Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

Zusammenfassung

Die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse, bei denen es sich um kleine 3D-Ansammlungen spezialisierter endokriner und unterstützender Zellen handelt, die in der gesamten Bauchspeicheldrüse verstreut sind, spielen eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Glukosehomöostase durch die Sekretion von Insulin durch Betazellen, was den Blutzucker senkt, und von Glukagon durch Alphazellen, das den Blutzucker erhöht. Intrazelluläre Signalwege, einschließlich derer, die durch cAMP vermittelt werden, sind der Schlüssel für die regulierte Alpha- und Betazell-Hormonsekretion. Die 3D-Inselstruktur ist zwar essentiell für die koordinierte Inselfunktion, stellt aber experimentelle Herausforderungen für mechanistische Studien der intrazellulären Signalwege in primären menschlichen Inselzellen dar. Um diese Herausforderungen und Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll eine integrierte Live-Cell-Imaging- und Mikrofluidik-Plattform, die primäre menschliche Pseudoinseln verwendet, die von Spendern ohne Diabetes erzeugt wurden und in ihrer Morphologie, Zusammensetzung und Funktion nativen Inseln ähneln. Diese Pseudoinseln werden durch den Dispersions- und Reaggregationsprozess primärer humaner Inselzellen größengesteuert. Im dispergierten Zustand kann die Genexpression von Inselzellen manipuliert werden; So können beispielsweise Biosensoren wie der genetisch kodierte cAMP-Biosensor, cADDis, eingeführt werden. Nach ihrer Bildung ermöglichen Pseudoinseln, die einen genetisch kodierten Biosensor exprimieren, in Kombination mit konfokaler Mikroskopie und einer Mikroperifusionsplattform die synchrone Bewertung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und der sekretorischen Profile von Alpha- und Betazellhormonen, um einen besseren Einblick in zelluläre Prozesse und Funktionen zu erhalten.

Einleitung

Die Langerhans-Inseln sind Mini-Organe, die über die gesamte Bauchspeicheldrüse verstreut sind und deren Funktion für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase entscheidend ist. Insulin wird aus Betazellen nach dem Metabolismus von Glukose, einem Anstieg des ATP/ADP-Verhältnisses, dem Verschluss von ATP-empfindlichen Kaliumkanälen, der Depolarisation der Plasmamembran und dem Einstrom von extrazellulärem Kalzium¹ sezerniert. Die Glucagon-Sekretion aus Alpha-Zellen ist weniger verstanden, aber es wurde postuliert, dass intrazelluläre und parakrine Signalwege zur Exozytose des Glucagon-Granula-Granulats beitragen ^2,3,4. Sowohl Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes sind mit einer Inselzelldysfunktion assoziiert ^5,6,7. Daher ist die Aufklärung der intrazellulären Signalwege, die die Hormonsekretion von Inselzellen vermitteln, für das Verständnis physiologischer und pathologischer Mechanismen in Pankreasinseln unerlässlich.

Die kugelförmige Architektur von Inselchen stellt gewisse Hindernisse für Experimente dar. Zu diesen Herausforderungen gehören die Variation der Inselgröße und die 3D-Natur der Inseln, die die virale Transduktion innerhalb des Inselkerns reduziert ^8,9. Um diese Herausforderungen zu meistern, wurde ein Pseudoinselsystem entwickelt, in dem primäre menschliche Inseln in einzelne Zellen zerstreut, adenoviral mit Konstrukten transduziert werden, die für Ziele von Interesse kodieren, und reaggregiert werden, um größenkontrollierte, inselartige Strukturen zu bilden, die als Pseudoinseln bezeichnet werden⁷. Im Vergleich zu nativen Inseln desselben Spenders, die parallel kultiviert wurden, ähneln sich diese Pseudoinseln in Morphologie, endokriner Zellzusammensetzung und Hormonsekretion⁷. Diese Methode ermöglicht die Expression von Konstrukten in der gesamten Pseudoinsel, was bedeutet, dass sie eine frühere Barriere für die einheitliche genetische Manipulation primärer menschlicher Inseln überwindet ^7,8,9.

In diesem Protokoll ist das Pseudoinselsystem mit einem mikrofluidischen Gerät integriert, um Biosensoren in primären menschlichen Inselzellen zu exprimieren und eine zeitliche Auflösung der Pseudoislet-Hormonsekretion während der dynamischen Perifusion zu erreichen^10,11,12. Die Pseudoinseln werden in einen Mikrochip gelegt und über eine Peristaltikpumpe¹² einem stetigen Strom verschiedener Sekretagogen ausgesetzt. Der Mikrochip hat einen transparenten Glasboden und ist auf einem konfokalen Mikroskop montiert, um die intrazelluläre Signaldynamik über Änderungen der Fluoreszenzintensität des Biosensors aufzuzeichnen. Die Biosensor-Bildgebung wird mit der Entnahme von Mikroperifusionsabwässern für die anschließende Analyse der Insulin- und Glukagonsekretion synchronisiert⁷. Im Vergleich zur Makroperifusion ermöglicht dieser Mikroperifusionsansatz aufgrund des geringeren Volumens der mikrofluidischen Vorrichtung im Vergleich zur Makroperifusionskammer⁷ die Verwendung von weniger Pseudoinseln.

Um den Nutzen dieses Systems zu nutzen, wurde der zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP)-Differenzdetektor (cADDis) in menschlichen Pseudoinseln exprimiert, um die cAMP-Dynamik und die Hormonsekretion zu beurteilen. Der cADDis-Biosensor besteht aus einem zirkulär permutierten grün fluoreszierenden Protein (cpGFP), das in der Scharnierregion eines durch cAMP2 (EPAC2) aktivierten Austauschproteins positioniert ist und dessen regulatorische und katalytische Regionen miteinander verbindet. Die Bindung von cAMP an die regulatorische Region von EPAC2 führt zu einer Konformationsänderung in der Scharnierregion, die die Fluoreszenz des cpGFP¹³ erhöht. Intrazelluläre Botenstoffe wie cAMP lösen nach der vorgeschalteten Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Insulin- und Glukagonsekretion aus¹⁴. Lebendzell-Bildgebung in Verbindung mit Mikroperifusion hilft, die intrazelluläre cAMP-Dynamik mit der Inselhormonsekretion zu verbinden. Konkret werden in diesem Protokoll cADDis-exprimierende Pseudoinseln erzeugt, um die cAMP-Reaktionen in Alpha- und Betazellen auf verschiedene Stimuli zu überwachen: niedrige Glukose (2 mM Glukose; G 2), hohe Glukose plus Isobutylmethylxanthin (IBMX; 20 mM Glukose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) und niedrige Glukose plus Epinephrin (Epi; 2 mM Glukose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Dieser Behandlungsablauf ermöglicht die Beurteilung der intrazellulären cAMP-Dynamik direkt über 1) IBMX-vermittelte Phosphodiesterase-Hemmung, die den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht, indem sie deren Abbau verhindert, und 2) Epinephrin, ein bekannter cAMP-abhängiger Stimulator der Alphazell-Glukagonsekretion, der durch β-adrenerge Rezeptoraktivierung vermittelt wird. Die Schritte zum Aufbau des Mikroperifusionsapparates für Lebendzell-Imaging-Experimente, das Laden der Pseudoinseln in den Mikrochip, die synchrone Lebendzell-Bildgebung und Mikroperifusion sowie die Analyse der Biosensorspuren und der Hormonsekretion durch Mikrotiterplatten-basierte Hormon-Assays werden im Folgenden beschrieben.

Protokoll

Humane Inselzellen (N = 4 Präparate) wurden durch Partnerschaften mit dem Integrated Islet Distribution Program, dem Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. und Imagine Pharma gewonnen. Das Vanderbilt University Institutional Review Board betrachtet deidentifizierte menschliche Bauchspeicheldrüsenproben nicht als Forschung am Menschen. Diese Arbeit wäre ohne Organspender, ihre Familien und Organbeschaffungsorganisationen nicht möglich. In Tabelle 1 finden Sie demografische Informationen zu den Spendern. Menschliche Inselzellen von Pankreasspendern ohne Diabetes wurden mit einer Zeit von weniger als 15 Stunden kalter Ischämie isoliert.

1. Pseudoinselbildung (detailliert in Walker et al.⁷)

1. Entnahme und handverlesene primäre menschliche Inseln mit einer P200-Pipette und einem Tischmikroskop, wobei Sie genau darauf achten sollten, dass die Pipettenspitze nicht auf Oberflächen außerhalb des Inselkulturmediums kontaminiert wird (10 % FBS, 100 μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, 2 mM L-Glutamin in CMRL 1066).
2. Übertragen Sie primäre Inselzellen in ein 15-ml-Röhrchen und führen Sie alle folgenden Schritte zur Bildung von Pseudoinseln unter einer Gewebekulturhaube durch, um eine Kontamination zu vermeiden. Die primären Inseln werden langsam 7 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer P1000-Pipette in 0,025%igem Trypsin dissoziiert. Die Lösung wird undurchsichtig, wenn die Inseln auseinanderbrechen.
   1. Für diese Studien ergeben 200-300 handverlesene primäre Inseln mit Durchmessern von etwa 200 μm, die in 500 μl 0,025%igem Trypsin dispergiert sind, ein bis zwei 96-Well-Platten mit Pseudoinseln; Die genaue Anzahl kann je nach durchschnittlicher Inselgröße und Lebensfähigkeit variieren. Für >500 primäre Inseln ist das Volumen von 0,025 % Trypsin, das in einem Verhältnis von 1:1 verwendet wird, zu vergrößern (z. B. 600 μl 0,025 % Trypsin für 600 handverlesene Inseln).
3. Löschen Sie die Dispersion durch Zugabe eines Volumens Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM), das dem Volumen des verwendeten Trypsins entspricht. Anschließend zweimal mit 1 ml VPM waschen. Für die Waschungen zentrifugieren Sie die dispergierten Zellen bei 485 x g für 2-3 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einem definierten VPM-Volumen (in der Regel 1 ml) für die Zählung.
   ANMERKUNG: Die Pseudoinselgenerierung und die VPM-Zusammensetzung sind in einer früheren Veröffentlichung⁷ detailliert beschrieben. Kurz gesagt, VPM enthält gleiche Volumina an angereicherten CMRL-Medien (20 % FBS, 100 μg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamax, 2 mM HEPES in CMRL 1066) und iEC-Medien (VEGF Medium Complete Kit minus FBS + 1 Flasche Endothelial Cells Medium Supplement). Ein zusammenfassendes Schema der Pseudoislet-Generierung ist in Abbildung 1A enthalten.
4. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler, indem Sie 10 μl Trypanblau mit 10 μl der Zellsuspension kombinieren. Mischen Sie die Zellsuspension gut, um eine genaue Zellzählung zu gewährleisten.
5. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, des Virus und des VPM, das für die gewünschte Anzahl von Pseudoinseln erforderlich ist. Alle Berechnungen basieren auf der in Schritt 1.4 ermittelten Anzahl lebender Zellen.
   1. Für diese Studien werden dispergierte humane Inselzellen mit einem MOI von 500 (N = 1) oder 1.000 (N = 2) mit Ad-CMV-cADDis in einem Gesamtvolumen von 500 μl transduziert. Eine Platte mit transduzierten Pseudoinseln (2.000 Zellen/Pseudoinsel) ergibt drei technische Replikate pro Spender (32 Pseudoinseln/Experiment). Das Adenovirus wurde in dieser Arbeit kommerziell gewonnen.
6. Kombinieren Sie die berechneten Mengen an Zellsuspension, Virus und VPM in einem 1,5-ml-Röhrchen. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie ihn auf und ab pipettieren.
7. Während der Transduktion werden die Röhrchen mit offenen Kappen inkubiert und mit einer sterilen Petrischale für 2 h in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂/95 % Luft bedeckt.
8. Geben Sie 500 μl VPM in jedes Röhrchen und waschen Sie die Zellen, indem Sie sie 3 Minuten lang bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren. Führe zwei weitere Wäschen durch, so dass du insgesamt drei Wäschen hast. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml VPM.
9. Berechnen Sie das gesamte Zellimpfvolumen (200 μl/Pseudoinsel). Geben Sie das VPM (das berechnete Zellimpfvolumen minus 2 ml) in ein entsprechend großes konisches Röhrchen. Die transduzierte Zellsuspension aus Schritt 1.7 wird in das konische Röhrchen gegeben. Halten Sie das konische Röhrchen leicht geschlossen, aber nicht fest geschlossen, um den Luftaustausch für die Zellen zu ermöglichen.
10. Spülen Sie das 1,5-ml-Röhrchen (aus Schritt 1.7) mit 1 ml VPM und füllen Sie den Inhalt in das konische Röhrchen um, wobei das konische Röhrchen das gesamte Zellaussaatvolumen enthalten sollte.
11. Mischen Sie den Inhalt des konischen Röhrchens gut, indem Sie mit einer motorisierten serologischen Pipette auf und ab pipettieren, und geben Sie den Inhalt dann in ein steriles Reagenzreservoir. Wenn das Reservoir nicht das gesamte Zellimpfvolumen fasst, führen Sie serielle Transfers durch und stellen Sie sicher, dass die Suspension bei jedem Schritt gut gemischt ist.
12. Mit einer Mehrkanal-P200-Pipette pipettieren Sie die Zellsuspension im Reagenzreservoir 3-4 Mal nach oben und unten, um die Homogenität zu gewährleisten, und pipettieren Sie dann 200 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung der Mikrotiterplatten.
13. Inkubieren Sie die Pseudoinseln in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂/95 % Luft für 6 Tage ohne Mediumwechsel. Am 6. Tag sollten die Pseudoinseln vollständig ausgebildet und bereit für Experimente sein (Abbildung 1B-D).

2. Vorbereitung auf Lebendzell-Bildgebung und Mikroperifusion (1 Tag vor dem Experiment)

HINWEIS: Informationen zur Herstellung des Mikroperifusionsmediums finden Sie in der protocols.io Ressource (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Entnehmen Sie die Pseudoinseln mit einer Mehrkanalpipette, indem Sie sie von der 96-Well-Platte in eine sterile Petrischale überführen. Pflücken Sie dann die Pseudoinseln von Hand und geben Sie sie in eine andere sterile Petrischale mit frischem VPM. Lassen Sie die Pseudoinseln in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂/95 % Luft über Nacht inkubieren.
2. Bereiten Sie 1 l DMEM vor, indem Sie 1 g BSA (Radioimmunoassay-Qualität), 0,11 g Natriumpyruvat, 0,58 g L-Glutamin, 3,2 g Natriumbicarbonat, 1,11 g HEPES und 1 Flasche DMEM zu 1 l hochreinem Wasser hinzufügen. Bereiten Sie eine 1 M Glukose-Stammlösung in DMEM vor. Beide Lösungen über Nacht bei 4 °C aufbewahren.
3. Überprüfen Sie den Durchfluss des Mikroperifusionssystems am Tag vor dem Experiment. Schließen Sie alle Schläuche an einen Chiphalter an, der einen leeren Mikrochip enthält, wie in Abbildung 2A-B dargestellt. Verwenden Sie hochreines Wasser als Abwasser, um eine Durchflussrate von 100 μl/min am Fraktionssammler zu bestätigen.

3. Hinzufügen von Sekteagogen zum DMEM (Tag des Experiments)

1. Geben Sie 0,07 mg/ml Ascorbat zum DMEM und bereiten Sie die Sekretagogen in DMEM + Ascorbatpuffer unter Verwendung eines 1 M Glukosevorrats für die glukosehaltigen Puffer vor.
   HINWEIS: Ascorbat wird verwendet, um Epinephrin zu stabilisieren, indem es seine Oxidation verhindert. Wenn Epinephrin nicht verwendet wird, kann Ascorbat aus dem DMEM weggelassen werden.
2. Filtern Sie die Sekretagogen zweimal durch einen 0,22-μm-Porenfilter, wobei jedes Mal ein frischer Filter verwendet wird. Erwärmen Sie die Lösungen auf 37 °C und messen Sie die Glukose mit einem Blutzuckermessgerät, um die gewünschte Konzentration zu bestätigen.

4. Aufbau von Mikroperifusionsgeräten

1. Erwärmen Sie die Klimakammer eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops auf 37 °C und stellen Sie sicher, dass alle Türen geschlossen sind und die Kammer eine stabile Temperatur beibehält. Legen Sie den Chiphalter mit dem Mikrochip zum Aufwärmen in die Kammer. Überprüfen Sie die Chiptemperatur mit einer Infrarotpistole.
   HINWEIS: In diesem Fall ist die Klimakammer auf 38,5 °C eingestellt, wodurch der Chip 37 °C erreichen kann.
2. Schließen Sie alle Schläuche an den Chiphalter an (wie in Abbildung 2A-B dargestellt). Spülen Sie die Leitung mit dem Basissekretagogum für 5 Minuten. In dieser Studie wurde die Leitung mit 2 mM Glukose (G 2) gespült. Wechseln Sie die Blasenfallenmembran des De-Bubblers alle 8-10 Experimente.

5. Einlegen der Pseudoinseln in den Mikrochip

1. Bevor Sie den Mikrochip laden, machen Sie ein Hellfeld- und Dunkelfeldbild (10-fache Vergrößerung) der Pseudoinseln, die im Experiment für die anschließende Quantifizierung der Inseläquivalente (IEQ) verwendet werden.
   HINWEIS: Der IEQ wird verwendet, um die Hormonsekretion auf Schwankungen der Inselzahl in den Experimenten zu normalisieren. Dieser Schritt kann auch am Tag vor dem Experiment durchgeführt werden.
2. Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der unteren und oberen Hälfte des Mikrochips ab. Die obere Hälfte des Mikrochips enthält Dichtungen, die eine ausreichende Abdichtung jedes Wells gewährleisten, während die untere Hälfte des Mikrochips die Wells mit einem Deckglas aus Glas enthält. Befeuchten Sie eine Vertiefung im Mikrochip mit 5 μl DMEM. Achten Sie darauf, an den äußeren Rändern der Vertiefung zu pipettieren, um die Spalten zu befeuchten.
3. Verwenden Sie eine vorfeuchte Pipette, um 30-32 Pseudoinseln in einem Volumen von 23 μl zu sammeln, und geben Sie die Pseudoinseln langsam in die Mitte der Vertiefung im unteren Teil des Mikrochips. Überprüfen Sie die Spitze der Pipette auf Pseudoinseln, die möglicherweise angebracht wurden.
4. Verwenden Sie eine Gelspitze, um die Pseudoinseln vorsichtig in die Mitte des Wells zu manövrieren. Dadurch wird sichergestellt, dass die maximale Anzahl von Pseudoinseln in einem Sichtfeld erfasst wird.
5. Nehmen Sie ein Bild der Pseudoinseln im Mikrochip auf dem Stereoskop auf. Diese Anzahl wird verwendet, um den berechneten IEQ für Pseudoinselverluste während dieses Prozesses anzupassen.
   1. Wenn nicht alle Pseudoinseln aus Schritt 5.3 in den Mikrochip geladen sind, passen Sie die IEQ entsprechend an. Wenn z. B. jetzt 30 Pseudoinseln visualisiert werden, aber 32 in Schritt 5.1 visualisiert wurden, berechnen Sie die IEQ auf den Bildern aus Schritt 5.1 und multiplizieren Sie dann mit 30/32.
6. Setzen Sie die Unterseite des Mikrochips in den Mikrochiphalter ein. Legen Sie die Oberseite des Mikrochips vorsichtig mit der grünen Dichtungsseite nach unten auf.
7. Halten Sie den Mikrochip fest und schließen Sie den Mikrochiphalter vorsichtig, um den Mikrochip zusammenzuklemmen. Versuchen Sie, während dieses Vorgangs keinen übermäßigen Druck auf den Mikrochip auszuüben, da dies die in der Vertiefung enthaltene Flüssigkeit verdrängt und zu einem Verlust von Pseudoinseln führen kann. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen in die Vertiefung.

6. Synchrone Lebendzell-Bildgebung und Mikroperifusion

1. Übertragen Sie die Sekretagogen, die Pumpe und den Mikrochip in der Halterung in die Klimakammer, die am konfokalen Mikroskop angebracht ist. Leiten Sie den Effluxschlauch aus der Kammer zum Fraktionssammler.
   1. Legen Sie die Puffer in konische 15-ml-Röhrchen mit Öffnungen, in deren Kappen Öffnungen gebohrt sind. Diese Löcher verhindern, dass der Sammelschlauch aus dem Rohr driftet.
   2. Wenn Sie den Schlauch in den De-Bubbler einschrauben, trennen Sie die Mutter und die Aderendhülse und schrauben Sie sie dann in den De-Bubbler. Dadurch wird das Verdrehen der Leine verhindert.
2. Stellen Sie den Bruchkollektor so ein, dass er sich alle 2 Minuten dreht. Laden Sie die entsprechende Anzahl von Röhrchen in den Fraktionssammler unter Berücksichtigung der Wasch- und Versuchsfraktionen. Für diese Versuche wurden 15 Waschröhrchen (30 min Gesamtwaschzeit) und 28 Röhrchen für die Fraktionssammlung verwendet.
3. Starten Sie die Pumpe, um das Basismedium (mit der Ausgangsglukosekonzentration) mit 100 μl/min zu fördern (eine 2-minütige Entnahme bei einer Durchflussrate von 100 μl/min führt zu 200 μl Abwasser pro Fraktionsröhrchen). Diese Flussrate wurde gewählt, um die schiere Belastung der Pseudoinseln zu begrenzen und signifikante Bewegungen der Pseudoinseln während der Live-Bildgebung zu verhindern.
   1. Während die Flüssigkeit durch das Gerät fließt, achten Sie auf Folgendes:
      1. Achten Sie auf Tröpfchen am Ende des Auslaufs des Fraktionssammlers, die den Durchfluss durch das System anzeigen.
      2. Achten Sie auf eine Abnahme des Ausflusses aus dem System. Wenn sich <200 μl in den Sammelröhrchen befinden, deutet dies darauf hin, dass möglicherweise eine Verstopfung oder ein Leck im System vorliegt. In Tabelle 2 finden Sie eine Liste der möglichen Ursachen für ein verringertes Abwasservolumen, Lösungen und Präventionstipps.
4. Sobald ein gleichmäßiger Mediumfluss aus dem Effluxschlauch vorhanden ist, drehen Sie den Fraktionssammlerkopf, um in die Röhrchen zu dosieren, und starten Sie den Fraktionssammler. Sammeln Sie die ersten 15 Fraktionen (30 min) als Wäsche, damit sich die Pseudoinseln ausgleichen können. Verwenden Sie diese ersten 15 Fraktionen, um einen kontinuierlichen und genauen Medienfluss durch das System zu gewährleisten. Verwerfen Sie diese Brüche anschließend.
5. Richten Sie das Mikroskop während des 30-minütigen Waschens für die Bildgebung lebender Zellen nach diesen Parametern ein: Objektivlinse: U Plan Fluorite 20x mit 1-fachem Zoom; Fluoreszenzkanäle: EGFP (Emission = 510 nm, Laserwellenlänge = 488, Detektionswellenlänge = 500-600 nm); Zeitreihe: Bild, das alle 2 s für die gesamte Dauer des Experiments (d. h. 56 Minuten) aufgenommen wurde; Abtastgeschwindigkeit: 2 μs/Pixel.
   1. Identifizieren Sie die Unterseite der Pseudoinseln im Sichtfeld und stellen Sie die Brennebene auf 15 μm über dieser Position ein. Dies ist der Rahmen, der während des gesamten Bildgebungsexperiments verwendet wird.
6. Sobald die 30-minütige Wäsche abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Fraktionssammlung und der Bildaufnahme.
   HINWEIS: Vor diesem Schritt sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um Probleme zu identifizieren und zu beheben. Sobald die Datenerfassung beginnt, können Pausen im Experiment oder eine übermäßige Exposition gegenüber Sekretagogen die Ergebnisse negativ beeinflussen.
7. Fahren Sie mit der Perifation der Pseudoinseln mit Baseline-Medium für die Dauer der ersten Baseline-Entnahme fort und sammeln Sie das Abwasser in 1,5-ml-Röhrchen. Wechseln Sie den Schlauch von Hand vom Basislinienpuffer auf den neuen Stimuluspufferschlauch, wenn die Zeit für das Experiment geeignet ist.
   1. Eine Standard-Mikroperifusionssequenz ist in Tabelle 3 dargestellt.
   2. Nachdem Sie ~10 Fraktionen gesammelt haben, stellen Sie alle Fraktionen bis zum Ende des Experiments in einen 4 °C heißen Kühlschrank, um den Abbau der Hormone, insbesondere von Glukagon, zu verhindern.
   3. Überwachen Sie den Systemdurchfluss während des gesamten Experiments, indem Sie das Abwasservolumen in jedem Rohr überprüfen.
8. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, wechseln Sie zurück zum Ausgangsmedium und lassen Sie die Pumpe 5 Minuten lang weiterlaufen, um den Stimulus mit dem Basismedium (in diesem Fall 2 mM Glukose) auszuwaschen.
9. Stoppen Sie die Pumpe und trennen Sie den Schlauch des Mikrochiphalters am Entsprudler und am Fraktionssammler, um den Mikrochiphalter aus der Klimakammer zu entfernen. Schließen Sie nach dem Entfernen des Mikrochips alle Türen, um die Temperatur zu halten.
10. Lagern Sie die Perifusate bei −80 °C für die anschließende Hormonanalyse.

7. Pseudoinsel-Säure-Ethanol-Extraktion

1. Öffnen Sie vorsichtig den Mikrochiphalter und heben Sie die Oberseite des Mikrochips ab. Verwenden Sie eine Pipette und ein Tischmikroskop, um Pseudoinseln aus dem Well zu entnehmen und in ein 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass alle Pseudoinseln bei Bedarf mit einem Tischmikroskop entnommen werden.
   1. Nehmen Sie ein letztes Bild der Pseudoinseln im Mikrochip auf, bevor Sie sie aus dem Well entfernen, um die IEQ des Inselextrakts anzupassen, ähnlich wie in Schritt 5.5.
2. Zweimal mit 500 μl PBS waschen. Schleudern Sie die Pseudoinseln zwischen den einzelnen Wäschen 1 Minute lang bei 94 x g ab und saugen Sie den Überstand ab.
3. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche 200 μl saures Ethanol (5,5 ml 95%iges Ethanol + 50 μl 12 N HCl) hinzufügen. Über Nacht bei 4 °C lagern.
4. Am nächsten Tag werden die Extrakte 10 Minuten lang bei 15.989 x g und 4 °C heruntergeschleudert. Aliquot 45 μL in drei neue Röhrchen. Zur Analyse des Hormongehalts bei −80 °C lagern. Als Alternative zur Normalisierung der Hormonsekretion auf die IEQ kann die Hormonsekretion auch auf den Pseudoinselhormongehalt normalisiert werden, der aus den Extrakten gemessen wird.

8. Zusätzliche Experimente und Aufräumarbeiten

1. Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 mit nachfolgenden Gruppen von Pseudoinseln, um zusätzliche technische Replikate zu erhalten.
2. Nachdem Sie alle Mikroperifusionsexperimente abgeschlossen haben, lassen Sie 5 Minuten lang 10%iges Bleichmittel durch den Mikrochip und die Schläuche laufen und dann 30 Minuten lang ultrareines Wasser, um die Schläuche zu desinfizieren.

9. Datenanalyse

HINWEIS: Die Bildgebung lebender Zellen wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. Die Bilder wurden mit der mikroskopischen Bildgebungssoftware analysiert. Im Folgenden finden Sie allgemeine Richtlinien, die jedoch je nach Hersteller des Mikroskops und der Bilderfassungssoftware unterschiedlich sein können.

1. Ermitteln der Gesamtzahl der Inseläquivalente (IEQ) für die Datennormalisierung
   1. Öffnen Sie das Softwareprogramm und klicken Sie oben rechts im Fenster auf die Registerkarte Erfassung . Brennen Sie alle Dunkelfeldbilder im Stapel, indem Sie im Makro-Manager die Funktion "Stapel-Einbrennen " auswählen (> Toolfenster > Makro-Manager anzeigen).
      1. Um mehrere Bilder auf einmal zu brennen, klicken Sie auf die Schaltfläche Batch-Modus umschalten, bevor Sie im Makro-Manager auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Speicherort des Quellbilds und den Zielspeicherort für die gebrannten Bilder auszuwählen. Wählen Sie als Bilddateityp Tagged Imagine-Dateiformat (*.tif) aus.
   2. Öffnen Sie für die IEQ-Messung die gebrannte Version des 10-fachen Dunkelfeldbildes, das in Schritt 5.1 aufgenommen wurde. Klicken Sie oben auf die Registerkarte " Zählen und Messen" und wählen Sie links die Schaltfläche "Manueller HSV-Schwellenwert ".
      1. Verwenden Sie die Pipettenfunktion, um den positiven Bereich (rot) hinzuzufügen/zu entfernen, bis jedes Pseudoislet rot hervorgehoben ist, ohne über den Pseudoislet-Rand hinauszugehen. Klicken Sie auf Zählen und Messen.
   3. Verwenden Sie die Funktionen zum automatischen Teilen oder zum manuellen Teilen, um die miteinander verbundenen Pseudoinseln aufzuteilen.
      1. Um die Pseudoinseln manuell zu teilen, wählen Sie die manuelle Teilungsfunktion, klicken Sie mit der linken Maustaste, um eine Linie zu zeichnen, die die Pseudoinseln trennt, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um die Linie zu vervollständigen. Um automatisch zu teilen, wählen Sie die Funktion zum automatischen Teilen und klicken Sie auf die gruppierten Pseudoinseln, die Sie interessieren. Bestätigen Sie anschließend die korrekte automatische Aufteilung.
   4. Bei im Stapel gebrannten Bildern können die Maßstabsleiste und der Vergrößerungstext als positiv markiert werden. Löschen Sie diese Objekte, um eine genaue Zählung zu erhalten, indem Sie den Text und die Maßstabsleiste mit der Maus markieren und die Entf-Tastatur drücken.
   5. Schalten Sie den Filter ein und aus, um zu bestätigen, dass alle Pseudoinseln gezählt werden. Die Datei kann auch außerhalb des Programms geöffnet werden, um Querverweise zu erstellen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Nach Excel exportieren.
   6. Öffnen Sie die Tabelle, und ändern Sie sie wie folgt.
      1. Löschen Sie die Zähl-, Mittelwert- und Sortierinformationen am unteren Rand. Sortieren Sie die Objekte nach ihrem mittleren Durchmesser. Fügen Sie nach dem mittleren Durchmesser eine Spalte ein, und nennen Sie die Spalte "Anzahl der Pseudoinseln".
      2. Die Anzahl der Inseln wird durch die Anzahl der Pseudoinseln mit mittleren Durchmessern bestimmt, die in jeden Index darunter fallen. Multiplizieren Sie die Anzahl der Pseudoinseln pro Index mit dem jeweiligen IEQ-Umrechnungsfaktor, und addieren Sie diese Werte, um die gesamte IEQ zu ermitteln. Führen Sie die IEQ-Berechnungen für die Bilder durch, die vor jedem Experiment aufgenommen wurden. Verwenden Sie die folgenden Indizes und IEQ-Umrechnungsfaktoren:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1,685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6,315
         301-350 μm: × 10,352
      3. Eine Beispieltabelle zum Ermitteln der IEQ-Anzahl finden Sie unter Ergänzende Datei 1.
2. Quantifizierung der Lebendzell-Bildgebung in Software
   1. Öffnen Sie die gewünschte Datei (.oir) in cellSens.
   2. Legen Sie die Regions of Interest (ROIs) wie folgt fest.
      1. Verwenden Sie die Zeichenwerkzeuge, um die ROIs (d. h. jede Pseudoinsel) festzulegen. Wenn Sie die Freihandzeichenoption verwenden, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Form zu schließen.
      2. Markieren Sie alle ROIs, indem Sie die Pfeilhand verwenden und ziehen, um alle ROIs im Bild einzuschließen. Wenn alle ROIs markiert sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie In dynamische ROI im Laufe der Zeit konvertieren
      3. Spielen Sie die XYT-Datei ab, um zu bestätigen, dass die ROIs im Zeitverlauf korrekt sind. Wenn der ROI in einem bestimmten Zeitraum nicht korrekt ist, korrigieren Sie die Größe/Position in diesem Zeitraum. Die Software passt die Größe/Position des ROI im Laufe der Zeit schrittweise an diese Änderungen an. Wiederholen Sie diese Schritte, bis der ROI während des gesamten Bildgebungsexperiments genau ist.
   3. Führen Sie Intensitätsmessungen für jeden ROI wie folgt durch.
      1. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Intensitätsprofil messen. Heben Sie die zu analysierenden ROIs hervor; Verwenden Sie Umschalt + Klick, um mehrere ROIs auszuwählen.
         HINWEIS: Auch wenn mehrere Dateien gleichzeitig in der Software geöffnet sein können, analysieren Sie die ROIs jeweils nur aus einer Datei.
      2. Um Hintergrundgeräusche zu berücksichtigen, wählen Sie einen konstanten Wert aus, der von jedem Intensitätswert subtrahiert werden soll, oder legen Sie eine ROI als Hintergrund fest. Klicken Sie auf Ausführen.
      3. Klicken Sie in der Symbolleiste des Intensitätsprofils auf Nach Excel exportieren, um die Daten zu exportieren.
      4. Normalisieren Sie alle Datenpunkte auf den Durchschnitt der gemessenen Intensitäten von 7-8 Minuten (d. h. die letzte Minute der ersten Basislinien-Mediumperifusion). Diese normalisierten Werte zu jedem Zeitpunkt werden als relative cADDis-Intensität definiert. Ein Beispiel für eine Tabelle mit der Analyse und Normalisierung von Bilddaten finden Sie unter Zusatzdatei 2.
3. Messen Sie die Hormonsekretion in jeder Fraktion und jedem Inselextrakt. In diesen Experimenten wurden die Insulin- und Glukagonkonzentrationen mittels ELISA gemessen. Normalisieren Sie die Hormonsekretion in jeder Fraktion auf das Pseudoinselvolumen unter Verwendung der in Schritt 9.1 ermittelten IEQ-Messungen oder anhand des Extrakthormongehalts.

Ergebnisse

Biosensor-exprimierende humane Pseudoinseln wurden durch die adenovirale Verabreichung von Konstrukten erzeugt, die für die cAMP-Biosensor-cADDis kodieren (Abbildung 1A). Abbildung 1B zeigt die Reaggregation der transduzierten humanen Inselzellen im Laufe der Zeit, wobei nach 6 Tagen Kultur vollständig ausgebildete Pseudoinseln beobachtet wurden. Die Zellen begannen innerhalb von 48 Stunden eine sichtbare cADDis-Fluoreszenz zu zeigen, und am Ende der ...

Diskussion

Die Integration eines Mikroperifusionssystems, biosensorexprimierender Pseudoinseln und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie ermöglicht die synchrone Beurteilung intrazellulärer Signalereignisse und dynamischer Hormonsekretionsprofile. Das dynamische Mikroperifusionssystem kann eine Reihe von genau definierten Stimuli an die Pseudoinseln abgeben und ermöglicht die Sammlung des Abwassers, in dem die Insulin- und Glukagonkonzentrationen mit einem kommerziell erhältlichen ELISA gemessen werden können. Gleichzeitig erf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component