجربة.
2. نضح أي سائل إضافي من النصفين السفلي والعلوي للرقاقة. يحتوي النصف العلوي من الرقاقة على حشيات تضمن ختما مناسبا لكل بئر ، بينما يحتوي النصف السفلي من الرقاقة على الآبار مع غطاء زجاجي متصل. قبل الرطب بئر واحد في رقاقة مع 5 ميكرولتر من DMEM. تأكد من السحب حول الحواف الخارجية للبئر لتبليل الشقوق.
3. استخدم ماصة مبللة مسبقا لجمع 30-32 جزيرة زائفة بحجم 23 ميكرولتر ، وقم بتوزيع الجزر الكاذبة ببطء في وسط البئر في الجزء السفلي من الرقاقة. تحقق من طرف الماصة بحثا عن أي جزر كاذبة قد تكون متصلة.
4. استخدم طرف تحميل هلام لمناورة الجزر الكاذبة برفق في وسط البئر. هذا يضمن أن الحد الأقصى لعدد الجزر الزائفة سيتم التقاطها في مجال الرؤية.
5. التقط صورة للجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة على المجسم. سيتم استخدام هذا العدد لضبط IEQ المحسوب لأي خسارة في الجزيرة الزائفة أثناء هذه العملية.
   1. إذا لم يتم تحميل جميع الجزر الزائفة من الخطوة 5.3 في الرقاقة ، فاضبط IEQ وفقا لذلك. على سبيل المثال ، إذا تم تصور 30 جزيرة زائفة الآن ولكن تم تصور 32 في الخطوة 5.1 ، فاحسب IEQ على الصور من الخطوة 5.1 ثم اضربها في 30/32.
6. ضع الجزء السفلي من الرقاقة في حامل الرقاقة. ضع الجزء العلوي من الرقاقة بعناية بحيث يكون جانب الحشية الخضراء لأسفل.
7. أثناء تثبيت الرقاقة في مكانها ، أغلق حامل الرقاقة برفق لربط الرقاقة معا. حاول ألا تضغط بشكل مفرط على الرقاقة أثناء هذه العملية ، لأن القيام بذلك سيؤدي إلى إزاحة السائل الموجود في البئر وقد يؤدي إلى فقدان الجزيرة الزائفة. تجنب إدخال فقاعات الهواء في البئر.

6. التصوير المتزامن للخلايا الحية و microperifusion

1. انقل الإفرازات والمضخة والرقاقة الدقيقة في الحامل إلى الغرفة البيئية المثبتة على المجهر متحد البؤر. قم بتوجيه أنبوب التدفق خارج الغرفة إلى مجمع الكسر.
   1. ضع المخازن المؤقتة في أنابيب مخروطية سعة 15 مل مع فتحات محفورة في أغطيةها. تمنع هذه الثقوب أنبوب التجميع من الانجراف خارج الأنبوب.
   2. عند شد الأنبوب في جهاز إزالة الفقاعات ، افصل الجوز والطويق ، ثم قم بتثبيته في جهاز إزالة الفقاعات. هذا يمنع التواء الخط.
2. اضبط جامع الكسر على الدوران كل 2 دقيقة. قم بتحميل العدد المناسب من الأنابيب في مجمع الكسور ، مع مراعاة الغسلات والكسور التجريبية. لهذه التجارب ، تم استخدام 15 أنبوب غسيل (30 دقيقة غسيل كلي) و 28 أنبوبا لجمع الكسور.
3. ابدأ تشغيل المضخة لتوصيل الوسط الأساسي (الذي يحتوي على تركيز الجلوكوز الأساسي) عند 100 ميكرولتر / دقيقة (ينتج عن جمع 2 دقيقة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة 200 ميكرولتر من النفايات السائلة لكل أنبوب كسر). تم اختيار معدل التدفق هذا للحد من الضغط الهائل على الجزر الكاذبة ومنع حركة الجزر الزائفة الكبيرة أثناء التصوير الحي.
   1. أثناء تشغيل السائل عبر الجهاز ، راقب ما يلي:
      1. راقب القطرات في نهاية صنبور جامع الكسر ، والتي تشير إلى التدفق عبر النظام.
      2. راقب الانخفاضات في التدفق من النظام ؛ إذا كان هناك <200 ميكرولتر في أنابيب التجميع ، فهذا يشير إلى أنه قد يكون هناك انسداد أو تسرب في النظام. انظر الجدول 2 للحصول على قائمة بالأسباب المحتملة لانخفاض حجم النفايات السائلة والحلول ونصائح الوقاية.
4. بمجرد وجود تدفق متوسط ثابت من أنبوب التدفق ، قم بتدوير رأس مجمع الكسر للتوزيع في الأنابيب ، وابدأ مجمع الكسر. اجمع أول 15 جزءا (30 دقيقة) كغسول للسماح للجزر الكاذبة بالتوازن. استخدم هذه الكسور ال 15 الأولى لضمان التدفق المتوسط المستمر والدقيق عبر النظام. تخلص من هذه الكسور بعد ذلك.
5. أثناء الغسيل لمدة 30 دقيقة ، قم بإعداد المجهر لتصوير الخلايا الحية وفقا لهذه المعلمات: عدسة موضوعية: U Plan Fluorite 20x مع تكبير 1x ؛ قنوات مضان: EGFP (الانبعاث = 510 نانومتر ، الطول الموجي بالليزر = 488 ، الطول الموجي للكشف = 500-600 نانومتر) ؛ السلاسل الزمنية: صورة تم الحصول عليها كل 2 ثانية لكامل التجربة (أي 56 دقيقة) ؛ سرعة أخذ العينات: 2 ميكروثانية / بكسل.
   1. حدد الجزء السفلي من الجزر الزائفة في مجال الرؤية واضبط المستوى البؤري على 15 ميكرومتر فوق هذا الموضع. هذا هو الإطار الذي سيتم استخدامه خلال تجربة التصوير.
6. بمجرد اكتمال الغسيل لمدة 30 دقيقة ، ابدأ في جمع الكسور والحصول على الصور.
   ملاحظة: يجب بذل كل الجهود لتحديد وتصحيح أي مشكلات قبل هذه الخطوة. بمجرد بدء جمع البيانات ، قد يؤثر أي توقف مؤقت في التجربة أو التعرض الزائد للإفرازات سلبا على النتائج.
7. استمر في تطويق الجزر الزائفة بوسط خط الأساس طوال مدة جمع خط الأساس الأول ، وجمع النفايات السائلة في أنابيب سعة 1.5 مل. قم بتبديل الأنبوب من المخزن المؤقت الأساسي يدويا إلى أنبوب المخزن المؤقت الجديد للتحفيز عندما يكون الوقت مناسبا للتجربة.
   1. يظهر تسلسل microperifusion القياسي في الجدول 3.
   2. بعد جمع ~ 10 كسور ، ضع جميع الكسور في ثلاجة 4 درجات مئوية حتى نهاية التجربة لمنع تدهور الهرمونات ، وخاصة الجلوكاجون.
   3. استمر في مراقبة تدفق النظام طوال التجربة عن طريق التحقق من حجم النفايات السائلة في كل أنبوب.
8. عند اكتمال التجربة ، عد إلى الوسط الأساسي ، واسمح للمضخة بالاستمرار في العمل لمدة 5 دقائق لغسل التحفيز بوسط خط الأساس (في هذه الحالة ، 2 مللي مول جلوكوز).
9. أوقف المضخة ، وافصل أنبوب حامل الرقاقة الدقيقة في أداة إزالة الفقاعات ومجمع الكسور لإزالة حامل الرقاقة الدقيقة من الغرفة البيئية. أغلق جميع الأبواب بعد إزالة الرقاقة للحفاظ على درجة الحرارة.
10. قم بتخزين perifusates في -80 درجة مئوية لتحليل الهرمونات اللاحقة.

7. استخراج الإيثانول حمض الجزر الزائفة

1. افتح حامل الرقاقة بعناية وارفع الجزء العلوي من الرقاقة. استخدم مجهر ماصة ومنضدة لالتقاط الجزر الكاذبة من البئر ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل. تأكد من جمع جميع الجزر الكاذبة باستخدام مجهر منضدة إذا لزم الأمر.
   1. التقط صورة نهائية للجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة قبل إزالتها من البئر لضبط مستخلص الجزيرة IEQ ، على غرار الخطوة 5.5.
2. اغسل مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قم بتدوير الجزر الكاذبة لمدة 1 دقيقة عند 94 × جم بين كل غسلة ، ونضح من المادة الطافية.
3. بعد إزالة الغسيل الأخير ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الحمضي (5.5 مل من 95٪ إيثانول + 50 ميكرولتر من 12 نيوتن حمض الهيدروكلوريك). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
4. في اليوم التالي ، قم بتدوير المستخلصات لمدة 10 دقائق عند 15989 × جم و 4 درجات مئوية. القسمة 45 ميكرولتر في ثلاثة أنابيب جديدة. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لتحليل محتوى الهرمونات. كبديل لتطبيع إفراز الهرمون إلى IEQ ، يمكن أيضا تطبيع إفراز الهرمون إلى محتوى هرمون الجزيرة الكاذبة المقاس من المستخلصات.

8. تجارب إضافية وتنظيف

1. كرر الخطوات من 5 إلى 7 مع المجموعات اللاحقة من الجزر الزائفة للحصول على نسخ متماثلة تقنية إضافية.
2. بعد الانتهاء من جميع تجارب microperifusion ، قم بتشغيل 10٪ من المبيض عبر الرقاقة الدقيقة والأنابيب لمدة 5 دقائق ثم الماء فائق النقاء لمدة 30 دقيقة لتعقيم الأنبوب.

9. تحليل البيانات

ملاحظة: تم إجراء تصوير الخلايا الحية باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. تم تحليل الصور باستخدام حزمة برامج التصوير المرتبطة بالمجهر. فيما يلي إرشادات عامة ولكنها قد تختلف اعتمادا على الشركة المصنعة للمجهر وبرنامج الحصول على الصور.

1. تحديد إجمالي مكافئات الجزر (IEQ) لتسوية البيانات
   1. افتح البرنامج ، وانقر فوق علامة التبويب " اكتساب" في أعلى يمين النافذة. نسخ الدفعات في جميع صور الحقول المظلمة عن طريق تحديد وظيفة حرق الدفعات في إدارة الماكرو (عرض أداة > Windows > إدارة الماكرو).
      1. لنسخ صور متعددة في وقت واحد ، انقر فوق الزر تبديل وضع الدفعات قبل النقر فوق الزر "تشغيل " داخل مدير الماكرو. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لتحديد موقع الصورة المصدر وموقع الوجهة للصور المحروقة. لنوع ملف الصورة، اختر تنسيق ملف تخيل (*.tif).
   2. لقياس IEQ ، افتح الإصدار المحروق من صورة الحقل المظلم 10x التي تم التقاطها في الخطوة 5.1. انقر فوق علامة التبويب العد والقياس في الجزء العلوي ، واختر زر عتبة HSV اليدوي على اليسار.
      1. استخدم وظيفة القطارة لإضافة / إزالة المنطقة الموجبة (باللون الأحمر) حتى يتم تمييز كل جزيرة زائفة باللون الأحمر ، دون الامتداد إلى ما بعد حدود الجزيرة الزائفة. انقر فوق العد والقياس.
   3. استخدم وظائف التقسيم التلقائي أو التقسيم اليدوي لتقسيم الجزر الزائفة التي تم ضمها معا.
      1. لتقسيم الجزر الزائفة يدويا ، اختر وظيفة التقسيم اليدوي ، وانقر بزر الماوس الأيسر لرسم خط يفصل بين الجزر الزائفة ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لإكمال السطر. للتقسيم التلقائي ، اختر وظيفة التقسيم التلقائي ، وانقر فوق الجزر الزائفة المجمعة ذات الاهتمام. قم بتأكيد التقسيم التلقائي الصحيح بعد ذلك.
   4. في الصور المجمعة، قد يتم تمييز شريط القياس ونص التكبير كموجب. احذف هذه الكائنات للحصول على عد دقيق عن طريق تمييز النص وشريط القياس باستخدام الماوس والضغط على مفتاح حذف لوحة المفاتيح.
   5. قم بتبديل الفلتر وإيقاف تشغيله للتأكد من أنه يتم عد جميع الجزر الزائفة. يمكن أيضا فتح الملف خارج البرنامج للإحالة المرجعية. عند الانتهاء ، انقر فوق تصدير إلى Excel.
   6. افتح جدول البيانات، وقم بتعديله على النحو التالي.
      1. احذف معلومات العد والمتوسط والفرز في الأسفل. قم بفرز الكائنات بناء على متوسط قطرها. أدخل عمودا بعد متوسط القطر ، وقم بتسمية العمود "عدد الجزر الزائفة".
      2. يتم تحديد عدد الجزر من خلال عدد الجزر الزائفة ذات الأقطار المتوسطة التي تقع ضمن كل مؤشر أدناه. اضرب عدد الجزر الزائفة لكل فهرس في عامل تحويل IEQ المعني ، واجمع هذه القيم لتحديد إجمالي IEQ. قم بإجراء حسابات IEQ على الصور التي تم الحصول عليها قبل كل تجربة. استخدم الفهارس التالية وعوامل تحويل IEQ:
         1-49 ميكرومتر: × 0.167
         50-100 ميكرومتر: × 0.667
         101-150 ميكرومتر: × 1.685
         151-200 ميكرومتر: × 3.500
         201-300 ميكرومتر: × 6.315
         301-350 ميكرومتر: × 10.352
      3. للحصول على جدول بيانات مثال لتحديد أعداد IEQ، راجع الملف التكميلي 1.
2. القياس الكمي لتصوير الخلايا الحية في البرامج
   1. افتح الملف المطلوب (.oir) في cellSens.
   2. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) على النحو التالي.
      1. استخدم أدوات الرسم لتعيين عائد الاستثمار (أي كل جزيرة زائفة). إذا كنت تستخدم خيار الرسم اليدوي ، فانقر بزر الماوس الأيمن لإغلاق الشكل.
      2. قم بتمييز جميع عائد الاستثمار باستخدام يد السهم واسحبه ليشمل جميع عائد الاستثمار في الصورة. مع تمييز جميع عائد الاستثمار ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد تحويل إلى عائد استثمار ديناميكي بمرور الوقت
      3. قم بتشغيل ملف XYT للتأكد من دقة عائد الاستثمار بمرور الوقت. إذا كان عائد الاستثمار غير دقيق في فترة محددة ، فقم بتصحيح حجمه / موقعه في تلك الفترة. سيقوم البرنامج بتعديل حجم / موقع عائد الاستثمار تدريجيا بمرور الوقت لمطابقة هذه التغييرات. كرر هذه الخطوات حتى يصبح عائد الاستثمار دقيقا طوال تجربة التصوير.
   3. قم بإجراء قياسات الشدة على كل عائد استثمار على النحو التالي.
      1. في شريط الأدوات ، انقر فوق قياس ملف تعريف الكثافة. تسليط الضوء على عائد الاستثمار لتحليله ؛ استخدم Shift + Click لتحديد عائد استثمار متعدد.
         ملاحظة: على الرغم من أن ملفات متعددة قد تكون مفتوحة في وقت واحد في البرنامج ، إلا أن تحليل عائد الاستثمار من ملف واحد فقط في كل مرة.
      2. لحساب ضوضاء الخلفية، حدد قيمة ثابتة لطرحها من كل قيمة شدة، أو قم بتعيين عائد استثمار واحد كخلفية. انقر فوق تنفيذ.
      3. ضمن شريط أدوات ملف تعريف الكثافة ، انقر فوق تصدير إلى Excel لتصدير البيانات.
      4. تطبيع جميع نقاط البيانات إلى متوسط الشدة المقاسة من 7-8 دقائق (أي الحد الأدنى الأخير من أول محيط متوسط خط الأساس). يتم تعريف هذه القيم الطبيعية في كل نقطة زمنية على أنها كثافة cADDis النسبية. للحصول على جدول بيانات لتحليل بيانات التصوير وتسويتها، راجع الملف التكميلي 2.
3. قياس إفراز هرمون في كل جزء واستخراج الجزيرة. في هذه التجارب ، تم قياس تركيزات الأنسولين والجلوكاجون بواسطة ELISA. تطبيع إفراز الهرمون في كل جزء إلى حجم الجزيرة الكاذبة باستخدام قياسات IEQ المحددة في الخطوة 9.1 أو عن طريق محتوى هرمون الاستخراج.

النتائج

تم إنشاء الجزر الكاذبة البشرية المعبرة عن أجهزة الاستشعار الحيوية عن طريق توصيل الفيروسات الغدية للتركيبات التي تشفر cAMP biosensor cADDis (الشكل 1 أ). يوضح الشكل 1B إعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية المتحولة بمرور الوقت ، مع ملاحظة الجزر الكاذبة كاملة التكو?...

Discussion

يسمح دمج نظام microperifusion ، والجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر بالتقييم المتزامن لأحداث الإشارات داخل الخلايا وملامح إفراز الهرمونات الديناميكية. يمكن لنظام microperifusion الديناميكي تقديم سلسلة من المحفزات المحددة جيدا إلى الجزر الكا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component