Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

Zusammenfassung

Die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse, bei denen es sich um kleine 3D-Ansammlungen spezialisierter endokriner und unterstützender Zellen handelt, die in der gesamten Bauchspeicheldrüse verstreut sind, spielen eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Glukosehomöostase durch die Sekretion von Insulin durch Betazellen, was den Blutzucker senkt, und von Glukagon durch Alphazellen, das den Blutzucker erhöht. Intrazelluläre Signalwege, einschließlich derer, die durch cAMP vermittelt werden, sind der Schlüssel für die regulierte Alpha- und Betazell-Hormonsekretion. Die 3D-Inselstruktur ist zwar essentiell für die koordinierte Inselfunktion, stellt aber experimentelle Herausforderungen für mechanistische Studien der intrazellulären Signalwege in primären menschlichen Inselzellen dar. Um diese Herausforderungen und Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll eine integrierte Live-Cell-Imaging- und Mikrofluidik-Plattform, die primäre menschliche Pseudoinseln verwendet, die von Spendern ohne Diabetes erzeugt wurden und in ihrer Morphologie, Zusammensetzung und Funktion nativen Inseln ähneln. Diese Pseudoinseln werden durch den Dispersions- und Reaggregationsprozess primärer humaner Inselzellen größengesteuert. Im dispergierten Zustand kann die Genexpression von Inselzellen manipuliert werden; So können beispielsweise Biosensoren wie der genetisch kodierte cAMP-Biosensor, cADDis, eingeführt werden. Nach ihrer Bildung ermöglichen Pseudoinseln, die einen genetisch kodierten Biosensor exprimieren, in Kombination mit konfokaler Mikroskopie und einer Mikroperifusionsplattform die synchrone Bewertung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und der sekretorischen Profile von Alpha- und Betazellhormonen, um einen besseren Einblick in zelluläre Prozesse und Funktionen zu erhalten.

Einleitung

Die Langerhans-Inseln sind Mini-Organe, die über die gesamte Bauchspeicheldrüse verstreut sind und deren Funktion für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase entscheidend ist. Insulin wird aus Betazellen nach dem Metabolismus von Glukose, einem Anstieg des ATP/ADP-Verhältnisses, dem Verschluss von ATP-empfindlichen Kaliumkanälen, der Depolarisation der Plasmamembran und dem Einstrom von extrazellulärem Kalzium¹ sezerniert. Die Glucagon-Sekretion aus Alpha-Zellen ist weniger verstanden, aber es wurde postuliert, dass intrazelluläre und parakrine Signalwege zur Exozytose des Glucagon-Granula-Granulats beitragen

Protokoll

Humane Inselzellen (N = 4 Präparate) wurden durch Partnerschaften mit dem Integrated Islet Distribution Program, dem Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. und Imagine Pharma gewonnen. Das Vanderbilt University Institutional Review Board betrachtet deidentifizierte menschliche Bauchspeicheldrüsenproben nicht als Forschung am Menschen. Diese Arbeit wäre ohne Organspender, ihre Familien und Organbeschaffungsorganisationen nicht möglich. In Tabelle 1 finden Sie demografische Informationen zu den Spendern. Menschliche Inselzellen von Pankreasspendern ohne Diabetes wurden mit einer Zeit von weniger als 15 Stunden kalter Ischämie isoliert....

Diskussion

Die Integration eines Mikroperifusionssystems, biosensorexprimierender Pseudoinseln und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie ermöglicht die synchrone Beurteilung intrazellulärer Signalereignisse und dynamischer Hormonsekretionsprofile. Das dynamische Mikroperifusionssystem kann eine Reihe von genau definierten Stimuli an die Pseudoinseln abgeben und ermöglicht die Sammlung des Abwassers, in dem die Insulin- und Glukagonkonzentrationen mit einem kommerziell erhältlichen ELISA gemessen werden können. Gleichzeitig erf.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component